You are on page 1of 14

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Penelitian

Penelitian dilakukan di Poliklinik Bedah Mulut Rumah Sakit Gigi dan

Mulut Prof. Soedomo Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Gadjah Mada dan

Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada

mulai bulan Maret sampai Mei 2016. Penelitian ini dinyatakan laik secara etik

oleh Komisi Etik Penelitian FKG UGM dengan surat Ethical Clearance No.

00533/KKEP/FKG-UGM/EC/2016.

Subyek penelitian datang ke Poliklinik Bedah Mulut Rumah Sakit Gigi

dan Mulut Prof. Soedomo Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Gadjah Mada

untuk pencabutan 2 gigi sekaligus menurut kriteria inklusi dan kriteria eksklusi.

Karakteristik subyek penelitian ditunjukkan pada tabel 3.

Tabel 3. Karakteristik subyek penelitian

No Jenis Kelamin Umur Gigi yang dicabut Diagnosis


Non GIC GIC
1 L 22 thn 36 45 Gangren
2 P 38 thn 37 47 Gangren
3 L 28 thn 46 36 Gangren
4 P 39 thn 46 36 Gangren
5 L 29 thn 47 37 Gangren
6 P 38 thn 46 36 Gangren

Keterangan : non GIC = soket tanpa aplikasi GIC, GIC = soket dengan aplikasi GIC

Subyek penelitian enam orang yakni tiga orang laki-laki dan tiga orang

perempuan dengan rentang usia antara 22-39 tahun, rata-rata usia laki-laki 26

75
tahun sedangkan perempuan 38,3 tahun. Elemen gigi yang dicabut adalah gigi

posterior dengan diagnosis gangren pulpa (tabel 3).

Pencabutan gigi dilakukan dengan teknik atraumatik tanpa pembukaan

flap. Soket ekstraksi gigi perlakuan dan kontrol dibiarkan terbuka tanpa

penjahitan. Proses penyembuhan soket ekstraksi gigi pasca aplikasi GIC pada

keenam pasien secara klinis tampak normal.

Pemeriksaan qPCR dilakukan menggunakan mesin qPCR (Light Cycler,

Jerman). Masing-masing sampel diproses secara single tanpa pengulangan. Data

yang diperoleh berupa Ct OCN, Ct gen referensi/HKG/GAPDH tanpa aplikasi

GIC dan aplikasi GIC seperti tampak pada tabel 4.

76
Tabel 4. Threshold Cycle mRNA OCN dan GAPDH jaringan soket ekstraksi gigi

Ct OCN Ct GAPDH Ct non Ct =


Hari Pasien
non GIC GIC non GIC GIC
Ct GIC R = 2- Ct
GIC Ct GIC - Ct non GIC

0 1 22,98 22,15 30,62 27,66 -7,64 -5,51 2,13 0,23


2 24,63 25,09 28,53 25,19 -3,9 -0,1 3,8 0,07
3 23,33 20,61 22,63 24,63 0,7 -4,02 -4,72 26,35
4 25,15 30,27 34,13 33,13 -8,98 -2,86 6,12 0,01
5 22,04 22,77 26,1 24,99 -4,06 -2,22 1,84 0,28
6 24,17 24,89 21,8 19,71 2,37 5,18 2,81 0,14
Rerata 23,72 24,30 27,30 25,89 4,52
SD 1,15 3,38 4,75 4,40 10,70
3 1 23 26,9 26,05 20,49 -3,05 6,41 9,46 0,00
2 22,3 23,3 20,52 20,76 1,78 2,54 0,76 0,59
3 22,5 24,05 22,23 21,91 0,27 2,14 1,87 0,27
4 25,23 22,62 20,66 21,52 4,57 1,1 -3,47 11,08
5 25,47 22,6 24,06 22,89 1,41 -0,29 -1,7 3,25
6 26,07 25,95 25,15 19,44 0,92 6,51 5,59 0,02
Rerata 24,10 24,24 23,11 21,17 2,54
SD 1,68 1,80 2,33 1,20 4,36
14 1 27,32 26,06 25,7 22,12 1,62 3,94 2,32 0,20
2 25,48 25,94 19,45 20,65 6,03 5,29 -0,74 1,67
3 25,72 25,93 20,34 20,62 5,38 5,31 -0,07 1,05
4 23,13 27 22,04 21,07 1,09 5,93 4,84 0,03
5 26,69 26,54 22,97 23,24 3,72 3,3 -0,42 1,34
6 24,81 25,23 20,67 19,74 4,14 5,49 1,35 0,39
Rerata 25,53 26,12 21,86 21,24 0,78
SD 1,47 0,60 2,26 1,25 0,67

