Anlisis Instrumental

Mdulo Analtico

Gua Laboratorio y Problemas

Actualizada 2do Cuatrimestre 2016
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IMPORTANTE Nuevas correlatividades.

A partir de Abril de 2013 las correlatividades vigentes para cursar los TP y para dar Final de
Anlisis Instrumental sern:
Para cursar
1 - Con examen final aprobado: Qumica Analtica, Qumica Orgnica II y Qumica Biolgica.
2 - Con los TP aprobados: Qumica Fsica I
Para dar el final
Las indicadas en los puntos 1 y 2 anteriores, ms el examen final aprobado de Fsica II.

Los alumnos que hubieran aprobado los trabajos prcticos con anterioridad al ciclo lectivo 2013
tendrn la posibilidad de rendir los correspondientes exmenes finales con las correlatividades
exigidas en el momento de su cursada.
Desde el ao 2011 los temas de final de la parte de QB son muy diferentes, y los de QA han
cambiado levemente. Las tericas correspondientes estn en esta pgina web:
www.qi.fcen.uba.ar/materias/ai/

Introduccin y objetivos
Durante esta materia, y en particular en el Modulo Analtico - Biolgico, se vern varias de las
principales tcnicas instrumentales de medicin de parmetros qumicos y biolgicos. Se estudian
cuestiones bsicas como ruido, adecuacin de la seal, selectividad y sensibilidad, robustez,
parmetros de mrito, como tambin temas aplicados, incluyendo tcnicas usuales de biologa
molecular.
El Mdulo Analtico - Biolgico consta de dos clases semanales tericas de 2 horas de duracin
cada una y asistencia optativa (aunque recomendable), y dos clases semanales de laboratorio o
problemas de asistencia obligatoria.

Turno Da y Hora
Teo Ma y Ju de 18 a 20 Hs
Lab Maana Ma y Ju de 8:30 a 12:30Hs
Lab Tarde Ma y Ju de 13:30 a 17:30Hs
Lab Noche Mi y Vi de 18 a 22Hs

Se formaran 6 grupos, de 3 o 4 alumnos, los cuales rotaran por distintas actividades.

Practicas a desarrollar:
- Cromatografa Gaseosa Anlisis Cualitativo pag. 7
- Cromatografa Gaseosa Anlisis Cuantitativo pag. 12
- Cromatografa Liquida de Alta Resolucin pag. 14
- Espectroscopia de Absorcin y Emisin Atmica pag. 20
- Imaging de pH en dos dimensiones. pag. 25
- Problemas de Anlisis Instrumental pag. 34

Luego del primer parcial, todos juntos desarrollaran los siguientes dos TPs:
- Espectroscopia de Emisin Molecular pag. 30
- Problemas pag. 46

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Seguridad en el laboratorio

Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de normas preventivas destinadas a

proteger la salud de los que all se desempean frente a los riesgos propios derivados de la
actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su mbito de trabajo, como
hacia el exterior.
Las reglas bsicas aqu indicadas son un conjunto de prcticas de sentido comn realizadas en
forma rutinaria. El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la informacin que
permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Ser fundamental la
realizacin meticulosa de cada tcnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente
puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja.

1- Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales

como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignfugas, lavaojos, gabinete para contener
derrames, accionamiento de alarmas, etc.
2- No se permitir comer, beber, fumar o maquillarse.
3- No se debern guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que contengan reactivos.
4- Se deber utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello recogido
(guardapolvo preferentemente de algodn y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso
de accesorios colgantes).
5- Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la
zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.
6- Las manos deben lavarse cuidadosamente despus de cualquier manipulacin de laboratorio y
antes de retirarse del mismo.
7- Se debern utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias qumica o material
biolgico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deber tocar objetos, ni
superficies, tales como: telfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc.
8- No se permitir pipetear con la boca.
9- No se permitir correr en los laboratorios.
10- Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarn
anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos de proteccin. Cuando se
manipulen productos qumicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitar el
uso de lentes de contacto.
11- No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, mquinas u otros elementos
que entorpezcan la correcta circulacin.
12- Todo material corrosivo, txico, inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo deber estar
adecuadamente etiquetado.
13- No se permitirn instalaciones elctricas precarias o provisorias. Se dar aviso inmediato a la
Secretara Tcnica en caso de filtraciones o goteras que puedan afectarlas instalaciones o equipos
y puedan provocar incendios por cortocircuitos (Interno 355).
14- Se requerir el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de produccin de
aerosoles (mezcla de partculas en medio lquido) o polvos, durante operaciones de pesada de
sustancias txicas o biopatgenas, apertura de recipientes con cultivos despus de agitacin, etc.
15- Las prcticas que produzcan gases, vapores, humos o partculas, aquellas que pueden ser
riesgosas por inhalacin deben llevarse a cabo bajo campana.
16- Se deber verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de
ignicin. No se operar con materiales inflamables o solventes sobre llamas directa o cerca de las

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mismas. Para calentamiento, slo se utilizarn resistencias elctricas o planchas calefactoras
blindadas. Se prestar especial atencin al punto de inflamacin y de autoignicin del producto.
17- El material de vidrio roto no se depositar con los residuos comunes. Ser conveniente ubicarlo
en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plsticas. El que sea necesario reparar
se entregar limpio al taller.
18- Ser necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y deba ser
descartado sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente apropiado y luego con
agua varias veces.
19- Est prohibido descartar lquidos inflamables o txicos o corrosivos o material biolgico por los
desages de las piletas, sanitarios o recientes comunes para residuos.
En cada caso se debern seguir los procedimientos establecidos para la gestin de residuos.
Consultar al Servicio de Higiene y Seguridad (Interno 275).
20- Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (ms de 5
litros.) deber tenerse a mano un extintor apropiado para ese material en cuestin.
21- Cuando se trasvase material combustible o inflamable de un tambor a un recipiente ms
pequeo, realice una conexin con una cadena del tambor a tierra y con otra entre el tambor y el
recipiente de manera de igualar potenciales y eliminar la posible carga esttica.
22- Al almacenar sustancias qumicas considere que hay cierto nmero de ellas que son
incompatibles pues almacenadas juntas pueden dar lugar a reacciones peligrosas. Ante dudas
consultar al Servicio de Higiene y Seguridad (Interno 275).
23- No almacene en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas, hgalo en estantes bajo
mesadas y en caso de cidos o lcalis concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidas dentro
de lo posible en bandejas de material adecuado.
24- Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben asegurarse en posicin vertical con
pinzas, grampas y correas o cadenas a la pared en sitios de poca circulacin, protegidos de la
humedad y fuentes de calor, de ser posible en el exterior.
25- Los laboratorios contarn con un botiqun de primeros auxilios con los elementos
indispensables para atender casos de emergencia.
26- Se informar al Dpto. de Seguridad y Control cuando se necesiten dejar equipos funcionando
en ausencia del personal del laboratorio.

Recuerde!: USTED tambin es responsable de la seguridad en su lugar de trabajo.

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Procedimientos ante emergencias:

Emergencias mdicas
Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o ingestin accidental de
algn producto qumico, txico o peligroso, se deber proceder:
1- A los accidentados se les proveern los primeros auxilios.
2- Simultneamente se tomar contacto con el Servicio Mdico (Interno 482), o al Servicio Mdico
de Deportes (4784-4351 / 3948)
3- Avise al Jefe de Laboratorio o autoridad del Departamento, quienes solicitarn asistencia de la
Secretara Tcnica (interno 380) para que enven personal del Dpto. de Mantenimiento, Seguridad
y Control o Servicios Generales segn correspondan.
4- El Jefe de Departamento notificar el accidente al Servicio de Higiene y Seguridad para su
evaluacin e informe, donde se determinarn las causas y se elaborarn las propuestas para
modificar dichas causas y evitar futuras repeticiones.
5- Centros para requerir ayuda mdica:

S.A.M.E. Telfono 107

Hospital Pirovano
Av. Monroe 3555 Tel.4542-5552 / 9279
INTOXICACIONES:
Hospital de Nios. Dr. R. Gutirrez
Snchez de Bustamante 1399. Capital Federal.Tel: 4962-6666.
Hospital de Nios. Dr. P. de Elizalde
Av. Montes de Oca 40 Tel. 4307-7491 Toxicologa 4300-2115
QUEMADURAS:
Hospital de Quemados P.Goyena 369 Tel. 4923-4082 / 3022
OFTALMOLOGA
Hospital Santa Luca San Juan 2021 Tel. 4941-7077
Hospital Dr. P. Lagleyze Av. Juan B. Justo 4151 Tel. 4581-0645 / 2792

Incendio:
1- Mantenga la calma. Lo ms importante es ponerse a salvo y dar aviso a los dems.
2- Si hay alarma, accinela. Si no grite para alertar al resto.
3- Se dar aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control (Interno 311) informando el lugar
y las caractersticas del siniestro.
4- Si el fuego es pequeo y sabe utilizar un extintor, selo. Si el fuego es de consideracin, no se
arriesgue y manteniendo la calma ponga en marcha el plan de evacuacin.
5- Si debe evacuar el sector apague los equipos elctricos y cierre las llaves de gas y ventanas.
6- Evace la zona por la ruta asignada.
7- No corra, camine rpido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. No utilice
ascensores. Descienda siempre que sea posible.
8- No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida.
9- Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se
encarguen.

