TECNICAS DE INPORTANCIA EN EL INMUNODIAGNOSTICO.

Informacin recopilada de inters veterinario.

Por; Alba Miriam Poche Ceballos
LCV. UDCA

1. AGLUTINACIN.
Son tcnicas ms sensibles que las anteriores que se usan para valorar la presencia de
Ac especficos en el suero. Se basan en la capacidad de los Ag particulados, unidos a
sus Ac complementarios, para aglutinarse dando lugar a un agregado que se ve a
simple vista.

Esta tcnica puede ser:

- Cualitativa: resultado positivo o negativo.
- Cuantitativo: s se hace una dilucin seriada del suero y se calcula el ttulo de Ac.
Ttulo de Ac es la inversa de la mxima dilucin del suero que da positiva la reaccin
de aglutinacin.
Dependiendo de la conformacin del Ag, se pueden distinguir dos tipos bsicos de
aglutinacin:
1.1.1. AGLUTINACIN DIRECTA.
Se utilizan Ag formes o particulados en suspensin (bacterias protozoos o esporas).
Todos ellos exhiben determinantes antignicos o epitopos en su periferia.

Cuando esta suspensin antignica se enfrenta a un suero problema:

 - REACCIN POSITIVA: Los Ac frente a esos epitopos
producirn la correspondiente aglutinacin y formacin de IC,
evidencindose mediante la aparicin de un velo malla caracterstico en el medio.
- REACCIN NEGATIVA: s no hay Ac, no se formaran los IC y en consecuencia los Ag
particulados sedimentan formndose un anillo o botn bien definido en el fondo del
tubo o pocillo de reaccin.
2.1.2. AGLUTINACIN INDIRECTA.
Para esta tcnica se utilizan Ag particulado soluble sensibilizado (epitopos sobre un
soporte slido inerte en solucin). Se usan bolas de ltex, carbn activo, bentonita,
etc.

1.1.2.1. AGLUTINACIN INDIRECTA EN PORTA.

Se suele efectuar sobre un porta y no en tubo o placa, mezclndose una gota de ltex
sensibilizado y una gota de suero, verificndose la reaccin en un tiempo muy corto
(2-10 minutos).
La reaccin positiva se evidencia por la aparicin de un moteado caracterstico,
ausente en la negativa. Normalmente la tcnica es cualitativa, con resultado +/-; pero
puede convertirse en cuantitativo, si la reaccin se efecta con diluciones seriadas.
1.1.2.2. HEMAGLUTINACIN INDIRECTA.
Cuando en lugar de partculas inertes se usan eritrocitos convenientemente tratados
(hemates de carnero tanizados), como soporte de los Ag (hemates sensibilizados), se
denomina HEMAGLUTINACIN INDIRECTA (HAI). Se efecta en placa de
microtitulacion, con diluciones seriadas de los sueros y la lectura es similar a la de la
aglutinacin directa.
Esta prueba es un desarrollo directo de la prueba de Coombs que se usa para
determinar Ac contra Ag de la superficie de los eritrocitos.
- PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA: detecta Ac contra el Ag Rh en la madre gestante.
- PRUEBA DE COOMBS DIRECTA: detecta la presencia de IC sobre la superficie de los
eritrocitos del recin nacido.

1.1.3. INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN.

Una variante es la INHIBICIN DE LA HAMAGLUTINACIN (IHA), en la que los posibles
Ac existentes en la muestra problema son neutralizados previamente, por lo que la
lectura de resultados se interpreta en sentido contrario a la hemaglutinacin:
- REACCIN POSITIVA: presencia de botn.
- REACCIN NEGATIVA: aparicin de velo.
Esta tcnica se usa para diagnosticar microorganismos que por s solos son capaces de
aglutinar glbulos rojos, como el virus de la rubola. S en el suero del enfermo hay Ac
contra el virus de la rubola, se produce un bloqueo de los virus y se inhibe la
aglutinacin. La ausencia de aglutinacin se interpreta como POSITIVO, porque hay Ac
contra el virus de la rubola.
1.2. REACCIONES DE LISIS.
Las reacciones inmunolgicas que utilizan el complemento se basan en su capacidad
ltica. Esta capacidad ltica esta disminuida en enfermedades autoinmunes, deficiencias
congnitas y enfermedades infecciosas.
La formacin de IC conlleva en muchos casos la fijacin de complemento. Esta fijacin
no es visible, pero puede revelarse al manifestarse alguna de las reacciones biolgicas
del complemento (hemolisis).
1.2.1. REACCIONES PARA MEDIR EL COMPLEMENTO.
1.2.1.1. CAPACIDAD HEMOLTICA (CH50).
Es la principal prueba en el screning de los dficits del complemento
 Se determina la concentracin de suero que es capaz
de producir la lisis del 50% de un preparado estndar de
eritrocitos sensibilizados con Ac antieritrocitos. La prueba se efecta en tubos o placas,
de acuerdo con la siguiente metodologa:
a) Sensibilizacin de hematies de carnero, previamente lavados, por incubacin con
hemolisina de carnero (Ac antieritrocitos de carnero).
b) Preparacin de los sueros: se disponen tubos con diferentes cantidades de suero, a
los que se aade un volumen determinado de hematies de carnero sensibilizados.
Como control se dispone un tubo de lisis total, que contiene slo hematies
sensibilizados y agua destilada. Despus de la incubacin se efecta la lectura en el
espectrofotmetro.
c) Interpretacin de resultados:
- Cada lectura se divide por la correspondiente a la lisis total y se multiplica por 100.
- Se representa grficamente los ml de suero (ordenadas) frente a los porcentajes
calculados (abcisas) en un papel semilogartmico.
- Se determina por extrapolacin el valor correspondiente al 50%, que ser la cantidad
de suero necesaria para lograr una capacidad hemoltica 50.
1.2.1.2. HEMOLISIS RADIAL SIMPLE.
Es similar a la inmunodifusin radial simple, pero aqu se produce hemolisis (se forma
un halo de hemolisis). Mide la actividad total de la va clsica o CH100.
1.2.1.3. OTROS MTODOS PARA MEDIR EL COMPLEMENTO.
Se usan para medir los componentes individuales del complemento por separado:
- Nivel total: RIA, ELISA, nefelometra, turbidimetra.
- Nivel funcional: hemolisis de eritrocitos sensibilizados o reaccin enzimtica con un
sustrato que genera calor.
1.2.1.4. REACCIONES QUE UTILIZAN EL COMPLEMENTO: REACCIN DE
FIJACIN DEL COMPLEMENTO (RFC).
- Esta prueba se usa para detectar Ac o Ag.
- El principio bsico de una prueba de fijacin de complemento es la activacin y el
consumo (fijacin) del complemento en presencia de una reaccin Ag:Ac especfica.
- El sistema de deteccin usado es la lisis de GR en la presencia del antisuero
especfico para los GR (sistema hemoltico) si el complemento no se consume en la
reaccin Ag:Ac inicial.
- En la mayora de las reacciones Ag-Ac, el complemento se une al complejo y es
usado o fijado. Este proceso puede usarse para detectar cantidades muy pequeas de
Acs. La concentracin que detecta es de mgr/ml.
- Su ejecucin requiere de gran cuidado y buenos controles.
- Se hace en dos etapas: la fijacin del C y el revelado de la reaccin con el sistema
hemoltico.
Las fases de la tcnica:
 a) Se aade una cantidad determinada del Ag
especfico de aquellos Ac que se pretende detectar. si hay Ac en
el suero problema, se unirn a los Ag y se forman IC.
b) Se aade el complemento a la mezcla. S hay IC, stos fijaran el complemento y se
consumir. En caso contrario, el complemento quedara libre.
c) Se aade el sistema revelador de la reaccin o sistema indicador, constituido por
una mezcla de clulas indicadoras (eritrocitos de carnero) y una cantidad de Ac
subaglutinante (Ac antieritrocitos de carnero).

d) Lectura de la prueba:
- REACCIN POSITIVA: no hay hemolisis porque el complemento se consumi en la
reaccin inicial. Indica que hay Ac en el suero problema.
- REACCIN NEGATIVA: hay hemolisis porque el complemento no se consumi en la
reaccin inicial. Indica la ausencia de Ac en el suero problema.