Keterangan:
OCN = Osteocalcin, GAPDH = glyceraldehyde 3-phosphate-dehydrogenase (housekeeping gene/gen referensi), Non GIC = tanpa aplikasi GIC, GIC = aplikasi
GIC, Ct = Threshold cycle, Ct OCN = Threshold cycle OCN, Ct GAPDH = Threshold Cycle GAPDH, Ct Non GIC = Ct Non GIC OCN - Ct Non GIC
GAPDH, Ct GIC = Ct GIC OCN Ct GIC GAPDH, Ct = Ct GIC Ct Non GIC, R= 2Ct (rasio/perbandingan ekspresi gen OCN kelompok perlakuan
dengan kontrol menurut Livak dan Schmittgen (2011))

77
Threshold Cycle (Ct) menunjukkan reaksi ketika jumlah amplikon yang

dihasilkan cukup untuk memberikan sinyal fluoresensi di atas nilai threshold,

semakin tinggi konsentrasi suatu gen semakin rendah Ct yang didapatkan

(McPherson dan Moller, 2006). Nilai rata-rata Ct OCN kelompok kontrol dan

perlakuan seluruh subyek penelitian hari ke- 0, 3, dan 14 ditunjukkan pada tabel 5.

Tabel 5. Rerata Ct (Threshold Cycle) non GIC dan GIC


Hari GIC Non GIC
0 24,30 23,72 1,15

3 24,24 24,10 1,68

3,38
14 26,12 25,53 1,47

1,80
0,60
Tabel 5 menunjukkan variasi Ct pada kelompok kontrol non GIC dan

perlakuan GIC hari ke-0, 3 dan 14. Konsentrasi OCN pada kelompok kontrol

menurun dari hari ke-0, 3 dan 14 sedangkan pada kelompok perlakuan tidak

tampak perbedaan signifikan antara hari ke-0 dengan hari ke-3 tetapi menurun

pada hari ke-14 (Ct kelompok kontrol meningkat dari hari ke-0, 3 dan 14

sedangkan Ct pada kelompok perlakuan sama antara hari ke-0 dengan hari ke-3

dan meningkat pada hari ke-14).

Nilai Ct OCN kelompok perlakuan GIC dan kontrol non GIC

ditunjukkan pada gambar 9.

Ct O CN p a si en 2 Ct O CN p a sien 1
27.32

Non GIC GIC Non GIC GIC


26.06
25.94
25.48
25.09
24.63

26.9
22.98
22.15
23.3
22.3

23

Hari 0 H ar i 3 Hari 1 4 Hari 0 Hari 3 h ar i 1 4

78
Ct O CN p a si e n 3 Ct O CN p a si en 4
non GIC GIC non GIC GIC

30.27
25.93
25.72
24.05
23.33

25.23
25.15

24.05
22.5
20.16

23.13
27
h ar i 0 hari 3 hari 1 4 h ar i 0 h ar i 3 h ar i 1 4

Ct O CN p a si en 5 Ct O CN p a si en 6
26.69
26.54

Non GIC GIC non GIC GIC


26.07
25.95
25.47

25.23
24.89

24.81
24.17
22.77
22.04

22.6

H ar i 0 h ar i 3 Hari 1 4 h ar i 0 h ar i 3 hari 1 4

Gambar 10. Diagram nilai Ct OCN kelompok perlakuan dan kontrol

79
Nilai Ct merupakan selisih nilai Ct gen target OCN dengan nilai Ct

GAPDH pada kelompok perlakuan dan kontrol, Ct GIC untuk kelompok

perlakuan dan Ct non GIC untuk kelompok kontrol. Nilai Ct GIC dan Ct Non

GIC digunakan untuk menghitung nilai Ct dimana Ct = Ct GIC - Ct Non

GIC. Rasio (R) merupakan perbandingan ekspresi OCN antara kelompok

perlakuan dan kontrol yang dihitung berdasarkan rumus R= 2 -Ct (Livak dan

Schmittgen, 2001).