Telfonos tiles
BOMBEROS Telfono 100

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DIVISIN CENTRAL DE ALARMA: 4381-2222 / 4383-2222 / 4304-2222.
CUARTEL V DE BELGRANO:
Obligado 2254 Capital Tel. 4783-2222
BOMBEROS DE VICENTE LPEZ
Av. Maip 1669 Vicente Lpez. Tel. 4795-2222
BOMBEROS DE SAN ISIDRO:
Santa Fe 650 Martnez. Tel. 4747-2222

Derrame de productos qumicos

1- Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada.
2- Notificar a las personas que se encuentren en las reas cercanas acerca del derrame. Coloque
la cinta de demarcacin para advertir el peligro.
3- Evacuar a toda persona no esencial del rea del derrame.
4- Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignicin, y las fuentes de calor.
5- Evite respirar los vapores del material derramado, si es necesario utilizar una mscara
respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame.
6- Ventilar la zona.
7- Utilizar los elementos de proteccin personal tales como equipo de ropa resistente a cidos,
bases y solventes orgnicos y guantes.
8- Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para ello extender los cordones en el
contorno del derrame.
9- Luego absorber con los paos sobre el derrame.
10- Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la bolsa roja y cirrela.
11- Comunquese con el Servicio de Higiene y Seguridad para disponer la bolsa con los residuos.
12- Si el derrame es de algn elemento muy voltil deje dentro de la campana hasta que lo retire
para su disposicin.
13- Lave el rea del derrame con agua y jabn. Seque bien.
14- Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido salpicados por el
derrame.
15- Lave los guantes, la mscara y ropa.

Declaro haber ledo las medidas de seguridad que aparecen en la gua de Trabajos Prcticos de
Anlisis Instrumental - Mdulo Analtico bajo los ttulos SEGURIDAD EN EL LABORATORIO y
PROCEDIMIENTOS ANTE EMERGENCIAS.

Fecha: .................................. L.U. N: ................................ Turno de Laboratorio:......................

Firma:.......................................

Aclaracin:.......................................

6
 CROMATOGRAFA GASEOSA

INTRODUCCION
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija y otra mvil.
En cromatografa gaseosa, la fase mvil es un gas que fluye a travs de una columna que
contiene a la fase fija. Esta fase fija puede ser un slido poroso (cromatografa gas-slido o CGS),
o bien una pelcula lquida delgada que recubre un slido particulado o las paredes de la columna
(cromatografa gas-lquido o CGL). En el primer caso, el proceso que produce la separacin es la
adsorcin de los componentes de la mezcla sobre la superficie slida y en el segundo, la particin
de los mismos entre las fases lquida y gaseosa. Por ser la ms utilizada, la discusin que sigue se
refiere a CGL.

INSTRUMENTAL
El instrumental utilizado en la cromatografa gaseosa se puede resumir en el siguiente esquema 1:

Esquema 1: esquema de un CG tpico (a) y del equipo real utilizado en esta prctica (b).

El gas portador (fase mvil) proviene de cilindros provistos con vlvulas reductoras de
presin. La muestra se introduce en el inyector con una microjeringa a travs de un septum de
goma. All se produce la vaporizacin instantnea de la misma y su introduccin en la corriente de
gas. La columna se halla dentro de un horno de temperatura variable, lugar donde se realiza la
separacin de los componentes de la muestra. El detector produce una seal elctrica proporcional
a la cantidad de materia a medida que cada componente separado fluye a travs de l. Esa seal
es enviada al registrador que realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo (cromatograma)
del tipo, ver esquema 2.

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 Esquema 2: Anlisis de un cromatograma (a) y un cromatograma tpico (b)

Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la

muestra original. El integrador (o el software de control) calcula adems el rea correspondiente a
cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de analito.

Parmetros relevantes
Tiempo de retencin (tr) de un dado componente de la muestra es el tiempo transcurrido
desde la inyeccin de la misma hasta la aparicin del mximo correspondiente al pico de ese
componente. Un caso especial lo constituye un componente que no es retenido por la fase fija (no
se reparte entre fases), el cual saldr de la columna antes que cualquier sustancia a un tiempo
llamado tiempo muerto (t0). De esta manera, es posible definir tr como el tiempo que un cierto
componente permanece retenido en la fase estacionaria:
tr = t0 + tr

El factor de capacidad (k) de un dado compuesto se define como:

que, en funcin de la constante de particin (K), del volumen de la fase fija (VL) y del volumen de la
fase mvil (VG) se puede escribir como:

y en funcin de los tiempos de retencin:

Con respecto a la columna, se define como plato terico a una capa estrecha de la misma en
donde se produce el equilibrio de particin de un compuesto entre la fase fija y la mvil. Para una
columna de longitud L, el nmero de platos tericos (N) es:

8
siendo H la altura de plato terico, uno de los parmetros que determina la capacidad del proceso
cromatogrfico para separar dos compuestos dados, y W el ancho de los picos extrapolada a la
altura de la lnea de base como se muestra en el esquema 2.

A partir de las definiciones anteriores, es posible definir parmetros asociados a la separacin de

dos sustancias A y B que caracterizan la eficiencia de una separacin. Siendo B la sustancia con
mayor tr estos parmetros son:

Factor de selectividad

Resolucin

Teniendo en cuenta que k, , N y H dependen de la temperatura, tipo de fase fija, longitud de

columna y flujo de fase mvil, es posible mejorar una separacin optimizando estos parmetros
experimentales.
Etapas del anlisis de una muestra
1. Optimizacin de las condiciones instrumentales.
2. Obtencin de los cromatogramas en condiciones ptimas (muestras y patrones).
3. Calibracin (diferentes tcnicas).
4. Cuantificacin del/los componentes presentes en la muestra.
5. Tratamiento de los resultados:

A: Se busca obtener como respuesta instrumental:

Picos bien resueltos.
Buena relacin seal/ruido.
Lnea de base horizontal (sin deriva).
Picos no distorsionados.

B: Normalmente suele realizarse una calibracin por estndar externo o utilizando un estndar
interno.
i. Estndar externo:
Se preparan muestras de patrones de concentracin conocida que se analizan y permiten
construir una curva de calibracin para cada componente a cuantificar. Con este mtodo es

9
 necesario medir exactamente los volmenes inyectados tanto de los patrones como de la
muestra incgnita.

ii. Estndar interno:

En este caso se agrega a la muestra una cantidad conocida de un compuesto que no est
presente originalmente y que posea tr diferente al de los componentes de la muestra. En
este caso, la calibracin se realiza analizando patrones de concentracin conocida para
cada componente a cuantificar a los cuales se le agrega la misma cantidad del estndar
interno que a la muestra incgnita. La curva de calibracin se construye graficando el
cociente entre la seal del analito incgnita y el estndar interno en funcin de la
concentracin del analito incgnita. Este mtodo elimina el error cometido al no poder
reproducir el volumen inyectado.

C: Tanto para la medicin de la muestra como de los patrones, es conveniente estudiar la

reproducibilidad de la seal analtica y la de los tiempos de retencin del/los analitos. Para ello se
deben realizar varias inyecciones (n) de cada muestra y cada uno de los patrones y utilizar los
valores medios.

D: Se realizar el tratamiento de resultados siguiendo las indicaciones dadas en la gua de trabajos

prcticos. Consultar el apunte correspondiente.

PARTE EXPERIMENTAL
Primera parte - anlisis cualitativo: Separacin de alcoholes
Objetivos
Analizar la influencia de los diversos parmetros instrumentales en la identificacin y
separacin de una mezcla de alcoholes.
Seleccionar las condiciones instrumentales ptimas para lograr dicha separacin (temperatura
/ rampa de temperatura, flujo del gas carrier)
Determinar la identidad de los componentes de la muestra utilizando patrones de cada analito
y los tiempos de retencin obtenidos para cada uno de ellos en idnticas condiciones
operativas.
Analizar el orden de elusin de todos los componentes, en funcin de su estructura y punto de
ebullicin.
Materiales a emplear (provisto por el plantel docente)
Cromatgrafo de gases Shimadzu GC/17 A con un integrador Shimadzu CR5A. Detector:
FID.

