LABORATORIO ANLISIS QUMICO II

Prctica #9 .Prctica Cromatografa de Capa Fina, C. Columna y C. Microcolumna

PROFESORA. LUZ ANGELA CARREO DIAZ

Objetivos de la prctica.

Aprendizaje de las tcnicas de cromatografa en capa fina, Columna y micro-columa

Conocimiento de conceptos cromatogrficos: polaridad, fase mvil, fase estacionaria,

factor de retencin, etc.

Determinacin de los componentes orgnicos presentes en un pigmento de origen

vegetal.

Antecedentes.

La cromatografia es una tcnica de anlisis qumico utilizada para separar sustancias puras de
mezclas complejas. Esta tcnica depende del principio de adsorcin selectiva (no confundir con
absorcin). La cromatografa fue descubierta por el botnico ruso, de origen italiano, Mikhail
Tswett en 1906, pero su uso no se generaliz hasta la dcada de 1930. Tswett separ los
pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verdes en ter de petrleo
sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. A medida que
la solucin va filtrndose por la columna, cada componente de la mezcla precipita a diferente
velocidad, quedando la columna marcada por bandas horizontales de colores, denominadas
cromatogramas. Cada banda corresponde a un pigmento diferente.

La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de separacin: es aplicable a

cualquier mezcla soluble o voltil. De hecho las tcnicas de separacin suelen dividirse en dos
grandes grupos: cromatogrficas y no cromatogrficas. La eleccin de una tcnica
cromatogrfica concreta depender de la naturaleza y cantidad de la muestra, del objetivo de la
separacin y de las limitaciones del tiempo y equipo asequible.

Podemos distinguir 3 tipos de cromatografa dependiendo si la fase estacionaria/fase mvil es

slido/lquido, lquido/lquido o lquido/gas:

Si es slido/lquido, cabe distinguir entre:

Cromatografa de adsorcin: El slido adsorbe al componente que inicialmente estaba en

fase mvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals).

Cromatografia de intercambio inico: el slido es un cambiador de iones (fuerzas

electrostticas).

Cromatografia de exclusin (o de geles): el slido es un gel formado por polmeros no

inicos porosos que retienen a las molculas de soluto segn su tamao.

Cromatografia de afinidad: es un tipo especial de cromatografia de adsorcin, utilizada

especialmente en bioqumica, en la que un slido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad
que puede ser por ejemplo, un indicador enzimtico o un anticuerpo.

Si es lquido/lquido, cabe distinguir:

Cromatografa de particin: el soluto se reparte entra la fase mvil (liquido o gas) y la fase
estacionaria.

Si es lquido/gas, cabe distinguir entre:

Cromatografa gas-liquido (CGL), que es una cromatografa de particin.

Cromatografa gas-slido (CGS), que es una cromatografa de adsorcin.

Si es un fluido supercrtico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura

critica, pero simultneamente comprimido a una presin mayor que su presin critica), se trata
de la cromatografa de fluidos supercrticos (CFS), que puede ser de particin o de adsorcin.

Las tcnicas cromatogrficas, segn el dispositivo utilizado para conseguir la separacin entre la
fase mvil y la estacionaria, pueden ser: en columna y plana.

Cromatografa en columna: Se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se coloca la fase

estacionaria y a su travs se hace pasar la fase mvil. El flujo de la fase mvil (liquido o gas) a
travs de la estacionaria se consigue:

1) por presin,

2 )por capilaridad,

3) por gravedad.

Cromatografia plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en
realidad es tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede
considerarse bidimensional. Se divide en dos tipos generales:

1. -Cromatografa en papel: en la que el papel absorbente acta como soporte de la fase

estacionaria (cromatografia de particin). Una muestra lquida fluye por una tira vertical de
papel absorbente, sobre la cual se van depositando los componentes en lugares especficos.

2. -Cromatografa en capa fina: en la que un slido acta como fase estacionaria (cromatografia
de particin), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio.

El uso de la cromatografa est ampliamente extendido en el anlisis de alimentos, medicinas,

sangre, productos petrolferos y de fisin radiactiva.

Procedimiento experimental.

Materiales:

placas de cromatografa, columnas de vidrio, pipetas Pasteur

vasos de precipitado de 100ml

soporte metlico con pinzas, pinzas Mohr, pedazo de icopor

tubos para centrfuga, gradilla y tubos de ensayo, mortero con pistilo

Varillas de vidrio
Reactivos:

Acetona de lavar

Acetato de etilo, hexano, ter etlico, ter de petrleo, acetona, metanol, agua y en
general los solventes includos en la serie elutrpica.