Nilai rerata rasio ekspresi OCN kelompok kontrol dan kelompok

perlakuan hari ke-0, 3, dan 14 terlihat pada tabel 6.

Tabel 6. Rerata dan standar deviasi rasio ekspresi mRNA OCN

Waktu pengamatan n Rerata dan SD


Hari ke-0 6 4,51 10,70
Hari ke-3 6 2,54 4,36
Hari ke-14 6 0,78 0,67

Berdasarkan tabel 6 diketahui bahwa rata-rata rasio ekspresi OCN pada

hari ke-0 sebesar 4,5110,70, menurun pada hari ke-3 menjadi 2,544,36 dan

menurun lagi pada hari ke-14 menjadi 0,78 0,67. Kondisi tersebut dapat dilihat

pada gambar 11 berikut:

80
5.00
4.50 4.51
4.00
3.50

Ekspresi osteocalcin
3.00
2.50 2.54
2.00
1.50
1.00
0.78
0.50
0.00
Hari ke-0 Hari ke-3 Hari ke-14
Waktu pengamatan

Gambar 11.Grafik rasio OCN hari ke-0, 3 dan 14.

Uji sebaran data menggunakan uji Shapiro Wilk diperoleh ekspresi

Osteocalcin pada hari ke-0 dan hari ke-3 tidak berdistribusi normal sehingga

dilakukan transformasi data dengan hasil uji normalitas dan uji homogenitas pada

tabel 7 berikut :

Tabel 7. Hasil uji normalitas data dan uji homogenitas varian

Waktu pengamatan Uji Normalitas Uji Homogenitas


p value p value
Hari ke-0 0,311
Hari ke-3 0,926 0,338
Hari ke-14 0,293

Hasil uji Shapiro Wilk menunjukkan bahwa semua kelompok data

memiliki sebaran yang normal (p>0,05). Hasil uji homogenitas varian ekspresi

osteocalcin dari waktu ke waktu menggunakan uji Sphericity menunjukkan hasil

yang homogen dengan nilai signifikansi 0,338 (p>0.05) sehingga pengolahan data

dapat dilanjutkan dengan analisis parametrik Repeated Measure Anova.

Tabel 8. Hasil uji Repeated Measure Anova ekspresi osteocalcin aplikasi GIC pada soket
ekstraksi gigi

81
Sumber Variasi p value
Waktu pengamatan 0,710

Pada tabel 8 terlihat bahwa berdasar sumber variasi waktu pengamatan

menunjukkan nilai p sebesar 0,710 (p>0,05) yang berarti tidak terdapat perbedaan

bermakna ekspresi mRNA OCN aplikasi GIC pada soket ekstraksi gigi pada hari

ke-0, ke-3, dan ke-14.

B. Pembahasan

Penelitian ini dilakukan untuk melihat dan mengkaji pengaruh aplikasi

GIC terhadap ekspresi mRNA OCN jaringan dari soket ekstaksi gigi

menggunakan teknik qPCR. Real time quantitative PCR merupakan metode

analisis kuantitatif untuk menghitung jumlah mRNA dalam sampel biologis

(Hugget dkk., 2005). Keunggulan pemeriksaan qPCR dalam kuantifikasi ekspresi

gen dibanding teknik lain adalah data yang diperoleh akurat dan tidak

memerlukan manipulasi post amplifikasi. Real time PCR 10000-100000 kali lebih

sensitif daripada RNase protection assay dan 1000 kali lebih sensitif daripada dot

blot hybridization. Kerugian menggunakan teknik ini adalah reagennya mahal

(Wong dan Medrano, 2005).

Keberhasilan pemeriksaan qpCR tergantung beberapa faktor antara lain

manipulasi sampel, teknik pipetting dan validasi housekeeping gene. Sampel

jaringan segera dimasukkan dalam RNAlater RNA stabilization untuk mencegah

terjadinya kontaminasi. Sampel yang disimpan dalam jangka waktu lama

sebaiknya disimpan pada suhu -700 C untuk mencegah degradasi OCN. Sampel

penelitian untuk melihat ekspresi OCN sebaiknya segera diproses karena OCN

82
tidak stabil dan cepat mengalami degradasi (Lee dkk, 2000). Penelitian in vitro