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 Columna capilar marca Agilent J&W HP-INNOWAX, longitud: 30 m, dimetro interno: 0,250
mm, espesor de film: 0,25 m. Rango de temperatura de trabajo: 40C a 250C TR ABAJAR
SI O SI EN ESTE INTERVALO
Gas natural, para calcular t0
Patrones individuales de metanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, iso-butanol, n-
pentanol y acetonitrilo al 1% en agua.
Mezcla de todos los componentes al 1% en agua.
Microjeringa de 10 L.

Anlisis cualitativo de la muestra.

Para identificar los componentes de la muestra se realizarn distintas corridas cromatograficas
de una mezcla sinttica de alcoholes que contiene acetonitrilo (como patrn interno) todos en la
misma concentracin (1%), hasta optimizar la resolucin variando las distintas condiciones
instrumentales (temperatura del horno y flujo del gas portador). El objetivo de este da es que se
interiorice del funcionamiento y modificaciones que ocurren en la corrida cromatogrfica con cada
parmetro ajustado. El flujo puede ser variado desde 0.1 a 4 mL/min (PRUBELO!), y la
temperatura entre 40 y 230 C (PRUBELO!). Utilice todas las combinaciones que le sean
necesarias para comprender como se ven afectados las posiciones y formas de los picos. Optimice
ambos parmetros para lograr la separacin de todos los componentes de la mezcla, no olvide que
pueden realizarse rampas de temperatura.
En las condiciones de flujo y temperatura optimizados, inyecte un compuesto que no interacte
con la columna para determinar t0. En este caso, se utilizara gas natural (metano).
Se analizarn luego patrones de cada componente por separado para proceder a su
identificacin a travs de los tiempos de retencin obtenidos en idnticas condiciones operativas.

Anlisis de los resultados

Realizar un anlisis crtico de los parmetros modificados y el efecto sobre la posicin de los picos
de cada uno. Informar las condiciones experimentales optimizadas y los tiempos de retencin de
cada componente de la mezcla. Obtenga los parmetros que caracterizan la eficiencia de cada
columna para estos analitos en las condiciones de trabajo (k, , N y H). Efectuar el anlisis
estadstico apropiado.

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 Segunda parte Anlisis cuantitativo de bromoalcanos

Materiales a emplear (provisto por el plantel docente)

Cromatgrafo de gases Shimadzu GC/17 A con un integrador Shimadzu CR5A. Detector:
ECD
Columna capilar marca Supelco, longitud: 30 m, dimetro interno: 0,250 mm, espesor de
film: 0,20 m. Rango de temperatura de trabajo: 40C a 250C TR ABAJAR SI O SI EN
ESTE RANGO
Patrones individuales de bromopropano, bromooctano, bromodecano, bromododecano
todos al 1% en metanol.
Patrones conteniendo mezclas de los cuatro bromoalcanos en metanol entre 1% y 5% en
cada componente, adems en todos los casos agregar bromoacetonitrilo al 1%, como
patrn interno.
Muestra artificial de composicin desconocida de los bromoalcanos, con el patron interno al
1%.
Microjeringa de 10 L.
NUNCA INYECTAR AGUA, ya que se arruina el detector.

Experimentos a realizar
Anlisis cuantitativo.
Se utilizarn las metodologas de cuantificacin descriptas anteriormente:
i) Estndar externo
ii) Estndar interno

Primeramente debe optimizar nuevamente los parmetros para lograr una separacin de
todos los componentes de la mezcla (utilice un flujo entre 1 2 ml/min y una temperatura mxima
de 230 C). Luego comience a cuantificar, para ello inyecte mnimo 2 veces (3 si le da el tiempo)
cada patrn y la muestra incgnita de a una tanda por vez (tanda= 5 patrones + MI). Cada tanda
debe ser realizada por un operario distinto. Analice los resultados por ambos mtodos,
considerando primero cada tanda por separado y luego todos los datos juntos. Interprete
crticamente los resultados obtenidos (vea la dispersin de datos, por ejemplo)

Qu diferencias hay entre ambos detectores? Porqu no se utiliza metano para obtener el t0
de esta nueva columna? Qu compuesto se podra usar?

12
Observaciones y cuidados experimentales:
Ya habr notado que el vstago de la jeringa Hamilton es muy fino, tenga mucho cuidado cuando
realiza las inyecciones y los lavados.
Los lavados de la jeringa Hamilton deben realizarse con metanol HPLC, tenga cuidado de no
daar el vstago. No utilice agua. Tenga en cuenta que ese metanol puede terminar en el
cromatograma si no lava bien con la solucin de muestra.
Cuando realice la carga de la jeringa, cuidar bien de que no queden burbujas de aire dentro, realice
con cuidado las maniobras necesarias para eliminarlas.
El operador debe sincronizar muy bien la inyeccin y presin en el botn de START, para dar el
comienzo a la corrida.

Anlisis de los resultados

Discutir los resultados obtenidos mediante las distintas metodologas utilizadas, analizando las
ventajas y desventajas de cada una de ellas. Informar las condiciones experimentales, los tiempos
de retencin de cada componente de la mezcla y la composicin porcentual de cada bromoalcano
en la muestra incgnita. Efectuar el anlisis estadstico apropiado. Obtenga los parmetros que
caracterizan la eficiencia de cada columna para estos analitos en las condiciones de trabajo (k, ,
N y H). Para la columna del segundo da, utilice t0 = 1.9 minutos. Estimar el limite de deteccin de la
tcnica empleando todas las estrategias posibles (discutir previamente este punto con el docente).

BIBLIOGRAFA
1. Principios de Anlisis Instrumental. D. A. Skoog, F. J. Holler y T. A. Hieman, 5a edicin, Mc
Graw Hill, madrid 2001.
2. Mtodos Instrumentales de Anlisis. Willard, Merritt y otros. VI edicin.

13
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA
RESOLUCION

INTRODUCCION
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil. En
cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a
la fase fija.
La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la
cual est rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la
fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia
en las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao
de los micrones, lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase
mvil.
De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que
requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la separacin, la
cromatografa lquida de alta resolucin puede ser:

1. Cromatografa de adsorcin.
La fase fija es un slido y se utiliza casi exclusivamente slice (slica) y en menor medida
almina.
2. Cromatografa de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos
qumicamente a un soporte slido de slica. Se la subdivide en cromatografa en fase
normal y fase reversa. En la cromatografa en fase normal, la fase fija es polar (como por
ejemplo agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polares eluyen primero.
En la cromatografa en fase reversa, el compuesto unido qumicamente es un hidrocarburo
aliftico y se emplean fases mviles polares. En este caso, las sustancias ms polares
eluyen primero.
3. Cromatografa inica.
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio inico para separar y determinar
iones.
4. Cromatografa de exclusin por tamao.
La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red
uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento relacionado con el tamao
molecular. Las molculas de tamao mayor son excludas y eluyen primero, mientras que
las ms pequeas que penetran en los poros son retenidas ms tiempo.

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INSTRUMENTAL
Un equipo para cromatografa lquida de alta resolucin puede representarse por el
siguiente esquema:

La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de
una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una
proporcin determinada y realice la mezcla en una cmara de mezclado. Cuando durante toda la
separacin se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal
realizar un gradiente de composicin del solvente a lo largo de la cromatografa para mejorar la
eficiencia y acortar la duracin del proceso. Estos gradientes de solvente tambin son realizados en
forma automtica por las bombas.
La bomba enva al solvente a travs de caos de dimetro pequeo, generalmente de acero
inoxidable, hacia la vlvula inyectora. Esta consiste en una vlvula de seis vas que permite
introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado.

Luego de que se produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla

pasan por el detector. Este produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de materia y esa
seal es enviada al registrador que realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo
(cromatograma):

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 Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la
muestra original. El integrador calcula adems el rea correspondiente a cada pico, la cual es
proporcional a la cantidad de sustancia. Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es
posible recuperar los productos que salen de l. De esta manera, dependiendo del tamao del loop
de inyeccin y de la columna, y del tipo de bomba, es posible realizar adems de separaciones
analticas, cromatografas preparativas.

Parmetros relevantes
Los parmetros tericos que caracterizan las separaciones cromatogrficas por HPLC son
idnticos a los descriptos en cromatografa gaseosa.
En HPLC, en lugar de variar la temperatura de la columna para mejorar la resolucin del
cromatograma, se cambia la composicin de la fase mvil a lo largo de la separacin utilizando
mezclas de entre dos y cuatro solventes.