La prueba suele efectuarse en placas de plstico y realizando un banco de dilucin para

hallar el ttulo de Ac (ultimo pocillo en el que la reaccin es positiva). Hay que realizar
controles porque los IC y algunos Ag bacterianos pueden fijar el complemento.
2. FLUORESCENCIA

Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas molculas

(fluorforos)

1: Excitacin: se entrega un fotn de energa por una fuente externa a un

fluorforo que absorbe, pasando a un estado electrnico excitado S1
2: Duracin del estado excitado: existe por un perodo de tiempo finito
(tpicamente 1-10 x 10-9 segundos), sufre cambios conformacionales y puede
interaccionar con su ambiente molecular. Consecuencias: La energa de S1 es
parcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que se
emite la fluorescencia; no todas las molculas inicialmente excitadas del estado 1
vuelven al estado S0 por fluorescencia, existen otros procesos.
3: Emisin de fluorescencia: un fotn se emite, lo que permite el retorno al
fluorforo al nivel S0. A causa de la disipacin de energa durante el estado excitado,
la energa de este fotn es menor.
La diferencia de energa es llamada Stokes shift (h?EX h?EM) que es
fundamental para la sensibilidad de las tcnicas de fluorescencia, ya que la emisin del
fluorforo permite distinguirse del background.
2.1. ESPECTRO DE FLUORESCENCIA
- El mismo fluorforo puede ser repetidamente excitado y detectado. Para molculas
poliatmicas en solucin las transiciones electrnicas son reemplazadas por un
espectro de energa llamado espectro de excitacin de fluorescencia y de emisin. El
ancho de banda del espectro es un parmetro importante para cuando dos
fluorforos son detectados simultneamente.
- El espectro de emisin de fluorescencia es independiente de la longitud de
onda a la cual se excita. La intensidad de emisin es proporcional a la amplitud del
espectro de excitacin a la longitud de onda de excitacin.
- Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como
excitadoras radiaciones de longitud de onda correspondientes a los mximos de
absorcin del fluorforo.
- Los espectros de absorcin y de fluorescencia de un fluorforo en general estn
prximos (l ms cortas y l ms largas respectivamente). Esto es importante en la
eleccin de los filtros.
 La intensidad de la seal depende de los mismos
parmetros que la absorbancia, aunque tambin de la fuente de
excitacin (comnmente un lser de ion argn, longitud de 488 nm) y de la eficiencia
de recoleccin del detector.

- Las muestras biolgicas marcadas con fluorescencia contienen tpicamente ms de

una especie fluorescente, haciendo que el aislamiento de la seal sea compleja. Otras
seales pticas (como S2) quizs correspondan al background o a una segunda sonda
fluorescente.
- La deteccin de autofluorescencia puede ser minimizada por la seleccin de filtros
adecuados que reduzcan la transmisin de E2 respecto de E1.

- Quenching de fluorescencia: En muestras biolgicas el fluorforo est en solucin y

puede interaccionar con otras molculas. Como consecuencia de esta interaccin se
puede producir una perdida de emisin fluorescente. Es un proceso de desexcitatcin
no radiativa provocado por una molcula ajena al fluorforo (compuestos no
fluorescentes), que recibe el nombre de quencher. Al proceso se lo denomina
quenching de la fluorescencia
2.2. ELECCIN DEL FLUOROCROMO
- La eleccin de un fluorocromo depender de una serie de factores. Si se necesita un
nico color el fluorocromo de eleccin ser el FITC. El FITC es barato, tiene un alto
rendimiento cuntico y es relativamente hidroflico. La rpida prdida de la
fluorescencia bajo una intensa iluminacin ultravioleta puede ser solucionado por el
aadido al preparado de fenilen diamina o n-propil galato, sin embargo estos reactivos
son txicos para clulas vivas. El derivado triaznico de la fluorescena, el dicloro-
triazinilamino fluorescena (DTAF) posee propiedades pticas muy similares al FITC
pero es mucho ms estable.
- El segundo fluorocromo ms popular es el isotiocianato tetrametil de rodamina
(TRITC), que es mucho ms fluorescente que el isotiocianato de rodamina. La intensa
fluorescencia roja del TRITC es fcilmente distinguible de la verde del FITC. Debido a
ello por varios aos fueros los dos fluorocromos de eleccin para experimentos con
 fluorescencia combinada. La prdida de la
fluorescencia del TRITC es mucho menor que la FITC.

2.3. MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA

- La luz de una fuente de longitud de onda mltiple se mueve a travs de un filtro
excitador que slo permite que pase la radiacin excitada de la longitud de onda
deseada. Esta radiacin es reflejada por el filtro dicromtico y enfocada por la lente del
objetivo sobre la muestra, las molculas fluorescentes de la muestra se excitan y
emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda especfica y mayor. Esta luz es
enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a travs del filtro dicromtico y no se
refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la
radiacin de excitacin.

- Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorcin del fluorocromo. Que no

llegue al ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromtica o no.
- Filtros:Excitador: Transparente a l cortas bloqueando l ms largas. Barrera:
Transparente a l largas bloqueando l cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.
2.3.1. FUNDAMENTO.
Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo despus
este conjugado a los anticuerpos o antgenos correspondientes en cortes de tejidos,
 frotis de microorganismos o de clulas, o cultivo de
tejidos en capa nica. Cuando la reaccin es positiva y se
expone a la luz ultravioleta se producir fluorescencia observable bajo el microscopio
de inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluorforo o una
enzima que cataliza una reaccin por la cual se emite fluorescencia
2.3.2. PRINCIPIOS GENERALES DE MARCACIN DE ANTICUERPOS POR
SUSTANCIAS FLUORESCENTES
A) Conjugados
Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados
Un buen conjugado debe tener:
- Fluorescencia intensa
- Reaccin especfica con los antgenos
Depende de:
- Calidad y concentracin de los Acs en el suero
- Propiedades de la sustancia fluorescente
- Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople
Tambin influyen:
- Intensidad de marcacin
- Homogeneidad de marcacin
- Presencia en el conjugado de otras molculas marcadas
B) Anticuerpos
- Para mayor especificidad utilizar antgenos puros para inmunizar
- Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales
- Purificar la fraccin de Ig a marcar
- Verificar ttulo de anticuerpos
- Existe un estrecho paralelismo entre ttulo precipitante y fluorescente
- Titulacin de reactivos: Ac 1 y Conjugado deben titularse.
C) Fluorocromos
-El fluorocromo no unido se dializa o se separa por filtracin en geles. Disponibilidad
filtros
D) Intensidad de marcacin
- Fluorocromo puede ser conjugado en un nmero variable a cada molcula de
protena, resultando diferentes grados de marcacin.
- Mayor intensidad de marcacin, mayor intensidad
- Marcacin excesiva:
 - Disminucin del PI de las protenas
- Alteraciones en las propiedades inmunolgicas de los anticuerpos (6 7 molculas de
fluorescena/ molcula de Ac es el lmite mximo)
- Quenching de fluorescencia (disminucin del rendimiento de emisin)
E) Homogeneidad de marcacin
- Altamente marcadas: Fluorescencia inespecfica
- Medianamente marcadas: Resultados ms satisfactorios
- Insuficientemente marcadas: Fluorescencia poco intensa
2.3.3. TIPO DE INMUNOFULERESCENCIA

2.3.4. INFLUENCIA DEL TIPO DE ANTICUERPO.

Ac Policlonal Ac Monoclonal Pool de Ac

monoclonales
Fuerza de seal Excelente Regular a Buena Excelente
Especificidad Buena, pero a Excelente pero con Excelente
veces el posible reaccin cruzada
background es
alto
Ventajas Seal fuerte Especfico Seal fuerte
Desventajas No renovable Baja seal Especfico
Background Disponibilidad
Se necesita titular

2.4. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA EN FASE SOLUBLE.

Es una tcnica CUALITATIVA que se usa para detectar la presencia de Ac

especficos en el suero.
En esta tcnica la visualizacin del IC no es directa, sino que se lleva a cabo por
intervencin de sustancias fluorescentes acopladas a un Ac o anti-Ac, que
recibe el nombre genrico de conjugado fluorescente. Los Ag utilizados son
formes o partculas (cortes de tejidos, bacterias, parsitos o cortes de
parsitos, etc).

2.4.1. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD).

 Se aade la solucin de Ac fluorescente sobre el Ag,
previamente fijado en un porta o placa, se incuba, se lava y se
leen los resultados.

2.4.2. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI).

El suero problema (con el Ac buscado) se aplica sobre el Ag fijado, se lava y luego se
aade el anti-Ac fluoresceinado contra la regin Fc del primero, se lavan y se leen los
resultados.

