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UNIVERSIDAD DE JAN
Facultad de Ciencias Experimentales
DETERMINACIN DE
EDULCORANTES
ARTIFICIALES EN BEBIDAS
Julio, 2014
UNIVERSIDAD DE JAN
GRADO EN QUMICA
Trabajo Fin de Grado
DETERMINACIN DE
EDULCORANTES
ARTIFICIALES EN BEBIDAS
Abstract
I
NDICE
1. Introduccin 1
1.1. Edulcorantes 1
1.4. Legislacin 6
2. Experimental 16
2.2. Muestras 16
2.3. Procedimiento 18
3. Resultados y discusin 21
II
3.1. Optimizacin del mtodo HPLC 21
4. Conclusiones 33
REFERENCIAS 34
III
1. Introduccin
1.1. Edulcorantes
Se conoce como edulcorante a cualquier sustancia que endulza, es decir, que sirve para
dotar de sabor dulce a un alimento que carece de este. Los edulcorantes artificiales
nacen con la necesidad de encontrar un sustituto del azcar que contentan el mismo
poder endulzante y mejoren las propiedades de los productos alimenticios. Cuando
contienen este tipo de aditivo se denominan productos light o bajos en caloras.
Las finalidades que se le atribuyen a los edulcorantes es reducir las caloras que aporta
el azcar manteniendo el sabor y favorecer la prdida de peso. Esta ltima es la
principal razn del aumento de la demanda de estos productos. En personas con diabetes
o hipoglucemia reactiva es recomendable tomar este tipo de alimentos.
-1-
Se obtiene por la
Xilitol reduccin del azcar E967
xilosa.
Disacridos
Edulcorante Estructura Propiedades [1] Siglas
Se obtiene a partir de
la lactosa, gran
Lactitol E966
estabilidad y
solubilidad.
Se sintetiza por
hidrogenacin de
Maltitol maltosa, no afecta al E965
sabor de los
alimentos.
-2-
300 veces ms dulce
que el azcar, sal
Sacarina sdica, sabor amargo, E954
resistente al calor y
medios cidos.
30 veces ms dulce
Ciclamato E952
que el azcar.
10000 veces ms
dulce que el azcar,
Neotamo estable al calor y E961
eliminado
rpidamente.
-3-
2500 veces ms dulce que el azcar, el ms
Taumatina poderoso de esta clasificacin, se metaboliza, E957
estable a T y pH.
En los ltimos aos se han realizado investigaciones sobre los efectos de los
edulcorantes para comprobar si realmente benefician a las personas.
Un estudio con ratas donde se comparaba sacarosa, aspartamo y sacarina determin que
en las mismas condiciones aquellos roedores que tomaron los edulcorantes artificiales
aumentaron de peso [2].
Otros estudios relacionados con estos mismos analitos concluyeron que el aumento de
peso no estaba relacionado con la ingesta de caloras, est causado por el aumento del
apetito que causa el sabor dulce sin caloras [3, 4] lo que tambin provoca un desajuste
metablico, tomar edulcorantes activa el metabolismo igual que si se tratase del azcar
produciendo secrecin de insulina que no puede actuar sobre nada [5].
A pesar de todos los estudios se est sustituyendo el azcar por estas sustancias en
muchos productos alimentarios, la razn es que para las industrias sale mucho ms
rentable el uso de edulcorantes artificiales debido a que endulzan mucho ms con menor
cantidad y su produccin no es cara. Estos son los motivos por esto se hacen grandes
campaas publicitarias para promover el consumo de este tipo de bebidas o alimentos.
-4-
Desde que se empezaron a utilizar los edulcorantes artificiales para productos
alimenticios, se han realizado estudios para determinar los posibles efectos perjudiciales
en el organismo, adems de legislar concentraciones mximas permitidas. Algunas de
las organizaciones que se encargan de esto son la Administracin de Alimentos y
Frmacos (FDA), la Autoridad de Seguridad Alimentaria Europea (EFSA), el Comit
Cientfico de la Alimentacin Humana (CCAH) y la Organizacin Mundial de la Salud
(OMS).
A continuacin se describe la informacin sobre la toxicidad disponible para cada uno
de los edulcorantes artificiales [9].
-5-
Acesulfamo k: IDA (Ingesta Diaria Admisible) de 15 mg/kg de peso corporal, est
permitido en ms de 90 pases, entre ellos Espaa y gran parte de los pases europeos,
Estados Unidos, Australia y Japn, etc. Despus de todos los estudios realizados, no se
ha determinado que provoque algn tipo de trastorno en el organismo, en gran parte
porque se elimina rpidamente sin ser degradado.
Neotamo: Presenta estructura similar al aspartamo, la diferencia con este hace que se
reduzca la produccin de fenilalanina. Esta es la razn por la que no es necesario indicar
su contenido en las etiquetas. Estudios que se han realizado indican que no es
cancergeno.