Etapas anlisis de una muestra

Son idnticas a las puntualizadas para cromatografa gaseosa. En lo que respecta a la
optimizacin de las condiciones experimentales, en este caso es posible realizar ensayos
preliminares orientativos utilizando cromatografa en capa delgada con la misma fase fija que
contiene la columna.
Por otra parte es necesario tener en cuenta que dado que se utilizan altas presiones, es
imprescindible evitar la presencia de partculas que puedan obstruir los caos y la formacin de
burbujas que puedan deteriorar el relleno de las columnas y que produzcan inestabilidad en la
seal del detector.
Para evitar las obstrucciones, los solventes y las muestras a inyectar se filtran con
membranas de 0,45 a 0,22 m. Para evitar la formacin de burbujas, los equipos de HPLC cuentan
con desgasadores de solvente por vaco o por burbujeo con He y, en el caso de no contar con los
mismos, se deben desgasar los solventes por medio de ultrasonido o agitacin bajo vaco antes de
utilizarlos como fase mvil.

16
PARTE EXPERIMENTAL
Objetivos
Realizar curvas de calibracin para distintos analitos.
Cuantificar el contenido de los mismos en muestras sintticas y comerciales.

Materiales a emplear
Equipo para HPLC marca Thermo Separations compuesto por una bomba binaria modelo
Spectra System P2000, una vlvula inyectora Reodyne provista de un loop de inyeccin de 10
l, un detector de absorcin UV-visible de longitud de onda variable modelo Spectra 100 y un
integrador registrador modelo Datajet.
Columna analtica marca Alltech econosphere C18 (fase reversa unida qumicamente formada
por cadenas de hidrocarburo lineal de 18 tomos de carbono) de 150 mm de longitud por 4,6
mm de dimetro interno.
Buffer fosfato 0,025 M; pH = 3; calidad HPLC.
Metanol calidad HPLC.
Patrones de aspartamo, cafena y cido benzoico en agua, de diferentes concentraciones.

Muestra incgnita sinttica que contiene los tres analitos.

Muestras comerciales que contengan uno o varios de los analitos mencionados (mejor los
tres!).
Ej.: gaseosas light (con aspartamo), gaseosas cola, edulcorantes a base de aspartamo
(equalsweet), etc. Todas las gaseosas tienen benzoato como conservante.
Jeringas de 1mL.
Jeringa de 5 mL con soporte para membranas de 0,45 0,22 micrones. Filtros de nylon de
0,45 0,22 micrones.

Procedimiento
Cuando se desarrolla una tcnica analtica por HPLC, normalmente se elige en primer lugar una
fase fija adecuada y una fase mvil con una composicin tal que sea compatible con la fase fija,
que disuelva los componentes a analizar y que permita una buena separacin. Luego se optimizan
las condiciones de flujo de solvente, cantidad de muestra a inyectar y, en el caso de un detector de
absorcin como el que se emplear en este caso, se determinar la/s longitud/es de onda de
deteccin.
Para el anlisis de la mezcla de aspartamo, cido benzoico y cafena se utilizar una columna de
fase reversa C18 y, como fase mvil, una mezcla formada por 45% de metanol y 55% de buffer
fosfato (acuoso) 0,025 M de pH = 3. Se inyectarn 10 l de cada solucin.

17
 Buscar en bibliografa los valores de pKa para los tres compuestos y, en base al estado de
ionizacin de los mismos al pH de trabajo, predecir el orden de elucin.

A continuacin se presentan los espectros de absorcin en las condiciones de corrida de

aspartamo; cido benzoico y cafena.

Teniendo en cuenta los espectros, elegir la longitud de onda a utilizar en el anlisis.

Curva de Calibracin y anlisis de muestras

1. Se realizar la curva de calibracin para cada analito inyectando 1 mL de cada solucin

patrn mezcla de modo de saturar y limpiar el loop del inyector. Graficar luego el rea de
pico en funcin de la concentracin y verificar que se est trabajando dentro del mbito lineal.
Idealmente cada punto de la curva de calibracin se realizar por duplicado
2. Realizar el anlisis cromatogrfico de la muestra sinttica y de las muestras comerciales. La
muestra sinttica no requiere tratamiento previo mientras que las comerciales deben agitarse
y sonicarse (especialmente las de bebidas gaseosas) y filtrarse antes de ser inyectadas. El
filtrado se lleva a cabo con una jeringa de 5 mL unida a un soporte conteniendo un filtro de
nylon de 0,45 0,22 micrones; se descarta el primer mL de filtrado y luego se recoge el
lquido en un recipiente limpio.
3. Si fuera necesario, diluir la muestra para obtener valores dentro del intervalo de calibracin.
Para el caso de muestras slidas, preparar soluciones de concentracin adecuada y verificar
que el material se disuelva por completo.
4. Para uno de los patrones mezcla utilizados en la curva de calibracin, realizar variaciones en
la longitud de onda del detector. Discutir la longitud de onda de trabajo.

18
Anlisis de los resultados
Una vez obtenidas las curvas de calibracin, comparar la sensibilidad del mtodo para la
determinacin de cada compuesto en las condiciones de trabajo. Relacionar la misma con
los espectros de absorcin y proponer mejoras en las condiciones experimentales para
hacer ms eficiente el anlisis.
Informar las concentraciones de las muestras-problema con su incertidumbre. Comparar
con los valores informados en literatura y con los declarados por los fabricantes de las
muestras comerciales.
Proponer un mtodo para evaluar el lmite de deteccin.
Discutir la necesidad de utilizar otros mtodos (estndar interno, agregado patrn) para
realizar la cuantificacin. Consultar Calibracin y Lmite de Deteccin en Tcnicas
Instrumentales.
Estimar el limite de deteccin de la tcnica empleando todas las estrategias posibles
(discutir previamente este punto con el docente).

BIBLIOGRAFA
General de cromatografa:
1. Anlisis Instrumental. Skoog y Leary.
2. "Principios de Anlisis Instrumental", Skoog, Holler, Nieman.
3. Mtodos Instrumentales de Anlisis. Willard, Merritt y otros.
4. Cromatografa lquida de alta presin. H. M. McNair y B. Esquivel. Monografa cientfica de la
OEA.

Determinacin de cafena, aspartamo y benzoato por HPLC:

1. K. Helrich (Editor). Official Methods of the Association of Official Analytical Chemistry (AOAC
Official Methods of Analysis), 15 th. Ed., Vol. 2, pg. 752 (1990).
2. M. F. Delaney, K. M. Pasko, D. M. Mauro, D. S. Gsell, P. C. Korologos, J. Morawski, L. J.
Krolikowski, F. V. Warren Jr. J. Chem Ed., 62, 618 (1985).
3. J. E. DiNunzio. J. Chem Ed., 62, 446 (1985).
4. N. Strohl. J. Chem Ed., 62, 447 (1985).
5. V. L. McDevitt, A. Rodrguez, K. R. Williams. J. Chem Ed., 75, 625 (1998).

19
 ESPECTROSCOPIA DE EMISION Y
ABSORCION ATOMICA
INTRODUCCIN
Espectroscopa es la medicin e interpretacin de la radiacin electromagntica absorbida,
dispersada o emitida por tomos, molculas u otras especies qumicas. Estos fenmenos estn
asociados con cambios en los estados de energa de las diferentes especies. Por consiguiente,
dado que cada especie posee estados energticos caractersticos, la espectroscopa puede
utilizarse para identificarlas y cuantificarlas.
La espectroscopa constituye la base del anlisis espectroqumico, en el que la interaccin
de la radiacin electromagntica con la materia se utiliza para obtener informacin cualitativa y
cuantitativa acerca de la composicin de una muestra. Dentro del anlisis espectroqumico, la
espectroscopa atmica estudia la absorcin y emisin de la radiacin por especies atmicas,
inicas y moleculares libres. Estas especies son generadas y examinadas en un medio gaseoso de
alta energa, que constituye una fuente de vaporizacin-atomizacin-ionizacin-excitacin.

Tcnicas de espectroscopa atmica con llama.

Cuando una solucin es introducida por aspiracin en una llama, la mayor parte de los
componentes inorgnicos son vaporizados y convertidos en su forma elemental, y los tomos son
excitados trmicamente por la energa generada mediante reacciones qumicas.
En un tomo en su estado de menor energa (estado fundamental), uno de los electrones de
valencia correspondiente a un orbital externo es transferido a un estado electrnico de mayor
energa. Al retornar al estado fundamental o a uno de menor energa, los tomos pierden su
energa de excitacin en forma de calor o como radiacin electromagntica de longitud de onda
caracterstica.
Explique el origen y las caractersticas de los espectros atmicos, moleculares y continuos.