Garnero dkk (1994) menyatakan bahwa OCN intak mengalami degradasi 17%

setelah 2 jam inkubasi pada suhu ruang, oleh sebab itu sampel harus segera

diproses untuk mencegah degradasinya. Osteocalcin sensitif terhadap freeze-thaw

cycles dan hemolisis. Pengulangan freeze-thaw cycles mengurangi immunoreaktif

OCN sampai 40% (Lee dkk, 2000) sehingga berpengaruh pada jumlah ekspresi

gen yang diamati. Penelitian menggunakan qPCR umumnya duplicate atau

triplicate sehingga dapat melihat jika ada kontaminasi selama proses qPCR dan

nilai rata-rata Ct yang diperoleh lebih valid, tetapi pada penelitian ini masing-

masing sample diproses single.

Quantitative real time RT-PCR merupakan teknik yang sangat berguna

dalam menghitung ekspresi gen pada level mRNA. Ekspresi gen yang diamati

harus dibandingkan dengan gen kontrol mRNA tertentu. Jumlah mRNA yang

diamati fluktuatif antara lain karena perbedaan massa jaringan dan jumlah sel.

Idealnya, kondisi eksperimental seharusnya tidak mempengaruhi ekspresi gen

internal kontrol (Ullamnova dan Haskovec, 2003). Menurut Hugget dkk (2005),

housekeeping gene digunakan sebagai kontrol internal terhadap kualitas RNA

untuk menjamin kemurnian total RNA. GAPDH merupakan salah satu gen

referensi yang paling banyak digunakan (de Jonge dkk, 2007), karena ekspresinya

yang sangat stabil pada berbagai perlakuan (Hugget et al., 2005) dan banyak

penelitian menunjukkan keberhasilan menggunakan GAPDH sebagai HKG.

Menurut Bustin (2002), actin dan GAPDH tidak cocok digunakan sebagai

internal reference pada beberapa penelitian akibat variabilitasnya, oleh sebab itu

perlu dilakukan validasi internal reference untuk menghindari misinterpretasi.

83
Proses penyembuhan tulang terjadi secara alami melalui tahapan yang

saling tumpang tindih terdiri dari fase inflamasi, proliferasi dan remodeling. Fase

tersebut melibatkan proses selular yang terjadi secara terus menerus. Penelitian

Canuto dkk (2011) untuk melihat pengaruh Hydroxyapatite paste Ostim terhadap

ekspresi gen pada penyembuhan alveolar soket ekstraksi gigi dilakukan pada hari

ke-1, 7 dan 14, sedangkan pada penelitian ini pengaruh GIC terhadap ekspresi

mRNA OCN dilakukan pada hari ke-0, 3 dan 14.

Hasil penelitian (tabel 5) menunjukkan nilai rata-rata rasio ekspresi OCN

pada sampel perlakuan hari ke-0 nilainya 4,51 kali dibanding kontrol, hari ke-3

menurun menjadi 2,54 kali dibanding kontrol, dan hari ke-14 menurun lagi

menjadi 0,78 kali dibanding kontrol. Data tersebut menunjukkan penurunan rasio

ekspresi mRNA OCN dari hari ke -0, 3 dan hari ke-14. Rasio ekspresi mRNA

OCN yang semakin menurun pada periode pengamatan sama dengan penelitian

yang dilakukan oleh Canuto, dkk (2011). Pengaruh Hydroxyapatite paste Ostim

terhadap ekspresi mRNA OCN pada soket ekstraksi gigi berakar tunggal menurun

dari hari ke-1, 7 dan 14. Perbedaannya dengan penelitian ini terletak pada jumlah

sampel, usia rata-rata pasien, bahan yang diaplikasikan, banyaknya ekspresi gen

yang diamati serta waktu pengamatan.

Penelitian Itagaki dkk (2008) mengamati beberapa ekspresi gen pada

proses penyembuhan defek tulang kalvaria tikus menunjukkan bahwa ekspresi

kolagen dan OCN secara signifikan lebih tinggi pada minggu ke-2 jika

dibandingkan dengan sebelum dan sesudah minggu ke-2. Hasil penelitian Canuto

dkk (2011) dan penelitian ini berbeda dengan hasil penelitian tersebut, ekspresi

mRNA OCN menurun pada hari ke-14 (minggu ke-2) tetapi meningkat pada awal

84
inflamasi proses penyembuhan soket ekstraksi gigi. Ekspresi mRNA OCN tinggi

pada awal inflamasi menurut Gortz dkk (2004) sebagai akibat inflamasi

meningkatkan diferensiasi osteoblast secara langsung maupun tidak langsung.