1.4. Legislacin
La Unin Europea regula el uso de edulcorantes en alimentos para todos sus pases
miembros, indicando el contenido mximo segn el tipo de producto, as como la
pureza de estos o la cantidad mxima ingerida recomendada.
-6-
1.4.1. Legislacin Europea
Donde se enumeran los distintos edulcorantes que pueden comercializarse para ser
vendidos al consumidor o para utilizarlos en la fabricacin de productos alimenticios, y
sus condiciones de uso en los productos alimenticios. Las dosis slo se refieren a los
productos alimenticios listos para el consumo.
-7-
mencin adecuada en la que se indique qu tipo de edulcorantes contienen.
Deben incluirse menciones de advertencia en el etiquetado de los productos que
contengan aspartamo o polioles.
Regulacin del uso de aditivos, que deben cumplir una serie de normas, y su
clasificacin segn su accin.
-8-
Real Decreto 2106/1996, de 20 de septiembre, por el que se establecen las
normas de identidad y pureza de los edulcorantes utilizados en los productos
alimenticios.
Que establece criterios especficos de pureza de los edulcorantes que pueden emplearse
en los productos alimenticios.
-9-
Bebidas Ciclamato 6-200 mg/L Microextraccin/ [13]
CG
Coca-cola, zumo Sacarina 0,5-20 g/mL
de frutas, leche Aspartamo 1-40 g/mL Cromatografa
[14]
inica
Acesulfamo K 1-40 g/mL
Comida Sacarina 37,55-549,54 mg/L Espectrofotometra [15]
Fruta seca Ciclamato 505000 ng/mL HPLC-ESI MS [16]
Ciclamato 113,14-280,07 mg/L
Refrescos Sacarina 17,96-50,94 mg/L HPLC/UV [17]
Aspartamo 9,94-296,82 mg/L
Edulcorantes de
Aspartamo 20-180 ng/L HPLC [18]
mesa
Edulcorantes de Aspartamo 10-100 g/mL
mesa Acesulfamo K 40-100 g/mL FIA [19]
- 10 -
Aspartamo L.plug: 5,8-294 mg/L
S.plug:73,5-294 mg/L
L.plug: 3-201 mg/L
Comida y Ciclamato Electroforesis
S.plug:30,2-201 mg/L [26]
refrescos L.plug: 3,1-205 mg/L capilar (CE)
Sacarina
S.plug: 30,7-205 mg/L
L.plug: 2-201 mg/L
Acesulfamo K
S.plug: 20,1-201 mg/L
- 11 -
- Fase reversa: la fase slida es de slice enlazada con cadenas alqulicas (tipo
C18, C8 o C4) aunque existen alternativas a la slice. Es apolar mientras que la
fase lquida es polar por lo que se retienen los analitos no polares. Se producen
interacciones hidrofbicas por fuerzas de Van der Waals o puentes de hidrgeno
que pueden romperse con acetonitrilo o metanol.
- Fase normal: al contrario que la anterior, la fase slida es polar y la fase lquida
es apolar retenindose los analitos polares. Se producen interacciones
hidroflicas como son puentes de hidrgeno o dipolo-dipolo.
- 12 -
- Cromatografa de lquidos (HPLC) en fase reversa: tiene una fase estacionaria
apolar y una fase mvil de polaridad moderada. Eluyen primero las molculas
polares. Se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas. Tambin tiene
en cuenta la estructura. Por ejemplo, un compuesto con una cadena alqulica
larga tendr con un tiempo de retencin mayor porque aumenta la
hidrofobicidad de la molcula. Las sales inorgnicas y el pH tambin afectan la
retencin de los compuestos.
- Cromatografa de excusin molecular (SEC): separa las partculas de la muestra
en funcin de su tamao. La fase estacionaria consiste en largos polmeros
entrecruzados formando una red tridimensional porosa donde las partculas de
mayor tamao quedarn ms retenidas. Tiene baja resolucin por lo que se usa
para procesos de purificacin.
- 13 -
- En funcin de del modo de trabajo:
o Analizadores de MS sencillos.
o Analizadores masas/masas (MS/MS o en tndem).
El funcionamiento de este tipo de detector consiste en separar los iones segn su masa
mediante un impulso durante el cual se separan las partculas en funcin del tamao.
Llegando al detector las partculas de menor tamao en primer lugar. Es un sistema
rpido y sencillo.