La absorcin de energa trmica generada en una llama seguida por la emisin de toda o
parte de esa energa en forma de una lnea espectral discreta se denomina emisin atmica. La
longitud de onda y la intensidad de las lneas de emisin constituyen la base del anlisis cualitativo
y cuantitativo por espectrometra de emisin atmica (EEA).
Los tomos neutros gaseosos en su estado fundamental pueden tambin absorber
radiacin a longitudes de onda especficas, correspondientes a las energas de las transiciones
electrnicas en sus orbitales externos. Este fenmeno se denomina absorcin atmica. La
medicin de la magnitud de esa absorcin atmica y su aplicacin al anlisis cuantitativo
constituyen la espectrometra de absorcin atmica (EEA). La fuente primaria de radiacin
luminosa es generalmente una lmpara de ctodo hueco del elemento de inters.
Los factores principales que determinan la magnitud de la emisin y absorcin son:
la distribucin energtica de niveles excitados.
probabilidades de transicin de emisin-absorcin
el coeficiente de absorcin atmica.
las caractersticas de la celda de atomizacin
Indique las expresiones fundamentales que relacionan las seales medidas en emisin y
absorcin atmica con la concentracin de tomos emisores o absorbentes.

20
INSTRUMENTACIN
Se utilizar un espectrmetro de absorcin / emisin atmica Perkin Elmer (Analyst 200), provisto
de un quemador de flujo laminar para llama de aire-acetileno y una lmpara de ctodo hueco de
nquel como fuente de radiacin.
Los componentes bsicos de un sistema espectromtrico para la medicin de emisin y
absorcin atmicos son los siguientes:

Explique el funcionamiento de cada uno de los componentes, e indique cules se utilizan para cada
tcnica. Identifique las caractersticas especficas del instrumento que utilizar en la prctica.

Seleccin de las condiciones de operacin

Los procesos que sufre el analito en la celda de atomizacin son esencialmente comunes a
ambas metodologas, con lo cual en ambos casos es necesario optimizar:
la seleccin del tipo y condiciones de la llama (relacin oxidante/combustible)
la regin de observacin en la llama

como as tambin

el paso de banda espectral del monocromador empleado para la seleccin de la longitud de

onda
la velocidad de aspiracin de la solucin
los parmetros del sistema de deteccin y lectura

y en el caso de absorcin atmica

la intensidad de corriente de la lmpara de ctodo hueco

Discuta para cada una de las tcnicas, la influencia de las variables indicadas sobre la
sensibilidad, la relacin seal - ruido, la presencia de interferencias espectrales y el lmite de
deteccin.
Interferencias

21
 11Interferencia es el efecto de un concomitante presente en la muestra sobre la seal
generada por el analito. La presencia de un interferente conduce en todos los casos a un error
sistemtico. Existe una interferencia cuando el resultado de la medicin sobre una dada solucin de
muestra difiere del obtenido con la misma concentracin de analito en la misma combinacin
qumica y solvente, pero en ausencia del interferente.
En EEA y EAA con llama se producen esencialmente las mismas interferencias, aunque con
magnitudes diferentes. Pueden clasificarse en cuatro grupos:
1. Espectrales, incluyendo efectos de emisin o absorcin de fondo.
2. Fsicas, asociadas con el transporte y dispersin de la muestra en la llama.
3. Qumicas, relacionadas con la vaporizacin del soluto.
4. De ionizacin, relacionadas con la variacin de la concentracin de tomos
neutros emisores o absorbentes en la llama provocada por el fenmeno de
ionizacin trmica.

Explique de qu manera son afectadas por las interferencias espectrales las

mediciones en EEA y EAA con llama. Discuta procedimientos para correccin por fondo espectral.
Indique cules son aplicables al instrumento que utilizar en la prctica.

Calibracin
Como todas las tcnicas instrumentales, la espectrometra de llama es una tcnica relativa.
Por consiguiente, es necesario establecer experimentalmente una curva (o funcin matemtica)
que relacione la seal analtica obtenida con la concentracin del elemento analito en las
soluciones a analizar. En el caso ms directo, la concentracin de una solucin incgnita se obtiene
por interpolacin grfica a partir de una curva de seal (A o IE) vs. c , obtenida con varios
estndares (patrones) adecuadamente espaciados, que cubren el mbito de concentraciones
requerido.

Discuta las caractersticas de las curvas de calibracin obtenidas en emisin y absorcin.

Defina sensibilidad y lmite de deteccin.

En la mayora de los casos es necesario que la composicin de las soluciones patrn sea similar a
la de la muestra a analizar. En el caso de soluciones muestras muy complejas, en las que la
presencia de elementos concomitantes puede afectar la respuesta obtenida para el analito, existen
otros procedimientos de calibracin, tales como el mtodo de agregado patrn de analito (simple o
mltiple).
11En trminos estadsticos, el principal inconveniente es
que se trata de un mtodo de extrapolacin; por lo tanto,
menos preciso que los de interpolacin. Cualquier variacin
en la pendiente de la recta por errores indeterminados se
traduce en una variacin apreciable en el resultado. En este
sentido, influye el tamao de la adicin, por lo que hay que
procurar que el tramo incierto no sea demasiado grande.
Por otra parte, el mtodo puede ser difcil de automatizar, y
suele necesitar cantidades de muestra mayores que otros.

Describa otros procedimientos para calibracin y discuta las posibles fuentes de error.

PARTE EXPERIMENTAL

22
El primer da cada grupo debe traer un protocolo de trabajo de las 2 prcticas a realizar. En el
mismo debe disear cada curva de calibracin y/o preparacin de muestra correspondiente. Cuenta
con matraces de diversos tamaos (25 250 mL) y pipetas automaticas (20 l 10 mL). El
volumen para las mediciones es de 100 mL.

ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION ATOMICA

Determinacin de Nquel en una muestra de acero

Objetivos
Evaluar la importancia de la seleccin de la longitud de onda y las posibles correcciones del fondo
en espectroscopia de absorcin atmica. Aplicar esta tcnica a la determinacin de nquel en una
aleacin metlica.

Preparacin de la muestra.
Pesar exactamente alrededor de 0,1g de muestra (realizar el tratamiento por duplicado), aadir 5
mL de HCl (c) y 2,5 mL de HNO3 (c) y calentar suavemente sobre tela metlica hasta disolucin
completa. Dejar enfriar y trasvasar a un matraz aforado de 100,0 mL. completando hasta el enrase
con agua destilada. Pipetear 10,00 mL de esta solucin y diluir a 100,0 mL en un matraz aforado.
Realizar en paralelo un blanco de reactivos (cul es?).

Calibracin
Preparar estndares para calibracin conteniendo respectivamente 0, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 y 10 ppm de
Ni en una solucin base que contenga 0,5 % (v/v) de HCl y 0,25 % (v/v) de HNO3. Dispone de un
patrn de 1000 ppm de niquel y preparar 100mL de solucin en todos los casos.
Procedimiento
1) Con la ayuda del personal docente y el manual de instrucciones del espectrmetro
seleccionar las condiciones generales de trabajo para la determinacin de nquel (longitud de
onda, ancho de ranura, correccin de fondo).
2) Utilizando las soluciones patrones obtener curvas de calibracin analtica (absorbancia vs
concentracin) a dos longitudes de onda (232 nm y 341,5 nm), para la longitud de onda
menor realizarlo con y sin correccin de fondo. Qu es? Por qu no se hace con la de
341 nm la correccin de fondo?
3) Medir la absorbancia para la solucin de la muestra y calcular el valor de concentracin por
interpolacin a partir de la curva analtica.

Tratamiento de resultados
A. Informar un nico valor de nquel en la muestra. En el anexo, calcular la concentracin de nquel
en la aleacin metlica utilizando todos los grficos de calibracin obtenidos (cuatro en total).
Comparar crticamente. Expresar los resultados con sus correspondientes lmites de confianza.
B. Estimar el limite de deteccin de la tcnica empleando todas las estrategias posibles (discutir
previamente este punto con el docente).

ESPECTROSCOPIA DE EMISION ATOMICA CON LLAMA

23
 Primera Parte: Determinacin de Calcio en una muestra de agua mineral

Objetivos
Comparar dos mtodos de calibracin para la determinacin de calcio en muestras de agua
mineral comercial. Evaluar la influencia del agregado de agentes liberadores y buffers de ionizacin
en el mecanismo de atomizacin de calcio en una llama de aire/acetileno.

Calibracin
Se compararn dos mtodos de calibracin: curva de calibracin estndar con patrones
acuosos y mtodo de agregado patrn de analito.
A. Preparar soluciones patrn de calcio de concentraciones 2, 4, 6, 8 10, 15 y mg/l a partir de
una solucin estndar de 1000 mg Ca/l. En todos los casos preparar 100 mL de solucin.
B. Preparar una solucin diluyendo adecuadamente la muestra de agua mineral comercial de
tal manera que caiga en el mbito lineal de la curva de calibrado. Aproximademente 5 ppm
C. Repita la preparacin de esta solucin (dilucin de la muestra), con el agregado de nitrato
de lantano (2000 mg/l) pero para un volumen final de 25mL.
D. Teniendo en cuenta el mbito de linealidad y la concentracin de calcio en la muestra (ver
en el envase que traern) disear una curva de agregado patrn con un mnimo de cinco
puntos teniendo en cuenta de no salirse del mbito lineal visto anteriormente.