Se usa de rutina para detectar auto-Ac en sangre de pacientes con enfermedades

autoinmunes.
2.4.3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AMPLIFICADA POR
COMPLEMENTO.
Se usa para detectar Ac fijadores del complemento. En el segundo paso, despus de
aadir el Ac, se aade complemento fresco, que se fija alrededor de donde se han
fijado los Ac. Debido a los pasos de amplificacin de la va clsica del complemento,
una molcula de Ac puede fijar muchas molculas de C3b al Ag, que se revelan con Ac
anti C3b fluoresceinado. Es una tcnica mucho ms sensible.
En los tres casos, los IC formados se ponen de manifiesto por observacin del porta en
un microscopio provisto de luz ultravioleta (los Ac se ven con fluorescencia verde). El
patrn de fluorescencia es caracterstico de cada Ag.

3. HISTOQUMICA Y CITOQUMICA
Histoqumica es el estudio qumico de los tejidos independientemente del mtodo de
anlisis empleado. En la prctica se emplea la palabra para designar el mtodo junto
con el auxilio de los microscopios pticos (MO) y electrnico (ME).
Esta tcnica permite la identificacin y localizacin de compuestos o radicales qumicos
en las clulas y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que dan productos
insolubles que son coloreados o electrodensos y visibles por el MO y el ME .
A. PRINCIPIOS BSICOS.
 1. QUE LOS COMPUESTOS QUE DEBEN SER
ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES.
Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser estudiados por
medio de la fijacin del tejido.
- Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustancias
hidrosolubles como el glucgeno.
- Hay que evitar los fijadores cidos en las tcnicas de visualizacin del fosfato clcico.
Los fijadores ms utilizados son:
- Formaldehdo para el MO .
- Glutaraldehdo para el ME.
2. EL PRODUCTO DE LA REACCIN DEBE SER INSOLUBLE para evitar la difusin .
3 .EL MTODO UTILIZADO DEBE SER ESPECFICO PARA LA SUSTANCIA O GRUPO
QUMICO QUE SE ESTA ANALIZANDO. En algunas reacciones la intensidad del color
producido es proporcional a la concentracin de la sustancia analizada.En este caso se
puede medir dicha sustancia con un histofotmetro.
B. PRINCIPALES SUSTANCIAS DE INTERS BIOLGICO DEMOSTRABLE
HISTOQUMICAMENTE.
1. IONES
IN DETERMINACIN
HIERRO - EL in frrico se demuestra por la reaccin con la mezcla de FERRO-
CIANURO POTSICO Y CIDO CLORHDRICO que forma un precipitado
azul oscuro de ferrocianuro frrico.
- Esta reaccin se usa para localizar los macrfagos del SRE y
diagnosticar enfermedades en las cuales hay depsitos de hierro en los
tejidos .
FOSFATO Reaccionan con NITRATO DE PLATA y se forma fosfato de plata que es
reducido por hidroquinona y forma un precipitado negro. Esta reaccin
se usa para el estudio del hueso.
2. LPIDOS.
Se usan colorantes que se disuelven en las grasas como el SUDAN IV y el SUDAN
NEGRO.Los tejidos se sumergen en soluciones alcohlicas saturadas de colorantes muy
liposolubles y debilmente solubles en alcohol. Se usa para el diagnostico de
enfermedades metablicas que producen depsitos intracelulares.
3. CIDOS NUCLICOS.
CIDO DETERMINACIN
NUCLICO
DNA Se usa la reaccin de FEULGEN que consiste :
- Hidrlisis del DNA con cido clorhdrico para extraer las bases pricas
y dejar en libertad los grupos aldehdicos del azucar.
- El reactivo de SCHIFF (fuchsina bsica con anhdrido sulfuroso)
 reacciona con el aldehdo y forma un precipitado rojo.
Esta reaccin presenta proporcionalidad entre la intensidad del color
producido y el contenido en DNA del ncleo.
RNA Tiene gran afinidad por los colorantes bsicos (basoflia) lo que hace
que se tia intensamente con el AZUL DE TOLUIDINA o de METILENO.
4. PROTENAS.
Su identificacin se basa en mtodos de deteccin de aminocidos.
- Reaccin de aminobenceno.
- Reaccin de Sakaguchi que detecta la arginina de las protenas bsicas como las
histonas y protaminas.
5. POLISACRIDOS.
Se encuentran unidos a protenas o en forma libre. En el caso de ser un polmero,
antes hay que tratar la muestra con un enzima glucogenoltico para que libere los
azucares.
La reaccin ms usada es la del PAS (cido peridico-schiff). El cido oxida a los
azucares en posicin 1-2 y deja grupos aldehdos libres que reaccionan con el reactivo
de SCHIFF dando un compuesto insoluble y coloreado. De este modo se demuestra la
presencia de:
- Glucgeno en el hgado y msculo.
- Depsito intracelular de glucgeno en enfermedades congnitas.
- Glucosaminoglicano o mucopolisacrido que forman parte de los proteoglicanos.
- Glucoprotenas.
Los azucares cidos tambin reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN.
6. CATECOLAMINAS. El formoaldehdo reacciona con las catecolaminas produciendo
compuestos fluorescentes.
7. ENZIMAS. Su localizacin se basa en la produccin de un precipitado fuertemente
coloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimtica.
ENZIMA DETERMINACIN
FOSFATASA CIDA Se usa el mtodo de GOMORI que consiste en incubar cortes de
tejidos en una solucin que contengan GLICEROL FOSFATO
SDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 .
La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da un
precipitado insoluble.Despus se aade sulfito de amonio que
da color negro y electro denso al precipitado.
Se usa para localizar lisosomas.
DESHIDROGENASAS Se usan cortes no fijados junto con un compuesto qumico
soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL.El tetrazol es
reducido y forma un precipitado coloreado llamado FORMAZAN.
 Se usa para detectar mitocondrias.
PEROXIDASA Promueve la reduccin de ciertos sustratos, transfiriendo iones
hidrgenos desde el perxido de hidrgeno al sustrato que se
reduce.
Como sustratos se usa el perxido de hidrgeno y el
tetraclorato 3,3-diamino-bencidina que cuando se reduce forma
un compuesto coloreado, insoluble y electrodenso.

B. FLUORESCENCIA.
Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda determinada y
emite luz en otra longitud de onda mayor. En microscopa se suele usar la excitacin
con luz ultravioleta.
1. COMPUESTOS FLUORESCENTES.
- Compuestos naturales constituyentes de las clulas: vitamina A, riboflavina(B2) y las
porfirinas.
- Colorantes con afinidad por las estructuras celulares como el Naranja de acridina que
se une a los cidos nuclicos:
- DNA: fluorescencia verde amarillenta.
- RNA: fluorescencia roja amarillenta.
Esta prueba se usa en el diagnostico precoz del cncer (clulas ricas en RNA).
2. INMUNOCITOQUMICA (INMUNOFLUORESCENCIA).
Sirve para identificar protenas especificas. Se basa en la reaccin Ag-Ac. Al Ac se le
puede marcar con un compuesto fluorescente. Es la mtodo ms usado para la
deteccin de auto-anticuerpos en enfermedades autoinmunes.
PREPARACIONES PERMANENTES
Describiremos primero las preparaciones histolgicas permanentes (laminas) para el
estudio al microscopio ptico. Con este instrumento los objetos se examinan por
transparencia, siendo pocas las estructuras que se examinan directamente
(mesenterio, cola de renacuajo) y que pueden ser observadas in vivo, sin fijar y
teir, como sucede en las preparaciones permanentes.
Los pasos que se siguen para obtener una preparacin permanente son:
1. Fijacin
2. Inclusin
3. Corte con microtomo
4. Coloracin
A. FIJACIN.
- Se hace a fin de evitar la autolisis y destruccin celular.
- Los tejidos deben ser tratados inmediatamente despus de ser cortados.
 - Tiene por fin endurecer los tejidos, volvindolos mas
resistentes a las etapas subsiguientes de la tcnica
histolgica.Hay que conservar la morfologa y la composicin qumica de los
componentes de los tejidos.
- Suele durar unas 12 horas.
La fijacin puede ser realizada por procesos:

MTODO CARACTERSTICAS
FSICO - Calor, como en bacteriloga.
- Fri, como en el criostato.