- 14 -
Figura 3: Esquema del funcionamiento del analizadorde tiempo de vuelo (TOF)
- 15 -
2. Experimental
2.2 Muestras
- 16 -
11 Fanta naranja zero Lata 33cl Coca-ColaTM ACE-K, ASP, SUC
Schweppes limn
17 Lata 33cl SchweppesTM CYC, ACE-K, SUC
zero
Shandy de limn
28 Carrefour S.A. ACE-K, SUC
Carrefour Lata 33cl
*ASP: aspartamo, CYC: ciclamato, SAC: sacarina, ACE-K: acesulfamo-K, SUC: sucralosa.
- 17 -
2.3 Procedimiento
2. Adicin de muestra: aadir la muestra por la parte superior del cartucho controlando
el caudal para obtener una mayor eficacia. Los contaminantes de matriz pueden pasar
por la columna sin ser retenidos, y otros componentes de la matriz pueden retenerse ms
o menos fuertemente en la superficie del adsorbente.
- 18 -
Se ha procedido de la siguiente forma:
- Desgasificar las muestras.
- Acondicionar el cartucho con 2x4mL de metanol y 2x4 mL de agua.
- Cargar 4mL de muestra.
- Eluir con 2x4mL de metanol.
- Agitar con un Vortex.
- Evaporar empleando un sistema TurboVap a 10 bares de presin y un bao de
agua a 35C.
- Reconstituir con 100L de metanol y 700L de agua.
- Agitar con un Vortex
- Filtrar con una jeringa y un filtro de 0,45m de poro para volmenes inferiores a
1mL (PTFE filter, Millex FG, Millipore, Milford, MA) sobre un vial.
- Diluir 50L de la muestra con 4,95mL de agua y congelar a -20C.
- 19 -
2.3.2. Instrumental y mtodo HPLC-TOFMS
Las medidas se llevaron a cabo por HPLC (Agilent series 1290, Infinity Agilent
Technologies, Santa Clara, EEUU) que consta de un automuestreador y una bomba
binaria. Se empleo HPLC de fase reversa, es decir, la fase mvil es polar y se usar
acetonitrilo mientras que la fase estacionaria es apolar y se utiliza una columna apolar
del tipo C-18 (Agilent Zorbax XDB-C18). Lo primero en eluir sern los compuestos
polares. Para la fase mvil A se usa agua Milli-Q con 0,1% de cido frmico que carga
las molculas para facilitar y mejorar la ionizacin electrospray y como fase mvil B se
usa acetonitrilo. La columna analtica XDB-C18 utilizada es de 4,6mm x50mm y un
tamao de partcula de 1,8m. Se trabaja a una presin de 200 bares aproximadamente.
- 20 -
Tabla 6: Principales parmetros del mtodo HPLC-TOFMS
Columna C18 de 50 mm
4.6 mm y 1.8 m de tamao
Columna
de partcula (Agilent
Zorbax XDB-C18)
HPLC Flujo 0.5 mL/ min
Volumen de inyeccin 2.0 L
A: agua Milli-Q con 0,1%
Fases mviles de cido frmico
B: acetonitrilo
Voltaje de fragmentacin 170V
Voltaje del capilar 4 KV
Flujo del gas de secado (N2) 9 L min-1
Temperatura del gas de
Fuente ESI 325 C
MS secado
Presin del nebulizador 40 psi
Polaridad ESI (-)
Parmetros Skimmer 65V
MS Octopolo RF 250V
3. Resultados y discusin
Con los patrones preparados anteriormente, se prepara una mezcla de 1mL de 50 mg/L
al 100% de metanol. Se realizaron varias diluciones de 2,5 mg/L, y otra de 0,25 mg/L a
partir de esta ltima al 10% de metanol.
- 21 -
1 ensayo:
0 10 0,5
3 10 0,5
12 100 0,5
15 100 0,5
2 ensayo:
En este caso la columna XDB-C18 que se prob tena un tamao de 4,6mm x50mm y
un tamao de partcula de 1,8m. El gradiente de elucin que se utiliz duraba 12
minutos, ms el tiempo aadido para equilibrar la columna con el porcentaje de la fase
mvil inicial (Tabla 8).
- 22 -
Tabla 8: Caractersticas del 2 ensayo
Tiempo % Fase mvil B Flujo
0 10 0,5
3 10 0,5
8 60 0,5
10 100 0,5
12 100 0,5
Una vez medidas las muestras y conocidos sus tiempos de retencin, se lleva a cabo la
identificacin de los compuestos. Con este mtodo se obtienen distintos resultados
(TIC, EIC y MS) que aseguran la correcta identificacin de cada analito mediante el
tiempo de retencin y la confirmacin con el espectro de masa exacta del ion de inters
con un error que debe ser menor de 5 mg/L (de error de masa relativa). Los resultados
obtenidos cumplen esta condicin que se encuentran en la Tabla 9.
- 23 -
El error expresado en mg/L se calcula a travs de la siguiente frmula:
10
A partir del TIC, se generan los dems cromatogramas indicando la masa del ion que se
desea conocer.