Procedimiento
1) Con la ayuda del personal docente y el manual de instrucciones del espectrmetro,
utilizar una de las soluciones patrn (10 mg Ca/L) para seleccionar las condiciones
generales de trabajo para la determinacin de calcio (longitud de onda, ancho de ranura).
Asimismo optimizar la relacin combustible-comburente de la llama y la altura de
observacin.
2) Una vez seleccionados los parmetros ptimos medir la intensidad de emisin para todas
las soluciones.

Tratamiento de resultados
- Informar un nico valor de calcio en la muestra. En el anexo, calcular la concentracin de calcio
en el agua mineral por ambas metodologas (curva de calibracin externa y mtodo de agregado
patrn). Comparar crticamente. Expresar los resultados con sus correspondientes lmites de
confianza.
- Comparar los resultados obtenidos en ausencia y presencia nitrato de lantano. Justificar la
diferencia si la hubiera.
Estimar el limite de deteccin de la tcnica empleando todas las estrategias posibles (discutir
previamente este punto con el docente).

24
 IMAGING DE pH EN DOS DIMENSIONES:
APLICACIN A MONITOREO DE SISTEMAS EN FLUJO

OBJETIVOS
Utilizar un indicador acido-base para mapear el pH en una superficie en forma ultrarrpida
(nanosegundos), utilizando toma de datos con una cmara digital convencional.

INTRODUCCION
El Calcn es una substancia utilizada normalmente como indicador complejomtrico. El hecho
de poseer hidroxilos fenlicos permite tambin utilizarlo como indicador acido-base con pKa
cercano a 7.

Figura 1. Estructura del Calcn.

Este indicador posee un absorcin mxima alrededor de los 515 nm (verde) en su forma cida
que se corre a 610-640 nm (rojo) al deprotonarse en medio bsico. Los pKa de los hidroxilos
fenlicos son 7.40 y 13.50. Los espectros de absorcin entre pH 3 y 11 se muestran en la figura 2.

Figura 2: Espectros del Calcn entre pH=3 y pH=11.

25
Setup experimental

Por un capilar circula una solucin conteniendo un complejo de Rutenio que es fotoactivo, y el
indicador Calcn. El flujo es continuo, de la misma forma en que lo hace en un sistema de anlisis
por inyeccin en flujo (FIA). En un punto del capilar, un pulso de laser de 405 nm provoca la ruptura
fotoqumica del complejo de rutenio el cual libera butilamina al medio, basificndolo y aumentando
el pH de 4 a 10 aproximadamente.1

Esta variacin in situ de pH provoca los cambios colorimtricos en el indicador Calcn, lo cuales
van a ser medidos. El detector no es de los usados habitualmente (UV-Vis, IR, FID, o MS), sino que
se utiliz una cmara fotogrfica digital para tomar imgenes. Dichas imgenes corresponden a
microfotografas del tubo capilar, en la zona de la irradiacin del laser. Para ello se coloca el
objetivo del microscopio en la zona a examinar, el cual est conectado a la cmara fotogrfica. El
esquema del sistema completo se muestra en la figura 3. Para ms detalles experimentales y de la
tcnica utilizada, leer el trabajo original.1

Figura 3. A) entrada de solucin. B) direccin del flujo. C) descarte.

D) objetivo del microscopio. E) Laser 405nm enfocado sobre el capilar.

Consideraciones de la adquisicin de datos de este detector

Para poder medir el pH en todos los puntos a la vez, se utiliz una cmara fotogrfica digital. Las
cmaras digitales convencionales poseen un sensor de semiconductor (CCD o CMOS) capaz de
leer la cantidad de luz en forma independiente en cada uno de los puntos que componen la imagen.
El nmero de celdas de CCD o CMOS que lo componen determina la resolucin en megapixels.
Valores de hasta 15 Mp son habituales en las cmaras digitales actuales.

26
 Si bien existen cmaras monocromticas para usos especiales (microscopas, astronoma, etc.)
las cmaras comerciales tienen la matriz de CCD dividida en los 3 colores primarios que detecta el
ojo humano: rojo, verde y azul. Este sistema se conoce como RGB por sus iniciales en ingls y su
distribucin es casi siempre la misma, la cual se conoce como Bayer. En una matriz de filtros
Bayer hay 2 pixeles verdes por cada uno rojo o azul, como se ve en la figura 4.

Figura 4. Filtro tipo Bayer, y la respuesta de cada uno de los filtros. Una vez tomada la imagen,
el firmware contenido en la mquina digital calcula 3 imgenes completas para eliminar el pattern
Bayer. De esta forma se obtienen las 3 imgenes R, G y B, las cuales se combinan para dar la
imagen color. Normalmente esta imgen color se comprime y el usuario obtiene una fotografa en
formato Jpeg.

Como se v claramente, las respuestas de los filtros son muy anchas, de ms de 100 nm. Esto
implica que la Ley de Lambert-Beer, que slo es vlida al utilizar luz monocromtica, no se cumplir
si se pretende medir absorbancia directamente con este dispositivo. Afortunadamente, existen
formas de minimizar este error. Una de ellas es iluminar la muestra con luz laser (estrictamente
monocromtica) o de LED (20 nm de ancho). Las tomas de las imgenes que se utilizarn en esta
prctica son realizadas con iluminacin de LEDs verde (535 nm) y rojo (635 nm), cuyos espectros
se observan en la figura 5.

Figura 5 Espectros de emisin de los LEDs utilizados para la toma de datos.

Debido a esta iluminacin, la imgen correspondiente al color azul practicamente no existe,

mientras que las imgenes verde y roja corresponden a la luz transmitida por el indicador a 535 nm
y 635 nm.
Para la manipulacion matemtica de las imgenes se utilizar el programa de acceso libre ImageJ.2

27
PARTE EXPERIMENTAL
Toma de imgenes
Las imgenes del capilar del sistema FIA fueron adquiridos utilizando un microscopio invertido
Nikon TS-100 con iluminacin de campo brillante. El sistema de iluminacin del microscopio fue
reemplazado con un sistema de 2-LED, con irradiacin de luz verde (535 16 nm FWHM) y rojo
(635 11 nm FWHM) y se coloca en el mismo punto focal a travs de un espejo dicroico. Las
imgenes fueron tomadas con una cmara digital compacta (Casio Exilim EX-FC100) que hizo foco
a travs de un ocular normal y un adaptador personalizado y ajustado a sensibilidad ISO 100. Los
anlisis de imgenes y videos se realizaron con el software pblico acceso ImageJ.2
Las imgenes se toman a 30 cuadros/segundo y se graban en un archivo de formato AVI. Posee
cuadros de 1280x720 pixeles, de los cuales los primeros corresponden a la medicin, y los ltimos
a un campo fijo a pH bajo para tener una lnea de base til para el clculo.

Carga de las imgenes

Para abrir el archivo de video basta con correr el programa ImageJ y arrastrar el video hasta la
parte superior del software. Una vez cargado el video es conveniente cortar (crop) la imgen de
forma de no tener que utilizar las partes que no corresponden a la medicin y hacer los clculos
ms rpidos.
Una vez obtenido el stack de imgenes con el que se va a trabajar es conveniente grabarlos
como imgenes TIFF de 32 bits. De esta forma no se pierde informacin por redondeo al efectuar
operaciones matemticas.
Nota: En la pgina de la materia cuenta con el video y el manual del Image J. Al terminar llevarse
los datos en un pendrive y borrarlos de la computadora, ya que ocupan cientos de MB.

Tratamiento de las imgenes

Considere que cada pixel de cada imagen es un valor de intensidad de luz completamente
independiente de los dems (esto es una aproximacin vlida). De esta forma, es en principio
posible, conociendo la absorbancia [-log(I/I0)] en cada punto a ambas longitudes de onda, obtener
la fraccin molar de la especie deprotonada y protonada del indicador, y por lo tanto el pH. Sin
embargo, es importante considerar algunas caractersticas de la medicin:
1) no se cuenta con un blanco que permita determinar en forma directa las absorbancias
2) la absorbancia es una funcin no lineal de la intensidad de luz
3) puede existir alinealidad en la toma de datos por la cmara y la posterior digitalizacin
en formato jpg.