QUMICO (uso de fijadores Fijadores:

que inmovilizan las protenas
de los tejidos).Es la ms
usada en Histologa.
- Cloruro de mercurio y cido pcrico precipitan
protenas.
- Formaldehdo, tetraxido de osmio y glutaraldehdo
apenas causan coagulacin y se usan en ME.
Mezclas fijadoras:
- Liquido de BOUIN: pcrico/formol/actico glacial
- Liquido de HELLY: dicromato potsico/cloruro de
mercurio/formol

Este paso es ESENCIAL, puesto que las protenas son las principales responsables de la
estructura celular y se degrada despus de la muerte celular.
Habitualmente se hace una doble fijacin con una solucin tamponada de:
- Glutaraldehdo.
- Tetraxido de osmio.
B. INCLUSIN.
- Da consistencia firme a los tejidos para que se puedan obtener cortes
suficientemente finos.
- Las sustancias ms usadas para este fin son:
- GELATINA, CELOIDINA, PARAFINA para la MO.
- RESINA EPOXI para la ME.
Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de la
inclusin:

TRATAMIENTO CARACTERSTICAS
DESHIDRATACIN Se extrae el agua de los tejidos con baos de
concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a
100%).
ACLARAMIENTO O Sustitucin del etanol por un liquido miscible en
DIAFANIZACIN etanol y parafina.Se usa xilol, benzol o toluol que
dejan a la pieza translcida.
INCLUSIN O IMPREGNACIN
- Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 C
en el interior de una estufa.
- Debido al calor , el xilol o toluol se evaporan y los
espacios que dejan libre son ocupados por la
parafina.
- Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se
deja solidificar.
- Inconvenientes:
- Destruyen muchas enzimas
- Eliminan compuestos liposolubles

C. CORTE CON MICROTOMO.

- Los bloques de parafina son seccionados por la cuchilla del microtomo, obtenindose
cortes de 3 a 8 micras de espesor. Estos cortes son extendidos en agua caliente y
despus se llevan a un portaobjetos.
- Para el microscopio electrnico se requieren cortes de 0.02 a 0.1 micra. El material
se incluye en plsticos bastante duros del tipo epoxi y para cortarlos se usa un
ultramicrotomo equipado con navaja de cristal o diamante.
- El microtomo de CONGELACIN SE USA PARA ESTUDIAR LOS LPIDOS DE LAS
ESTRUCTURAS CELULARES, ya que los solventes orgnicos los eliminan. Usa nieve
carbnica para congelar el tejido.
- CRIOSTATO es un microtomo de congelacin ms elaborado que permite la obtencin
rpida de cortes sin pasar por todas las etapas anteriores, cuando se usa parafina.Son
muy utilizados en hospitales cuando se requiere un diagnostico rpido de un material
patolgico.
El criostato es tambin muy til en histoqumica , pues no inactiva las enzimas, pero
dificulta la difusin de las molculas.
- MTODO DE CONGELACIN-DESECACIN: Se mantiene la actividad enzimtica. Se
congela a -150 C y despus se deshidrata lentamente a vaci.
D. COLORACIN.
- Aumenta el contraste de las estructuras y hace a los tejidos visibles y diferenciables
unos de otros.
- Se realiza normalmente con MEZCLAS QUMICAS DE COLORANTES.
- La mayora de los colorantes se comportan como cidos o como bases y tienden a
formar sales con los radicales ionizables de los tejidos.
- Los componentes de los tejidos pueden ser:

SUSTRATO COLORANTE EJEMPLOS

BASFILO (tejidos que se BSICO (azul de toluidina y Nucleoprotenas y
tien fcilmente con azul de metileno, glicoprotenas cidas.
colorantes bsicos). hematoxilina).
 ACIDFILO (tejidos que se QCIDO (orange G, eosina y Protenas bsicas del
tien fcilmente con la fuschina cida). citoplasma.
colorantes cidos).

La doble coloracin por la hematoxilina y la eosina es la ms utilizada en la tcnica

histolgica.
OJO: Los colorantes no proporcionan datos sobre la naturaleza qumica de los
componentes a los que se unen.

TCNICA COMPONENTES NCLEO CITOPLASMA FIBRAS FIBRAS RETICULINA

COLGENAS ELSTICAS
Hematoxilina- Hematoxilina Azul - - Irregular -
eosina
Eosina - Rosa Rosa Irregular -

Hematoxilina Negro - - - -
frrica
Tricromo Fuchina-cida y - Rojo - - -
Masson Panceau
Verde luz - - Verde - -

Fuchina- Fuchina y - - - Prpura -

resorcina resorcina
Impregnacin Sales de plata - - Castao - Negro
argntica

Los factores que influyen en la tincin son:

- Pureza y concentracin del colorante.
- pH y temperatura.
- Tiempo.
E. METACROMASIA.
Hay ciertos tejidos, como la matriz cartilaginosa, que al usar colorantes como el azul
de toluidina, se modifica el color azul por unin al tejido, pasando a prpura. A este
fenmeno se le denomina metacromasia.
Los colorantes metacromticos suelen ser bsicos, como el azul de toluidina y tionina.
Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromticamente, denominados
cromotropos, son principalmente:
- Glucosaminoglicanos sulfatados, fuertemente cidos de la matriz cartilaginosa y los
mastocitos del tejido conectivo.
- Nucleoprotenas.
F. MANIPULACIN EXPERIMENTALES DE CLULAS VIVAS.
Las tcnicas de tincin pueden ser:
- VITALES: no provocan la muerte. Se usan colorantes relativamente no venenosos
que son retenidos selectivamente por algunas clulas del organismo. Se inyecta al
animal vivo.
 - SUPRAVITALES: se agrega el colorante a las clulas
o tejidos que permanecen vivos despus de ser separados del
organismo.
Ejemplos:
- El carmn y azul tripn se usan para el estudio de la fagocitosis.
- El rojo neutro para identificar los distintos tipos de leucocitos.
- El verde jano tie las mitocondrias.
- La alizarina se une a la matriz sea recin formada y se ha usado para el estudio de
la formacin del hueso.
G. CRIOFRACTURA.
Permite el estudio de la ultraestructura de las clulas sin los posibles artefactos
producidos por la fijacin y la inclusin (ej: membrana plasmtica). Sirve para el
examen de cortes ultrafinos.
Fases:
1. Congelar el tejido a temperatura muy baja.
2. Fracturar con una cuchilla de metal afilada. El tejido fracturado se mantiene a muy
baja temperatura y en alto vaco, as se elimina el agua por sublimacin. La superficie
fracturada muestra elevaciones y depresiones correspondientes a las diversas
estructuras de los tejidos.
3. Hacer una rplica al molde de la superficie fracturada depositando una capa de
carbono.
4. Depositar una capa de metal pesado sobre la superficie de carbono para dar un
aspecto sombreado.
5. Llevar la muestra a presin atmosfrica normal y destruir el tejido por una
sustancia que no ataque el molde (cido fuerte, hipoclorito sdico).
6. Colocar la rplica en una rejilla de cobre y llevarla al ME.

RADIOAUTOGRAFIA
Se basa en el efecto de las radiaciones sobre las emulsiones fotogrficas que contienen
bromuro de plata (microdetectores de radiactividad). Los cationes de plata que son
alcanzados por la radiacin se transforman en plata metlica que aparece negra al
microscopio ptico (MO).
Fases:
1. Inyectar el istopo radiactivo al rgano en estudio.
2. Poner un corte de rgano en contacto con la pelcula de emulsin fotogrfica.
3. Dejar un perodo de exposicin y revelar la pelcula. Los puntos negros que
aparecen corresponden a los sitios del rgano que contienen el istopo.

La cantidad de grnulos de plata es proporcional a la radiactividad presente y as

permite tambin la medida de la cantidad relativa de dicha sustancia.
 a) Tcnica de emulsin liquida:
- Se sumergen las preparaciones biolgicas en la emulsin calentada y fundida.
- Retirar las lminas y queda sobre su superficie una fina pelcula de emulsin.
- Secar y guardar al abrigo de la luz, generalmente a baja temperatura.
- Proceso de revelado semejante al usado para placas fotogrficas en una cmara
oscura.
- Llevar al microscopio (ME MO).
b) Aplicaciones: con el uso de istopos radiactivos de C, H, N, S, P, es posible marcar
las molculas de numerosos compuestos que intervienen en el metabolismo. De esta
forma se localiza el proceso metablico y su velocidad, como la secrecin de grnulos
de zimgeno.