Osteocalcin merupakan produk spesifik osteoblast (Price dan Parthemore, 1980).

Li dan DenBesten (1993) mengamati ekspresi mRNA protein tulang kultur

osteoblas tikus pada konsentrasi fluor fisiologis menyimpulkan bahwa fluor tidak

meningkatkan ekspresi protein seperti OCN selama fase proliferasi hari ke-5

sampai hari ke-11.

Kadar OCN serum terdiri atas 10-40% dari total OCN dalam tubuh

sedangkan selebihnya terikat pada matriks tulang. Half life OCN serum singkat

sehingga dihidrolisis pada ginjal dan liver (Lee dkk., 2000). Osteocalcin yang

dirilis di sirkulasi merupakan molekul intak yang baru disintesis oleh osteoblast

(Diaz dkk, 1998). Menurut Ingram dkk (1994), Osteocalcin mempunyai distribusi

berbeda tergantung usia dan jenis kelamin. Fares dkk (2003) menyatakan bahwa

dewasa muda laki-laki mempunyai konsentrasi Osteocalcin pada sirkulasi lebih

tinggi jika dibandingkan dengan dewasa muda perempuan pada usia yang sama

karena laki-laki mempunyai tulang yang lebih panjang dan lebih lebar, selain laki-

laki lebih lama mencapai puncak bone mineral density daripada perempuan (Szulc

dkk, 2007).

Konsentrasi OCN serum laki-laki usia 25-49 tahun menurun

(Hannemann dkk, 2013) jika dibandingkan dengan laki-laki usia paruh baya atau

tua (50-60 tahun) yang stabil atau sedikit meningkat (Gundberg dkk, 2002),

sedangkan pada perempuan konsentrasi OCN serum stabil pada saat pre

menopause 35-45 tahun (Ardawi dkk, 2010). Rata-rata usia subyek penelitian

85
laki-laki adalah 26 tahun mempunyai konsentrasi OCN serum rendah, sedangkan

rata-rata usia perempuan 38,3 tahun mempunyai konsentrasi OCN serum stabil

dan telah mencapai skeletal maturity dan fase stabil bone turnover (Glover dkk,

2008).

Osteocalcin merupakan vitamin K dependent, selain dipengaruhi oleh usia

dan jenis kelamin juga dipengaruhi oleh berbagai kondisi seperti pemakaian obat-

obatan antikonvulsan dan antikoagulan, glucocorticoid, penyakit tertentu seperti

osteomalacia, hyperthyroidism dan hypothyroidism serta pagets disease (Lee dkk,

2000). Hormon estrogen pada perempuan, testosteron pada laki-laki, parathyroid

hormone (PTH) juga berpengaruh terhadap konsentrasi OCN .

Aplikasi GIC pada soket ekstraksi gigi menggunakan takaran volume

yang sama, tetapi volume GIC di dalam soket tidak dapat dikendalikan oleh

peneliti mungkin berpengaruh terhadap hasil penelitian. Kelebihan penelitian ini

adalah penelitian eksperimental klinis aplikasi GIC pada soket ekstraksi gigi

dengan subyek manusia. Ekspresi mRNA OCN soket ekstraksi gigi dihitung

dengan teknik relative quantification qPCR.

86
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

1. Kesimpulan

Hasil penelitian menunjukkan bahwa secara statistik tidak terdapat

perbedaan signifikan ekspresi Osteocalcin antara kelompok perlakuan yang

diaplikasi GIC dengan kelompok kontrol tanpa aplikasi GIC pada soket ekstraksi

gigi (p = 0,710)

2. Saran

Penelitian klinis selanjutnya untuk melihat ekspresi mRNA Osteocalcin

disarankan untuk:

a. Memperbanyak jumlah subyek penelitian

b. Memperpanjang waktu pengamatan

87
c. Melakukan pemilihan housekeeping gene yang paling cocok sebelum

penelitian dilakukan

d. Sampel penelitian Real-Time qPCR diproses duplicate atau triplicate .

88