Este ltimo problema (3) no puede solucionarse salvo conociendo la respuesta de la cmara a
intensidades de luz patrn, por lo cual se considerar respuesta lineal (esta aproximacin es
correcta dentro del 5% en las condiciones de la medicin).
Las dificultades provenientes de (1) y (2) pueden ser subsanadas a travs de manejo
matemtico de las imgenes (lo cual ser explicado por el docente). Al conocer los espectros de
absorcin de las especies bsica y cida, es posible reconstituir las absorbancias
correspondientes a las zonas cidas (flujo sin irradiar, intensidad del pixel rojo) y bsicas
(irradiacin mxima, intensidad del pixel verde) correspondientes a cerca del 0 y 100% de
fraccin molar de las especies del indicador. De esta forma, y utilizando las funciones matemticas

28
del ImageJ (ver manual) es posible calcular el pH correspondiente a cada punto. Considere el pKa
= 7.40.

Informe
En el informe deber incluir necesariamente:
- Una foto de cada uno de los cuadros notables del video, indicando los pH correspondientes.
- Grficos de lnea obtenidos de esas fotos indicando pH vs. longitud, a tiempo fijo.
- Grficos de lnea obtenidos para una zona importante fija de la medicin, en los que se
grafiquen pH vs. tiempo.
- Anlisis y discusin de la forma geomtrica del perfil obtenido en la pluma de pH del sistema
de flujo.
- Anlisis del error en pH en zonas de la imagen, e informe maneras de minimizar ese error.
- Utilizando una imgen en escala de fraccion molar, estimar el limite de deteccin de la tcnica
empleando las funciones estadsticas del ImageJ.

Ejemplos:

BIBLIOGRAFIA
1. Oscar Filevich, Guillermo Carrone, Victoria Andino Pavlovsky y Roberto Etchenique, Anal. Chem,
2012, 84, 56185624
2. Abramoff, M. D.; Magalhaes, P. J.; Ram, S. J. Biophotonics Int. 2004, 7, 3642.

29
 CIFRAS DE MRITO EN
ESPECTROMETRAS MOLECULARES
FLUORESCENCIA MOLECULAR Y ABSORCIN MOLECULAR.
DETERMINACION DE RIBOFLAVINA EN UNA PREPARACION FARMACEUTICA

OBJETIVOS
Aplicacin de la espectrometra de emisin molecular (fluorescencia).

Realizar la determinacin de riboflavina (vitamina B2) en solucin, utilizando dos mtodos de

cuantificacin distintos (absorcin molecular y fluorescencia molecular). Estimar la incertidumbre de
las determinaciones.

Evaluar las cifras de mrito de cada una de las metodologas. Estimar el lmite de cuantificacin
(concentracin lmite).

A partir del anlisis de las curvas de calibracin, analizar los factores instrumentales y de medicin
que afectan, entre otras cosas, al ruido de la medicin.

INTRODUCCIN
Principios

A temperatura ambiente, la riboflavina (vitamina B2) puede ser promovida a varios niveles de vibracin
excitados, en el primer estado excitado electrnico. La transicin est en la energa correspondiente al UV y
parte del espectro azul (350-450 nm). La existencia de esta transicin se corresponde con la presencia de
una banda de absorcin en la regin azul del espectro visible, la cual puede ser utilizada para cuantificar la
concentracin de riboflavina mediante la espectroscopia de absorcin molecular.

El proceso de absorcin se produce en aproximadamente el 10-15 femtosegundos. La absorcin es seguida

por la relajacin vibracional, luego de la cual se establece una distribucin de la poblacin trmica de
molculas excitadas de tal manera que se acumulan en los niveles ms bajos de vibracin del estado
electrnico excitado. Esta relajacin vibracional concluye dentro de los 10 picosegundos posteriores a la
absorcin. Las molculas electrnicamente excitadas "relajan" a los distintos niveles de vibracin del estado
fundamental a travs de diversos procesos. En las substancias no fluorescentes, el mecanismo dominante es
la relajacin vibracional, que disipa en forma de calor la energa del estado excitado. Algunas substancias (la
riboflavina entre ellas), pueden relajar la energa a travs de un proceso de emisin espontnea en el rango
de las decenas a centenas de nanosegundos. Este tipo de emisin se denomina fluorescencia. El espectro de
fluorescencia est desplazado hacia longitudes de onda ms largas que el de absorcin. (Por qu?). En el
caso de la riboflavina, la emisin fluorescente se observa de color verde.

La espectroscopia de fluorescencia es ampliamente utilizada en los anlisis biomdicos, ya que tiene varias
ventajas con respecto a la espectrometra de absorcin. Algunas de estas ventajas son:

1 - Es ms selectiva, ya que slo un pequeo subconjunto de las molculas que absorben son fluorescentes,
(lo que tambin reduce la posibilidad de aplicacin).

2 - Es ms sensible, ya que el detector slo detecta la radiacin de fluorescencia, entre cero y un cierto

30
valor, mientras que en la medicin de la absorcin el detector debe detectar pequeas diferencias entre la
absorcin del blanco y de la muestra. A bajas concentraciones, se puede disminuir el lmite de deteccin de
la determinacin por fluorescencia colectando ms luz o utilizando una fuente de luz de mayor potencia. En
cambio, en la absorciometra, la nica posibilidad es elevar la sensibilidad del detector, para que permita
diferenciar entre pequeas variaciones, lo cual es mucho ms difcil de lograr.

Por supuesto, la relacin de mrito entre el mtodo de fluorescencia y el de absorcin depender de varios
factores, entre ellos:

a) la eficiencia cuntica de fluorescencia del analito en cuestin.

b) su absortividad molar

c) la precisin (en miliabsorbancias) del espectrofotmetro disponible

d) la sensibilidad del fluormetro

e) el posible quenching de la fluorescencia por diversos factores

En esta prctica se compararn ambos mtodos, utilizando un mismo instrumento con configuracin de
espectrofotmetro y fluormetro. En una segunda etapa, se estudiarn las condiciones de medicin de
espectrofluorometra con dicho instrumento (espectrofluormetro de matriz de diodos)

PARTE EXPERIMENTAL

A - Muestra incgnita

Se deber informar el contenido de riboflavina en una muestra provista por el docente.

Para ello cada grupo preparar una dilucin 1:10 de la misma segn: medir exactamente 5.00 ml y llevar a
50 ml en matraz, por agregado de aproximadamente 40 ml de solucin de cido actico 20 mM (por qu no
agua?). Enrase el matraz con piseta. A esta solucin la llamaremos Solucin 1.

Cada grupo debe determinar la concentracin de riboflavina en cada una de las Soluciones 1 preparadas
por cada uno de los grupos de su turno (entre cuatro y seis) y calcular la concentracin de riboflavina en la
solucin original. En particular, para las determinaciones por fluorescencia se deber efectuar una dilucin
1:10 adicional de las Soluciones 1. A esta nueva dilucin la llamaremos Solucin 2.

B - Determinacin por espectrometra de absorcin molecular

Recibir los patrones para realizar la curva de calibracin de parte de los docentes (NO tiene que
prepararlos, solo medirlos). Los mismos se realizaron con una muestra de riboflavina pura recin disuelta, en
cido actico 20 mM. Se prepararon 6 diluciones entre 0 y 62.5M de riboflavina a partir de una solucin
madre de 125 M. Aproximadamente, se utilizaran las siguientes concentraciones:

0, 6.25, 12.5, 25, 50, 62.5 M, aunque pueden ser otras.

Tome los espectros de absorcin de estas soluciones, elija convenientemente el tiempo de integracin,
manteniendo el AVERAGE y el BOXCAR WIDTH en 10. Slvelos para trabajar posteriormente con ellos, en el
modo TAB DELIMITED, NO HEADER. Elija la longitud de onda adecuada (mximo de absorbancia), y calcule la
recta de calibracin correspondiente, utilizando regresin por cuadrados mnimos. Anote en el cuaderno
TODOS los parmetros instrumentales conque realiz esta medicin.

31
- Determinacin espectrofotomtrica:

Determine la absorbancia de las Soluciones 1 preparadas por cada uno de los grupos, en la longitud de
onda elegida. Repita el mismo procedimiento para cada una de ellas. Determine la concentracin molar de
riboflavina (en M) y estime la incertidumbre de dos maneras distintas:

1) Dispersin de los replicados de muestra (soluciones madre)

Desviacin estndar de la muestra

s = ( (x i x m)2 / (N-1)) 1/2

t para 95% de confianza, y N-2 grados de libertad.

2) a partir de la curva de calibracin estimada por cuadrados mnimos

t para 95% de confianza, y N-2 grados de libertad.

Debe informar dos resultados de concentracin en la muestra original, con sus respectivas incertidumbres.
Compare las incertidumbres obtenidas en cada resultado (la que resulta de considerar las diluciones
(Soluciones 1) preparadas por cada grupo, con la que resulta de considerar su propia curva de calibracin).