5. CITOMETRA DE FLUJO.

5.1. FUNDAMENTO
La Citometra de Flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparamtrico cuyo
fundamento se basa en hacer pasar una suspensin de partculas (generalmente
clulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de lser focalizado. El
impacto de cada clula con el rayo de luz produce seales que corresponden a
diferentes parmetros de la clula y que son recogidos por distintos detectores. Estos
convierten dichas seales en seales electrnicas que posteriormente sern
digitalizadas para permitir la medida simultnea de varios parmetros en una misma
clula.
En el momento de realizar las mediciones en el citmetro de flujo, las clulas pueden
estar vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensin celular y en forma de clula
nica. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz lser mediante un flujo
continuo, cada clula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente como
consecuencia de la excitacin lser a la que es sometida. Los parmetros que
tpicamente se miden de forma simultnea por cada clula son:
1. Dispersin frontal de la luz a 2 (forward scatter), valor proporcional al tamao
celular.
2. Dispersin de la luz ortogonal (side scatter), proporcional a la cantidad de
estructuras granulares o complejidad de la clula.
3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.
5.2. ESTRUCTURA BSICA DE UN CITMETRO DE FLUJO
Los citmetros de flujo estn formados por complejos sistemas:
A) El sistema fludico permite un enfoque hidrodinmico del flujo celular hasta
conseguir el alineamiento de las partculas o clulas, y en los separadores celulares o
cell sorters, se produce una rotura del flujo en gotas de tamao uniforme para
conseguir la separacin de clulas individuales.

B) Los sistemas pticos permiten el enfoque lser en un haz con un dimetro reducido
para impactar sobre el menor nmero de partculas posibles simultneamente.

Este sistema se compone de dos tipos de pticas:

 - La ptica de excitacin, compuesta de el lser y las
lentes apra enfocar y dirigir el haz de luz;
- La ptica de lectura, compuesta por las lentes de recoleccin de luz emitida luego de
la interaccin entre el haz del lser y las partculas y el sistema de espejos y filtros
para direccionar longitudes de onda especficas hacia los detectores correspondientes.
Los FILTROS OPTICOS son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que deja
pasar hacia el detector. Estos pueden ser:
- DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas);
- DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De stos hay tres tipos:
- Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 640
nm)
- Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada (
Por ej: < 575 nm)
- Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Por
ej: > 520 nm)

C) El sistema electrnico se encarga de la cuantificacin de los destellos de

fluorescencia y de la luz dispersada y, bajo el control del ordenador, se consigue la
carga electrnica de las gotas que contienen las clulas de inters para poder
someterlas a defleccin y recogerlas en tubos especficos para tal fin, o sobre pocillos
de cultivo de tejidos. El ordenador permite almacenar datos de miles de clulas por
cada muestra, y representar los resultados grficamente.

5.3. INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJO

Bsicamente podemos obtener los siguientes datos:
- El tamao celular relativo ( Forward Scatter o FSC)
- La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC)
- Intensidades relativas de emisin de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3 ,FL4..etc..)
 A travs de dos tipos de seales:
A) Seales de dispersin.
La dispersin resulta de la interaccin de la luz con una partcula que produce un
cambio de direccin (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio.
Las caractersticas morfolgicas que determinan la dispersin de la luz son
fundamentalmente el tamao celular, la membrana, el ncleo y el material granular
del interior de la clula, llamado complejidad. En los Citmetros de Flujo se miden dos
fracciones de dispersin:
-La luz dispersada en ngulo cnico pequeo (0-10) que casi coincide con la direccin
de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al
tamao de la partcula que produce la dispersin.
-La luz dispersada en ngulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la
complejidad de la estructura interna de la partcula.
(WWW.CITOMETRIADEFLUJO.COM)

B) Seales de Fluorescencia.
Los citmetros de flujo permiten detectar seales de fluorescencia procedentes de
complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una clula,
siendo la cantidad de seal de fluorescencia emitida igual a la proporcin de la
cantidad de componentes fluorescentes de la partcula.
5.4. ANLISIS DE DATOS
En general todos los citmetros presentan los datos en algunos formatos standard.
- Histograma: segn un parmetro.

- Grficos de puntos: Cualquier combinacin de dos parmetros de los datos obtenidos

para la poblacin de clulas.
5.5. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Debido a la necesidad de utilizar una suspensin de partculas (clulas, ncleos,
cromosomas, etc), para ser ledos de una en una hace que se pierda informacin sobre
la arquitectura de los tejidos que componen las clulas o de las propias clulas, as
como la ineraccin entre estas y el medio que las rodea (patrones nodulares o difusos
de los linfomas). Frente a este inconveniente la CMF presenta mltiples ventajas frente
al microscpio de fluorescencia y las tcnicas citoqumicas, como:
- Posibilidad de empleo de multiples frente a un solo marcaje de la citoqumica y la
microscopia de fluorescencia.
- Posibilidad de analizar un elevado nmero de partculas en un corto perodo de
tiempo (5000 partculas/segundo).
- Posibilidad de cuantificar la por medio de los canales medios de fluorescencia.
- Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mnima
residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales
como los basfilos.
- Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epitopos celulares.
- Permite almacenar informticamente la informacin del anlisis para poderla utilizar
en cualquier momento y reanalizar anlisis hechos con anterioridad.
- Posibilidad de cuantificar las molculas antignicas presentes en un grupo celular.
5.6. QU DATOS PODEMOS OBTENER DE LAS CLULAS UTILIZANDO UN
CITMETRO DE FLUJO? A QU VELOCIDAD?
La iluminacin de las clulas con luz LASER nos permite conocer el tamao y la
complejidad de los diferentes tipos de clulas. Si agregamos el uso de molculas
fluorescentes para marcar estructuras celulares (por ej. cido desoxirribonucleico o
ADN, cido ribonucleico o ARN, antgenos, etc.) se ampla enormemente sus
posibilidades de deteccin. Dichas sustancias fluorescentes, al ser iluminadas por la luz
LASER, emiten seales lumnicas en diferentes longitudes de onda (que son captadas
por diferentes detectores) con lo cual podemos obtener valiosa informacin de las
propiedades de una poblacin celular. En un citmetro convencional logramos
informacin sobre al menos 5 parmetros (por ejemplo tamao, complejidad,
contenido de ADN, viabilidad celular y presencia o ausencia de antgenos). Lo
interesante de esta metodologa es que no slo aporta muchos datos en forma
simultnea, sino que lo realiza a velocidades que parecen asombrosas porque es capaz
de analizar al menos 1000 clulas en solamente un segundo!
Los citmetros de flujo de mayor complejidad son tambin capaces de clasificar a las
clulas que resulten de inters para el investigador. Entendemos por clasificar la
 posibilidad de separar del resto a un conjunto de
clulas que comparten una o varias propiedades y recolectarlas
en un tubo, placa de cultivo o portaobjeto. Esto permite llevar a cabo estudios ms
sofisticados de una poblacin de clulas similares, iniciar cultivos de un mismo tipo
celular, etc. Para dar una idea de la especificidad del mecanismo de separacin de los
citmetros de flujo cabe mencionar que se emplean para separar los distintos tipos de
cromosomas de la especie humana u otras especies. La obtencin de suspensiones
cromosmicas de elevada pureza mediante citometra de flujo ha permitido
formidables avances en el conocimiento del genoma humano y en la obtencin de
sondas moleculares aplicables a diagnstico citogentico de diversas patologas.
Explicar en detalle el mecanismo que se utiliza para clasificar los diferentes tipos de
clulas o cromosomas excede los objetivos de esta introduccin. Basta mencionar que
para lograrlo se fragmenta la columna lquida en pequeas gotitas haciendo vibrar la
boquilla a ms de 20.000 veces por segundo!. Luego de ajustes apropiados, se logra
que cada gotita contenga una clula o cromosoma. Cuando el citmetro detecta una
clula o cromosoma de inters para clasificar, el aparato carga elctricamente la
columna liquida de forma tal que slo la gota que contiene el evento de inters (clula)
queda cargada. Finalmente, el sistema direcciona dicha gota con la clula hacia un
tubo recolector al ser desviada por un intenso campo elctrico.
5.7. QU APLICACIONES TIENEN LOS CITMETROS DE FLUJO EN LA
INVESTIGACIN BSICA Y APLICADA?
El campo de aplicacin de este tipo de instrumentos crece rpidamente da a da ya
que son numerosas las reas de la biologa y medicina que se benefician de su uso.
Entre otras aplicaciones, se encuentra la tipificacin de las leucemias y los linfomas
que permite alcanzar un diagnstico preciso, permitiendo un tratamiento y
seguimiento ms adecuado y eficaz. Otra aplicacin muy importante es el estudio de
las poblaciones linfocitarias afectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) causante del Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) que permite
conocer en los individuos afectados su capacidad de respuesta inmunitaria, de capital
importancia para el seguimiento de la evolucin de la infeccin y el tratamiento
adecuado para el paciente.
El estudio de la cantidad de material hereditario (ADN) posee numerosas aplicaciones.
En medicina, se emplea para evaluar si existen cambios genticos en poblaciones de
clulas tumorales. La presencia de estos cambios tiene importancia en el prnostico de
la enfermedad maligna. Dado el elevado nmero de clulas a analizar para realizar
estos diagnsticos, el citmetro de flujo es la herramienta indicada para este tipo de
estudios. Tambin es posible estimar si las clulas han sufrido cambios relevantes en
el ADN, as como evaluar su nivel de proliferacin ya que con frecuencia las clulas
malignas crecen con mayor rapidez que las normales. El citmetro es capaz de
cuantificar el grado de proliferacin celular, es decir la tasa con que las clulas se
multiplican. En el campo de la biologa, la citometra de flujo se ha tornado el mtodo
ms empleado para determinar el contenido exacto de ADN de cada especie, lo cul es
de suma importancia para estudios genticos, evolutivos y biotecnolgicos. A su vez,
se pueden realizar estudios del nivel de ploidia, anlisis cromosmicos y estudios del
dao del ADN.