En las siguientes Figuras 9,10 y 11, estn representados los cromatogramas de iones
extrados en donde se representa los valores de m/z de cada analito, la intensidad del
pico depende de la cantidad de iones y por tanto la concentracin de la especie en la
- 24 -
muestra analizada. Adems permite determinar su rea y el tiempo de retencin.
Tambin se encuentra el espectro de masas que permite confirmar el analito del que se
trata.
(a)
AcesulfamoK
Masaterica:161.9867
Masaexperimental:161.9870
Error:2.07
(b)
Figura 9: Cromatograma extrado de iones (EIC) (a) y espectro de masas (b) del
acesulfamo-K. Valor de m/z 161.9867 (concentracin 0.5 mg/L)
Ciclamato (a)
Masaterica:178.0543
Masaexperimental:178.0544
Error:0.17
(b)
Figura 10: Cromatograma extrado de iones (EIC) (a) y espectro de masas (b) del
ciclamato. Valor de m/z 178.0543 (concentracin 0.5 mg/L)
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(a)
Aspartamo
Masaterica:293,1143
Masaexperimental:293,1152
Error:3,07
(b)
Figura 11: Cromatograma extrado de iones (EIC) (a) y espectro de masas (b) del
aspartamo. Valor 293.1143 (concentracin 0.5 mg/L)
Una vez medidas las muestras (1:20) se comprob que el detector se saturaba en algunas
muestras con elevada concentracin de analitos por lo que se hizo una nueva dilucin
mayor (1:100). Para ello se toman 50 L de muestra sin diluir y 4,95mL de H2O en un
tubo de ensayo se agita, se mide 1 mL y se lleva a un nuevo vial.
Con la realizacin de la extraccin en fase slida se pasa de un volumen de 4 mL de
muestra a 0,8mL (preconcentracin 5:1). Seguida de una dilucin 1:100 a partir de
0,05mL de muestra y aadiendo agua hasta 5mL el hecho de que este 100 veces diluida
permite una calibracin sencilla y se puede aplicar una calibracin externa (con patrones
puros). De este modo se evita el uso de calibrado en matriz o de adicin de patrn.
Teniendo en cuenta la preconcentracin y la posterior dilucin hace un factor de
dilucin total de 1:20.
Para realizar este estudio se prepara una muestra sinttica con los 5 analitos estudiados
de concentracin conocida, en este caso de 1mg/L, de la que se hacen 6 replicas del
mtodo analtico con las mismas condiciones con las que se han tratado las muestras, la
concentracin se calcula a partir de una recta de calibrado por interpolacin. Para
- 26 -
construirla se preparan disoluciones de 5, 1, 0.5, 0.2, 0.1 y 0.05 mg/L. Los datos estn
reflejados en la Tabla 10.
Acesulfamo-
y=806094x+2277,8 0,9916 0,05-5 88,54 14,96
K
Para llevar a cabo el clculo del lmite de cuantificacin (LOQ) se utiliz como criterio
la concentracin de analito cuyo cromatograma de in extrado presenta una relacin
seal/ruido de 10 (S/N=10). En el caso del lmite de deteccin (LOD) se estableci
como criterio una relacin de 3 (S/N=3).
La relacin de seal/ruido se obtiene directamente del EIC correspondiente a una
disolucin patrn de 10g/L. En la siguiente Tabla 11 se muestran los datos referentes
a los lmites.
- 27 -
En el caso del aspartamo, debido al bajo ruido de fondo en modo de ionizacin
negativo, la relacin seal/ruido es muy alta y en este caso no se ha podido calcular con
exactitud el lmite de deteccin instrumental, que en cualquier caso est por debajo de
1g/L.
- 28 -
Sucralosa 122,1 40,3
- 29 -
Acesulfamo-K 80,6 26,6
19
Sucralosa 128,9 42,5
- 30 -
Sucralosa 128,2 42,3
La Figura 12 representa los datos (mg de edulcorante por lata) de la tabla anterior. Se
puede observar de forma general cuales y que cantidad de edulcorantes contienen las
muestras.
- 31 -
Figura 12: Representacin grfica del contenido de edulcorantes en las latas
- 32 -
En el primer caso tomando el mayor valor obtenido para el aspartamo en esta caso la
muestra 3 (Pepsi 0 Max) con 153,5 mg de edulcorante en una lata.
Para un nio de unos 30 kg, hara un total de unas 8 latas al da para superar los
40mg/kg al da.
Para la sucralosa, cogiendo el valor ms alto que corresponde con la muestra 19 (Limn
discount) con 42,6 mg de edulcorante por lata.
Para un nio de unos 30 kg, hara un total de ms de 3 latas al da para superar los
5mg/kg al da.
4. Conclusiones
- 33 -
REFERENCIAS
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