Extracto de pigmento de origen vegetal bien concentrado.

Preparacin del extracto de muestra

Preparacin del extracto. Si utiliza espinaca, elimine las grandes venas de las hojas. En un
mortero con un poco de cuarzo y polvo de CaCO3 (para neutralizar los cidos orgnicos) macere
completamente los 2 g de hojas. Incorpore unos 7 ml de acetona, o ms si es necesario, y
contine moliendo hasta obtener un homogeneizado bien concentrado. A continuacin filtre o
centrifugue; luego, con el extracto as obtenido, realice los ensayos cromatogrficos.

PRCTICA CROMATOGRAFA DE CAPA DELGADA

Obtencin de capilares:

Para la realizacin de los capilares, se tomar una varilla de vidrio de unos 15 cm

aproximadamente, esta ser calentada en un mechero Bunsen hasta que se reblandezca la
seccin que estamos calentando. Llegado a este punto, apartamos la varilla de la llama y
rpidamente estiramos axialmente.

Realizacin de la cromatografa en capa fina:

En este apartado se realizarn las placas de cromatografa

cortadas en pequeas tiras de 2.5 x 5 cm, las cuales solo se
podrn coger por los bordes y nunca tocar la parte de celulosa
(la blanca), porque ello acarreara errores en la medicin.

Una vez obtenidas las placas, marcamos a lpiz una lnea a 1 cm

de la base. Sobre esa lnea se depositar con el capilar pequeas
cantidades de la muestra. Se espera que el solvente se evapore
y se coloca otra toque para al final tener una pequea mancha
de muestra concentrada sobre el mismo punto.

En los vasos de precipitado, que actan como tanque de elucin, se pondrn las disoluciones a
emplear como fase mvil. Solamente utilizaremos 5 ml de cada solvente puro o mezcla, la cual
no debe sobrepasar la lnea dibujada a lpiz sobre la
placa.

Resultados.

Para el clculo del factor de retencin, Rf, se usar la

siguiente expresin:
 Rf = distancia recorrida por el compuesto / distancia recorrida por el disolvente

Se tomar como distancia del compuesto la distancia comprendida entre la lnea trazada donde
se ha depositado el compuesto y el centro de la mancha.

PRCTICA CROMATOGRAFA DE COLUMNA

PROCEDIMIENTO:

1. Use un alambre para colocar un tapn de algodn en el fondo de la columna. La

cantidad de algodn debe ser suficiente para evitar que el adsorbente se salga de la
columna pero un exceso de algodn y empacado fuertemente puede ocasionar que el
solvente no fluye a una velocidad aceptable.
2. Coloque la columna en un soporte con una pinza adecuada y llene la parte curva de la
porcin inferior de la columna con arena. Colocar una pinza de presin en la manguera
flexible de la parte inferior de la columna. Llenar la columna 1/4 a 1/3 con el eluente
inicial.

Preparar en un vaso de precipitados una mezcla de

adsorbente con el mismo solvente que se ha
colocado en la columna. (La relacin de la mezcla
debe ser 1:2 en volumen).

3. Rpido pero cuidadosamente coloque la

mezcla de adsorbente-solvente en la
columna. Agite y deje caer inmediatamente
la mayor cantidad de mezcla que se
requiera para llenar la columna ayudndose
con una varilla de vidrio para hacer la
transferencia.
4. Retire la pinza de la manguera y deje
drenar el solvente de la columna en otro
vaso de precipitados limpio y seco para que
el solvente se pueda re-utilizar. Para que el
adsorbente se deposite uniformemente en
la columna es bueno dar pequeos golpes
con un pedazo de manguera en la columna.
5. Una vez se ha alcanzado la altura de relleno
que se quiere se puede colocar una
pequea capa de arena adicional encima
del adsorbente.
 Cargando la
muestra en la
columna:

8. El

eluente cuando ya la columna est cargada debe estar apenas por encima de la capa
superior de arena. La columna nunca se debe dejar secar.
9. Usando una pipeta Pasteur larga se adiciona la muestra en solucin encima de la capa
de arena.
10. Se drena eluente hasta que la muestra est justo encima del adsorbente y no sobre la
capa de arena.
Elucin de la muestra:

10. Una vez se tiene la muestra sobre el adsorbente se puede empezar el proceso de
elucin. Para no perturbar la parte superior de la columna agregando directamente el
solvente es una mejor idea agregar el solvente cuidadosamente usando una pipeta.
11. Adicionar ms eluente como sea necesario. El solvente eludo antes de que empiece a
eluir la muestra puede ser reutilizado.