6. REACCIONES INMUNOENZIMTICAS.
 Revelan la presencia de Ag o Ac mediante una
reaccin Ag-Ac especfica, en la que el complejo inmune formado se mide por una
reaccin colorimtrica catalizada por una enzima acoplada qumicamente a uno de los
reactivos, en presencia del sustrato adecuado.

El ELISA se basa en dos supuestos:

- El Ag o el Ac se pueden unir a un soporte en fase slida reteniendo su actividad

inmunolgica.

- Tanto el Ag como el Ac pueden unirse a una enzima, y el conjugado mantiene tanto

su actividad inmunolgica como enzimtica.

Los mtodos inmunoenzimticos (ELISA) se han desarrollado en tres direcciones:

- Localizar los constituyentes celulares.

- Medicin de pequeas cantidades de componentes en los lquidos biolgicos.

- Deteccin de precipitados inmunes inmovilizados sobre papeles de nitrocelulosa.

6.1. ENZIMOINMUNOANLISIS

El ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) se basa en la reaccin de un Ac

o de un Ag acoplado de forma covalente a una enzima, con un Ag o un Ac inmovilizado
(fijado sobre un soporte), para detectar finalmente la actividad enzimtica con ayuda
de sustratos especficos. Tipos de ELISAs:

A) HOMOGNEOS: son en medio lquido y no se requiere la separacin de los reactivos

. La reaccin sigue la ley de accin de las masas.

A1) Ventajas:

Ms precisos

En general automatizados, se llevan a cabo sin entrenamiento especial

A2) Desventajas:

Son ms costosos en reactivos

En general slo sirven para frmacos

B) HETEROGNEOS: se requiere separacin entre el reactivo libre y el unido. Para ello,

el Ag o el Ac estn inmovilizados. El reactivo complementario difunde hacia l y se le
une especficamente.

B1) Ventajas :

Menos interferencias, ms especficos y sensibles

Instrumentacin menos costosa

 Admiten mayor tamao de muestra, as disminuye el
lmite de deteccin.

Ms verstiles en cuanto a tipo de analito

B2) Desventajas :

Ms difciles de automatizar

Mayor tiempo de anlisis

Los mtodos de ELISA HETEROGNEOS dependiendo de la actividad enzimtica se

dividen en dos tipos:

- Competitivos: En este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a competir con el

conjugado por un nmero limitado de sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de
color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima
porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

- No competitivos: Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o anticuerpo que

est en la fase slida. Si una muestra es positiva se formar el complejo antgeno-
anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato
desarrollando color.

Dentro de los no competitivos tenemos:

- Los directos que detectan antgenos

- Los indirectos que detectan anticuerpos.

 6.2. PASOS GENERALES DE UN ELISA

1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo

2. Todas las placas son sometidas a un tapizado con gelatina o albmina srica bovina,
que recubre las zonas en las que no se ha fijado el primer componente de la reaccin
(Ag o Ac).

3. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos

4. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el

posillo.

5. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antgeno no unido

6. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima

7. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo

8. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida

9. Adicin del sustrato

10. Unin del sustrato a la enzima

11. Generacin de la seal. La ltima parte de un inmunoensayo en que la marca es

enzimtica es la cuantificacin de la enzima. Mtodos de deteccin:

a) Espectrofotomtrico o colorimtrico. Se mide la aparicin de un cromforo.

b) Fluoromtrico- Se mide la aparicin de un producto fluorescente

c) Quimioluminiscente- Se mide la aparicin de un producto luminiscente.

12. Lectura del color en un lector de placas.

13. Cuantificacin en ELISA: curvas standard

6.2.1. REACTIVOS QUE GENERAN COLOR.

Los reactivos utilizados suelen ser los mismos (peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-
glucosidasa, glucosa oxidasa) para todos los ELIASAs, con la diferencia del sustrato de
la enzima utilizada:

d) Puede generar productos coloreados y solubles que se miden por

espectrofotometra.

- En presencia de agua oxigenada, los cromgenos usados para la peroxidasa se

reducen y dan productos solubles y coloreados. Los sustratos son la o-dianazina, o-
fenilenodiamina (OPD), tetrametilbencidina (TMB), cido- 2,2-acino-di-(3-
etil)benzatiazolina-6- sulfnico (ABTS).

- Cuando queremos un precipitado, se usa para revelar la reaccin a la peroxidasa y

diaminobenzidina, que generan un precipitado de color caf.

- La glucosa oxidasa reacciona con la glucosa y libera agua oxigenada que se detecta
por una mezcla de peroxidasa y un cromgeno. S queremos un precipitado, podemos
usar una sal de tetrazolio.

- La fosfatasa alcalina y la beta-glucosidasa utilizan como sustrato a el

paranitrofenilfosfato y el ortonitrofenil-betaD-galactopiranosido, los cuales son
hidrolizados por la enzima y se libera el nitrofenol soluble.

- Puede generar precipitados coloreados insolubles y estables en el mismo lugar de la

enzima (ELISA-DOT y Western-blot sobre papel de nitrocelulosa) y localizar
constituyentes celulares (inmunohitoqumica).

6.3. TIPOS DE ELISAS

6.3.1. ELISA DIRECTO

Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se
sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos
que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, ) pero en las
que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen
 controles positivos (soluciones donde se encuentra el
antgeno buscado, o bien se le ha aadido).

Consta de las siguientes etapas:

Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para

eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.

Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos

reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar
los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se

puede parar la reaccin si se desea.

Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

6.3.2. ELISA INDIRECTO

Las placas ELISA se preparan de una forma idntica a la anterior. Los controles
positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos
: uno primario contra el antgeno, y uno secundario marcado contra el primario. La
deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de sel debida a la
unin de dos o ms anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo ms
popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario
marcado y un mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de
antgenos.

Consta de las siguientes etapas:

Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de

estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
 Adicin del suero problema, de tal forma que sus
anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado
para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con
los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a
los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.

Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se

puede parar la reaccin si se desea.

Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

6.3.3. ELISA SANDWICH

Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos). Se trata de

un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en
la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el
primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido
se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues
cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un
segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad
y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.

A) ELISA Sndwich DAS (Double Antibody Sandwich).

Consta de las siguientes etapas:

Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a

detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.

Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de

tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno),
reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.

Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo

diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con
una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema
y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.

Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se

puede parar la reaccin si se desea.

Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

B) ELISA Sndwich HADAS.

 Consta de las siguientes etapas:

Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a

detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.

Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de

tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno),
reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.

Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo

diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales
reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran
fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan
reaccionado.

Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el

paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.

Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se

puede parar la reaccin si se desea.

Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

7. REACCIONES DE PRECIPITACIN: Electroforesis.

7.1. ELECTROFORESIS.
Separacin de protenas del suero en funcin de su comportamiento en el campo
elctrico.
La velocidad de las particulas depende de:

La carga de las mismas

La intensidad del campo elctrico y
Del coeficiente de friccin de las molculas con el medio

TIPOS DE ELECTROFORESIS

EQUIPO DE ELECTROFORESIS

Fuente de alimentacin

Soporte para las tiras de acetato de celulosa

o Aplicador

o Cubeta y puente

o Las tiras de acetato de celulosa

o Reactivos
Se hace correr una alicuota de suero en un gel de agarosa y con tampn barbital (pH
8.4), en el que las Ig (con carga positiva) se desplazan hacia el ctodo. Despus de
correr el gel, ste es fijado en una solucin cido-alcohol y se tie con un colorante de
protenas, y por ultimo se hace un densitometrado. Es una tcnica CUALITATIVA.

Sirve para:
- Detectar hipergammaglobulinemias.
- Calcular la fraccin gamma.
- Detectar paraprotenas (componentes monoclonales) en el suero..
7.2. INMUNOELECTROFORESIS (IEF).

Prueba CUALITATIVA.
Mtodo combinado de precipitacin.

Precipitacin por difusin.

Electroforesis de los antgenos de acuerdo a su carga.

til para determinar mezclas complejas de Ag o Ac (Acs monoclonales clsicas

en mieloma, linfomas).

En esta tcnica, hay 5 fases:

 1. Se prepara un gel de agarosa sobre un porta y se
hace un pocillo para el suero y un canalillo para el anticuerpo
especfico.
2. Migracin de antgenos por carga (Separacin). Los Ag del suero se separan primero
en base a su carga elctrica. El pH se elige de modo que unos Ags se carguen
positivamente y migren hacia el ctodo, y otros Agsse carguen negativamente y
migren hacia el nodo.
3. Difusin. El canalillo se llena con el Ac especfico y se deja reposar para conseguir la
difusin.
4. Formacin del precipitado. Ag y Ac reaccionan y precipitan, formando arcos de
precipitacin.
5. Interpretacin de las bandas.

7.3. RADIOINMUNOELECTROFORESIS.
- Se marca radiactivamente los Ag y se hace una IEF; despus se hace una
autorradiografa de las bandas obtenidas (se visualizan mejor).
- Es una prueba CUALITATIVA y/o semicuantitativa.
7.4. ELECTROINMUNODIFUSIN.
Consiste en acelerar la formacin de la banda de precipitacin por la accin de un
campo elctrico. Con estas tcnicas se detectan [Ag] de 20 mgr/ml y [Ac] de 20
mgr/ml. Estas tcnicas se basan en que el Ag y el Ac tienen cargas diferentes al pH
seleccionado; puesto que la mayora de los Ag tienen un pI bajo y los Ac alto. Si las
cargas sobre el Ag y Ag apenas difieren, se puede modificar la molcula qumicamente.

7.4.1. ELECTROFORESIS DE CONTRACORRIENTE.

 Es una IDD acelerada por el paso de una corriente
elctrica. Es muy importante que la carga neta del Ag sea (-) y
Ac sea (+) y que sean colocados en el lugar adecuado en el campo elctrico (que
viajen uno al encuentro del otro). Es una tcnica CUALITATIVA.
La sensibilidad es de 10-20 veces mas que en el Mancini.
7.4.2. ELECTROINMUNODIFUSIN CUANTITATIVA O ELECTROFORESIS
ROCKET.
Es un Mancini acelerado por un campo elctrico. El pH del gel se elige para que el Ac
tenga carga neutra y permanezca inmvil, y el Ag tenga carga negativa y se desplace
hacia el nodo.
En un extremo del gel se perforan los pocillos donde se pone el Ag a distintas
concentraciones. El Ag debe estar cargado negativamente para que se desplace hacia
el nodo. El Ag difunde y se forman bandas de precipitacin con forma de cohete
(cuanto menor es la concentracin del Ag, menor es el tamao del rocket). Es una
tcnica CUANTITATIVA en la que se puede construir una curva estndar representando
altura frente a concentracin de Ag.
7.4.3. ELECTROFORESIS CRUZADA DE LAUREL.
- Primero se hace una electroforesis para que los Ag se separen (como en la IEF).
- Despus se corta una tira con el Ag separado y se aplica sobre otro gel que contiene
Ac especficos.
- Se hace una electroforesis cruzada como en la IEF.
- Se forman bandas de precipitacin.
- Es una tcnica CUALITATIVA con la que podemos reconocer Ag.
7.5. INMUNOFIJACIN.
7.5.1. CARACTERSTICAS
La inmunofijacin es una tcnica de laboratorio que permite el estudio de protenas en
sangre y orina, especficamente la identificacin de componentes monoclonales u
oligoclonales .
Las bandas anormales en las corridas electroforticas de protenas de sueros u orinas,
principalmente aquellas situadas en las fracciones de beta globulinas y de gamma
globulinas son siempre sospechosas de ser protenas monoclonales, y por lo tanto son
un indicio de gammapatas monoclonales.
- La electroforesis seguida de inmunofijacin es una tcnica sencilla que permite que
una protena sea retenida despus de la electroforesis, in situ, mediante la formacin
de un complejo insoluble con su anticuerpo. Es fcil de realizar (provee resultados en 2
o 3 horas) y permite lograr mayor sensibilidad que una inmunoelectroforesis, as como
una interpretacin mas sencilla.
7.5.2. ESQUEMA DE LA TCNICA
La inmunofijacin es una electroforesis de protenas seguida de una inmovilizacin de
las mismas al enfrentarse a un antisuero especfico formando un complejo insoluble
que luego se revela por coloracin.
Se realiza en cuatro etapas:
1-Separacin de protenas mediante electroforesis en gel de agarosa. Se separan las
protenas plasmticas en un gel de agarosa que tiene 5 calles, como en una
electroforesis normal.
2-Inmunofijacin (inmunoprecipitacin) de las protenas separadas. Se hace una
incubacin del gel con antisueros especfico (IgM, IgG, IgA, cadenas kappa, cadenas
lambda) en cada calle del gel, durante 30 minutos a 30-40 C. Los carriles de
migracin electrofortica apropiados son recubiertos con los antisueros individuales,
los cuales difunden dentro del gel y precipitan los antgenos correspondientes cuando
estan presentes. Las protenas del carril de referencia son fijadas con una solucin
fijadora.
3-Prensado y lavado. Las protenas solubles no precipitadas se eliminan del gel
mediante un blotting y un lavado. La precipitacin del complejo antgeno-anticuerpo
queda fijada en la matriz del gel.
7.5.3. GAMMAPATAS MONOCLONALES
El componente monoclonal, llamado tambin paraprotena o disglobulinemia o
gammapata monoclonal, se refiere a una produccin excesiva de un tipo de
inmunoglobulina. El aumento en la proliferacin de un clon especfico de linfocitos B
hiperestimulados o malignos genera una poblacin homognea de inmunoglobulina
monoclonal.
Tipos de gammapatas monoclonales:
I.- MALIGNAS:
 1. Mieloma Mltiple
2. Variantes de Mieloma:
- Mieloma Quiescente
- Mieloma No Secretor
- Leucemia de Clulas Plasmticas
- POEMS
3. Plasmocitomas localizados
- Plasmocitoma seo Solitario
- Plasmocitoma Extramedular
4. Macroglobulinemia de Waldenstrm
5. Amiloidosis Primaria
II.- NO MALIGNAS:
1. Gammapata Monoclonal de Significado Indeterminado
2. Gammapatas secundarias
7.5.4. TIPOS DE COMPONENTES MONOCLONALES
- Hiperproduccin selectiva de inmunoglobulina monoclonal ( G,A,M y en menor
frecuencia D y E), componente monoclonal que puede ser benigno o maligno.
- Hiperproduccin de cadenas livianas libres monoclonales (aproximadamente el 5% de
los casos).Esto es el incremento excesivo en la biosntesis de cadenas livianas Kappa o
Lambda libres. Dicha anormalidad es encontrada exclusivamente en mieloma de
cadenas livianas maligno, generalmente asociado a hipogammaglobulinemia (GAM).
- Hiperproduccin de cadenas pesadas libres o llamada tambin enfermedad de
cadenas pesadas

8. ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO Y LA CLNICA.

8.1. USOS DIAGNSTICOS Y TERAPUTICOS DE LOS ANTICUERPOS

Tcnicas analticas/diagnsticas: miden generalmente fuera del organismo por tcnicas
in vitro algn parmetro

ELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad

WESTERN inmunoelectroforesis de protenas, inmunodeteccin
IMMUNOHISTOQUIMICA, biopsias, anatoma patolgica
NEFELOMETRIA turbidometra, determinacin Ig sricas
CITOMETRIA DE FLUJO Diagnstico de leucemias

Tcnicas teraputicas: diseadas para curar.