Anlisis de las Fracciones:

Si los compuestos separados en la columna son coloreados, el progreso de la separacin se

puede monitorear visualmente. Sin embargo, la mayora de los compuestos que en la prctica
se requiere separar son incoloros. En este caso, se requiere tomar pequeas fracciones de
eluente secuencialmente y en frascos marcados; luego se debe determinar la composicin de
cada fraccin usando alguna tcnica espectroscpica como IR, para estar seguros que en cada
fraccin hay un solo compuesto se puede hacer anlisis de capa delgada lo que a su vez
permite saber cules fracciones pueden ser combinadas porque contienen el mismo compuesto.
Otros Comentarios:

El xito de la separacin depender en gran medida de que tan bien empacada est la
columna as como de que la muestra se hay introducido en la columna correctamente.
Es importante que tener la capa de arena sobre el adsorbente.
Si la columna se seca y se han formado grietas la columna debe empacarse de nuevo.

PRCTICA CROMATOGRAFA DE micro-COLUMNA

Procedimiento para Cromatografa de Columna en microescala

La cromatografa de columna en microescala es el mtodo a usar para

controlar reacciones orgnicas y en general separaciones sencillas Debido a
que es un mtodo fcil y ambientalmente amigable. La limitante es que
puede separar nicamente pequeas cantidades de muestra (hasta 25 mg
de muestra)

Procedimiento para empacar la columna

Estas columnas se pueden preparar igualmente por los mtodos seco o

slurry.

Mtodo de empacado en seco

Este mtodo es ms fcil, pero puede llevar a la formacin de burbujas en

la columna. A la columna vaca se le coloca una cantidad pequea de lana
de vidrio o algodn. Se sostiene la columna en posicin vertical con una
pinza y un soporte adecuados. Se llena la columna con el solvente y se
cierra la llave de la columna. Usando un embudo seco se adiciona el
adsorbente en la cantidad adecuada permitiendo que drene parte del
solvente para evitar que por el volumen del slido llene demasiado la
columna y se desborde. Dejar que el slido se vaya depositando en la
columna mientras cuidadosamente se golpea la columna con un lpiz o un
pedazo de manguera para que el adsorbente se deposite de manera
uniforme sin formar burbujas. Drenar el solvente hasta que su nivel este
apenas unos milmetros sobre el nivel del empaque slido de la columna.

Procedimiento para cromatografa de microescala

En este tipo de cromatografa, la columna no necesita llave se emplea

Simplemente una pipeta Pasteur y para ejercer presin simplemente se
aplica aire a presin con una pera para pipetas Pasteur ordinaria.

1) Preparacin de la columna
La columna se prepara usando el mtodo seco
Colocar una pequea cantidad
de algodn como tapn para
evitar que el slido adsorbente
se drene de la columna.
Coloque la slica gel en la pipeta
Simplemente invirtiendo la pipeta y
colocndola dentro del frasco que
contiene el slido y llenndola a
modo de cuchara

Voltee la pipeta y deje Otra forma de llenado es dejando caer el

acomodar el slido antes de slido en la pipeta que contiene
repetir la operacin. solvente.
 Una vez la pipeta esta empacada por
debajo del cuello se coloca en un
Con cualquiera de los dos soporte y se sostiene con una pinza
mtodos al final se dan adecuada.
pequeos golpes para
acomodar el slido en la pipeta
sin que se formen burbujas.

(2) Pre-elucin de la columna

Normalmente la columna se preeluye con un solvente no polar como

hexano.

Se adiciona el hexano y se deja

pasar por toda la columna sin
dejar que el nivel superior de
hexano este por debajo del
nivel del slido. Una vez el
hexano alcanza el nivel inferior
del adsorbente la columna se
encuentra lista para la agregar
la muestra.
(3) Cargue la muestra en la microcolumna

La muestra a ser purificada (o separada en los componentes) se disuelve en

una pequea cantidad de solvente tal como hexano, acetona, u otro
solvente adecuado. Esta solucin se carga en la parte superior de la
columna.

(4) Elucin de la columna

Force el solvente a pasar a travs de la
columna usando una pera para pipetas
Pasteur. La presin debe ejercerse cuidando
que el adsorbente en ningn momento se
seque adicionando ms solvente a la columna
cuando sea necesario.

La serie de 5 fotos mostrada abajo

muestran como el compuesto coloreado se
desplaza a travs de la columna despus
de aplicar presin y solvente
sucesivamente a la columna.

Las dos ltimas fotos ilustran el proceso de

recoleccin de fracciones de la muestra
coloreada.