Tratamiento antineoplsico destruccin clulas tumorales

Tratamientos antiinflamatorios. Neutralizacin de mediadores proinflamatorios
Inmunoestimulacin con citocinas o vacunacin con antgenos
 8.2. USO DE ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO

Fundamento: Pueden ser utilizados como nanoherramientas capaces de

reconocer especficamente y a las que nosotros podemos sujetar, localizar o
medir.
Especificidad en el reconocimiento aportada por la regin Fab del anticuerpo.
Posibilidad de marcaje: radioactivo, enzimatico, fluorescente, con puente
biotina-avidina. Deteccin y medida.
Unin a soportes (magnticos o de plstico) por regin Fc. Separacin y
purificacin molecular y celular.

8.3. TERAPIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES

1.- ANTITUMORAL.
a) CONJUGADOS:
- RADIOCONJUGADOS (Fsforo, Estroncio, Yodo, Ytrio)
I-antiCD45 leucemias mieloides agudas
Zevalin antiCD20 de ratn vida corta Itrio 90
Bexxar antiCD20 de ratn Iodo131

- QUIMIOCONJUGADOS.

AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicina (CMA-676) produce especies

altamente reactivas que daan el DNA e inducen apoptosis. El antgeno CD33 se
endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33. Se emplea en leucemias
mieloides agudas.
AntiCD22 Conjugados con RNAsas se experimentan en linfomas.

b) NO CONJUGADOS:
- ACCIN ANTITUMORAL

AntiCD20 (Rituximab) para linfomas y Leucemias de clulas B.

AntiCD52 (Campath 1H) tumores de clulas B, enfermedad mnima residual,
rechazo de rganos e injerto contra husped, enfermedades autoinmunes.
AntiCD40 induce AICD en linfomas.
- SELECTIVA. Conjugados con partculas magnticas.

AntiCD34 para purificacin de clulas madre hematopoiticas (CD34+) por

seleccin inmunomagntica.
Permite purificar clulas madre a partir de sangre perifrica.

- ELIMINACIN DE CLULAS.

2.- TERAPIA ANTI-INFLAMATORIA.

- Anticuerpos anticitocina Anti-TNFa Infliximab

Neutralizan mediadores proinflamatorios

Tienen un efecto drstico efecto antiinflamatorio
Se usan en Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.

- Receptores solubles de TNF Etanercep

Tambin neutralizan TNF pero tienen vida ms corta.

- Quimeras con regin Fc. IgG. alargan vida media del receptor soluble

9. IDENTIFICACIN, PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE CLULAS

9.1. FACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING)

Anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son reconocidos en la superficie de
cada clula.
Clulas de los fenotipos seleccionados son reconocidas una a una y separadas en
funcin de las combinaciones de parmetros seleccionados.
Aplica un campo elctrico que desva trayectoria de cada de la clula hacia el
contenedor de fraccin deseado.
Se pueden clonar clulas de caractersticas especficas:
Caractersticas Metablicas de las Clulas: Nivel de pH, estado redox, nivel de calcio
Separacin de clulas que expresan un gen reporter (protenas fluorescentes)
 Separacin de poblaciones celulares en funcin de
expresin de diferentes antgenos (intra o extracelulares) a los
que se unen anticuerpos con marcaje fluorescente.
Separacin de poblaciones celulares en funcin de su tamao y complejidad interna
Contenido de ADN: Estudio de la fase de ciclo celular en la que se encuentra la clula
Separacin de clulas que han iniciado el proceso de muerte por apoptosis, de
clulas viables y clulas necrticas

9.2. MTODOS DE FASE SLIDA

Fijacin de anticuerpos por su regin Fc a una fase slida.
Panning: Se realiza la fijacin de los Ab a plstico. Las clulas portadoras del antgeno
se unen al soporte, despus se realiza un lavado y por ltimo la separacin mecnica o
qumica.

9.3. MACS (Magnetic Activated Cell Sorting)

- El sistema autoMACS (Miltenyi Biotec) permite la separacin automatizada de clulas
mediante bolas paramagnticas adheridas a la superfcie celular mediante anticuerpos
monoclonales.
- Anticuerpos unidos a micropartculas magnticas son retenidos en una matriz
ferromagntica (fase slida) cuando se aplica un campo magntico. Lavado y elucin
por eliminacin del campo magntico.
- Tiene capacidad para separar hasta 4 x 10 9 clulas en 5 minutos y realizar diferentes
procesos de separacin secuencialmente, con un enriquecimiento de la subpoblacin
inicial de hasta 10.000 veces.
9.4. CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ANTICUERPOS.
- Este mtodo est basado en la especificidad de la interaccin de los anticuerpos
monoclonales que se unen a antgenos de la superficie celular.
- Posteriormente, se adiciona un suero sin descomplementar. El compelemto se activa
y hay eliminacin de una subpoblacin que lleva un antgeno de membrana especfico.

10. REACCIONES DE PRECIPITACIN.

10.1. TTULO DE ANTICUERPOS.

El ttulo de Ac es la mayor dilucin que da una respuesta POSITIVA. El mtodo de
evaluacin puede ser midiendo la absorbancia a travs de la densidad ptica (DO), o
sea una DO mayor a la lnea de corte.

10.2. REACCIONES DE NEUTRALIZACIN.

Prueba utilizada para detectar inmunidad frente a virus.

La neutralizacin (Nt) mide actividad biolgica del virus por lo tanto requiere de
virus vivos para poder realizarse. Igualmente, se realiza en un sistema vivo.
El principio bsico de la prueba de Nt es la inhibicin (neutralizacin) de la
infeccin viral a la clula (cultivo o animal) por medio de los Acs especficos, por
lo tanto se neutraliza la accin del virus sobre el hospedero.
 Lectura de la placa

10.3. REACCIONES DE PRECIPITACIN.

Hay precipitacin de Ag y Ac cuando se combinan en proporciones de equivalencia o
cercanas a ella. Estos mtodos se utilizan para examinar la relacin entre diferentes Ag
y/o Ac.

La precipitacin se efecta sobre geles de agarosa.

10.1. INMUNODIFUSIN RADIAL SIMPLE (RID) O TCNICA DE MANCINI.
- Mtodo de cuantificacin de antgenos.
- til en inmunologa clnica para cuantificar fracciones plasmticas humanas como
ASH, Inmunoglobulinas, C3 y C4, factores de coagulacin.
Esquema de la tcnica:
- Placa de gel de agar con suero especfico en la matriz. Se incorpora el Ac especfico
en el gel de agarosa.
- Se hacen pocillos en el gel de agarosa y en ellos se depositan volmenes estndar de
suero con el Ag que se quiere detectar (Ig o protenas plasmticas).

- Fenmeno de difusin. Se deja en reposo 24 horas para que difunda y reaccionen Ag

y Ac (punto de equivalencia), formando un anillo de precipitacin.
 - Cuantificar. Se mide el dimetro del anillo. Halo
proporcional a la conc. de antgeno. Es una prueba
CUANTITATIVA.
- Para el calculo de resultados hay que construir una curva patrn a partir de unos
estndares que se ponen en el gel junto con las muestras problemas. Se representa
grficamente el cuadrado del dimetro del anillo frente a la concentracin de Ag.
- Se interpola en la curva el valor de cada muestra.

10.3.2. INMUNODIFUSIN DOBLE TIPO I (IDD-I).

- Prueba CUALITATIVA.
- Se vierte el gel de agarosa sobre portas y se deja gelificar (1-2% de agarosa a pH 7-
8.5).
- Se hacen dos pocillos y se deposita el Ag en uno de ellos y el Ac en el otro.
- Ag y Ac difunden y en el punto de encuentro de los dos, y s las concentraciones son
adecuadas, se produce una banda de precipitacin.
- Si en la solucin existen dos Ag reconocidos por el Ac, habr dos bandas.
- Se puede usar azul cromassie para teir las bandas.
 10.3.3. INMUNODIFUSIN DOBLE TIPO II (IDD-
II) U OUCHTERLONY.
Tambin es conocida como Agar gel immunodiffusion test (AGID).

Se puede utilizar para determinar la relacin Ag/Ac (prueba CUALITATIVA). Se

enfrenta a un suero con dos o ms Ag, y nos podemos encontrar con tres patrones
bsicos:
a) Identidad (los dos Ag tienen los mismo epitopos reconocidos por el suero): se forma
una banda de precipitacin con forma de arco continuo.

b) No identidad (se trata de Ag distintos): se forman bandas de precipitacin

independientes y no dan un arco continuo. Aparece una figura con forma de aspa.
c) Identidad parcial (los dos Ag comparte un epitopo, pero uno de ellos tiene un
epitopo extra que es reconocido por el suero): se forma un arco de precipitacin al que
le sale un espoln.