C - Determinacin por espectrometra de emisin por fluorescencia molecular

Recibir los patrones para medir la curva de calibracin de parte de los docentes (NO tiene que prepararlos,
solo medirlos). Los mismos se realizaron con una muestra de riboflavina pura recin disuelta en cido actico
20 mM. Se prepararon 6 diluciones entre 0 y 12.5 M de riboflavina. (Note que se usan concentraciones
menores. Por qu?) Coloque el espectrofotmetro en configuracin de medicin de fluorescencia, teniendo
en cuenta que debe mover la llave selectora hasta que encienda el LED violeta que se encuentra a 90 grados
de la entrada del espectrofotmetro. Esta configuracin minimiza la luz esprea del LED que entra
directamente al equipo.

Con el programa de toma de datos en modo SCOPE y utilizando el patrn mas concentrado (12.5 M) elija
convenientemente el tiempo de integracin, manteniendo el AVERAGE y el BOXCAR WIDTH en 10. El
mximo del espectro de emisin no debe saturar. No es importante si satura o no la luz espurea de
excitacin.

Con la excitacin apagada o introduciendo una cubeta que bloquee completamente la excitacin tome un
espectro DARK que corresponde al cero de fluorescencia. Este espectro debe tomarse con los mismos

32
parmetros (integracion, boxcar, average) con que tom el espectro de mxima concentracin. Cliquee el
cono correspondiente para dejar grabado ese espectro. A partir de ahora no deber cambiar los parmetros
de medicin.

Tome los espectros de emisin de las soluciones patrn. Slvelos para trabajar posteriormente con ellos, en
el modo TAB DELIMITED, NO HEADER. Anote en su cuaderno los parmetros con que tom los espectros.
Elija una longitud de onda adecuada y calcule la recta de calibracin (borrador preliminar) correspondiente,
utilizando regresin por cuadrados mnimos

Tome 10 ml con pipeta aforada de la muestra incgnita del matraz conteniendo Solucin 1 y lleve a 100 ml
en un matraz aforado con cido actico 20 mM, enrasando al final con la piseta. Cada grupo realizar esta
dilucin, a la que llamamos Solucin 2, y todos los grupos realizarn la determinacin de todas las
Soluciones 2 de su turno. Mezcle la solucin invirtiendo el matraz un mnimo de 5 veces. Sobre estas
soluciones diluidas tome las medidas de fluorescencia de la misma forma que hizo la curva de calibracin,
a la misma longitud de onda. Determine la concentracin molar de riboflavina en la muestra original, y
estime la incertidumbre, utilizando las mismas dos estimaciones consideradas en el caso de absorcin
molecular.

Debe informar dos resultados de concentracin en la muestra original, con sus respectivas incertidumbres.
Compare las incertidumbres obtenidas en cada resultado (la que resulta de considerar las diluciones
(Soluciones 2) preparadas por cada grupo, con la que resulta de considerar su propia curva de calibracin).

Estimacin del lmite de deteccin y del lmite de cuantificacin en la determinacin por

absorcin molecular y por fluorescencia molecular

Desde el grfico de la recta de calibracin pueden calcularse los valores de LD y LC. En particular,
utilizaremos las hiprbolas de confianza segn:

El LD es la concentracin correspondiente al punto de la curva de calibracin que resulta de la interseccin

horizontal de la hiprbola superior con el eje de coordenadas (seal).

El LC es la concentracin correspondiente al punto de la hiprbola inferior que resulta de la interseccin

horizontal de la banda de prediccin superior con el eje de coordenadas (seal).

En la bibliografa se discute si deben considerarse las bandas de confianza o las bandas de prediccin (que
consideran los replicados de cada medicin). Teniendo en cuanta que no hemos realizado replicados de los
puntos de la curva de calibracin, utilizaremos las bandas de confianza.

Considerando entonces la interseccin con la banda de prediccin inferior, podemos calcular al LC (C Q) como
se indica en el Manual de Incertidumbre y Cifras de Mrito del curso.

Compare al menos 3 diferentes estimaciones del valor del Lmite de cuantificacin, y discuta sobre las
discrepancias que encuentra entre los valores.

EVALUACIN DEL RUIDO EN FLUORESCENCIA MOLECULAR

Con el programa de toma de datos Spectra Suite en modo emisin minus dark (recuerde medir
correctamente el dark antes de las muestras), elija convenientemente el tiempo de integracin,
manteniendo el SCANS AVERAGE y el BOXCAR WIDTH en 1. Tome los espectros de emisin en las mismas
soluciones de la curva de calibracin que midi en el tem anterior. Slvelos para trabajar posteriormente
con ellos, en el modo TAB DELIMITED. De esta forma son fciles de importar por cualquier programa de
manejo de datos, como Excel, Origin, SigmaPlot o Matlab.

33
Calcule nuevamente la curva de calibracin en dos situaciones distintas:

1) mximo de intensidad de fluorescencia

2) rea del espectro en un intervalo que contenga los valores de espectro por sobre el 20% del mximo,
y una despreciable cantidad de la luz de excitacin.

Compare el Lmite de Cuantificacin en las siguientes condiciones:

a) SCANS AVERAGE= 1 BOXCAR WIDTH = 1

b) SCANS AVERAGE= 1 BOXCAR WIDTH = 9

c) SCANS AVERAGE=16 BOXCAR WIDTH = 1

Gua Informe

El informe contendr los siguientes resultados y anlisis:

1) Molaridad de la solucin de Riboflavina analizada, segn las dos metodologas (AM y FM). Discusin
de la incertidumbre calculada con los dos mtodos de evaluacin, en cada metodologa.

2) Anlisis de los lmites de cuantificacin de Riboflavina en AM y FM, y segn los tres mtodos de
evaluacin propuestos.

3) Anlisis del ruido de los espectros de fluorescencia obtenidos en diferentes condiciones y relacin
con la robustez de los datos informados y con el lmite de cuantificacin.

BIBLIOGRAFIA

- Anlisis Qumico Cuantitativo, Daniel C. Harris, 2da edicin (o posterior). Editorial Revert.

http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/riboflavin.html

34
 GUIA DE PROBLEMAS
CROMATOGRAFIA GASEOSA
1. Enumerar los tipos de detectores habitualmente empleados y evaluar su mbito de aplicacin.
2. Discutir la eleccin del gas portador a utilizar en relacin al tipo de detector con que se cuenta.
Qu caractersticas debe reunir el gas elegido?
3. Discutir la aplicacin de la ecuacin de Van Deemter para modificar la eficiencia de un anlisis.
4. De qu manera influyen las condiciones instrumentales en el cromatograma?
5. Qu condiciones debe reunir un componente para ser utilizado como estndar interno?
6 . Discutir las ventajas y desventajas de cada uno de los mtodos de cuantificacin utilizados.
7. Discutir la conveniencia de considerar como seal la altura o el rea del pico obtenido como
respuesta de la muestra.
8. Una muestra contiene las sustancias X e Y. Se desea determinar cuantitativamente X utilizando
el mtodo del estndar interno. Se probaron los compuestos 1, 2 y 3 como posibles estndares
internos, obtenindose el siguiente cromatograma:

a. Cul elegira como estndar y qu condiciones variara en el cromatograma para su

uso?
b. Una vez conseguida las condiciones ptimas, cmo procede para la determinacin?

9. Ejercicio de Parcial
Utilizando las siguientes condiciones: flujo 1 ml/min; L= 30 mts, se realiz la separacin de 6
compuestos (ver tablas y figura)

Tabla 1
tr (min)
# Compuesto Puntos de ebullicin (C)
Isoterma 100
1 Octano 125 3,2
2 Nonano 151 4,2
3 Fenol 182 5,7
4 Decano 174 6,5
5 Naftaleno 219 9,1
6 Dodecano 216 9,7

35
 Figura 1 Cromatograma de los compuestos listados en la tabla segn su #

Tabla 2
rea rea rea rea rea rea
Muestra Octano Nonano Fenol Decano Naftaleno Dodecano
1% 72404 81454,9 77468 90505 85742 68488
2% 130952 147321 63938 163690 70153 135924
3% 264199 297224 86091 330249 95879 226711
4% 304840 342944,5 75001 381049 83645 301952
5% 355134 399526 70304 443918 78338 389958
6% 452120 508634,5 82231 565149 92479 466062
Incgnita 180453 203010 60503 225567 67670 246001

a) Justifique la elucin de los compuestos y explique por qu algunos no cumplen el orden de

los puntos de ebullicin. Cmo obtendra el t0?
b) Si se quisieran cuantificar TODOS los hidrocarburos, qu compuesto de la tabla 1 elegira
como patrn interno? Calcule N, k`, y R para el compuesto elegido respecto de su
hidrocarburo ms prximos. Con que criterio hizo la eleccin? Asuma W = 0.05 min para
todos y t0= 1,5 min.
c) Utilizando la misma metodologa que en el TP se obtuvieron los datos de la Tabla 2,
cuantifique la cantidad de Nonano presente en una muestra incgnita.

10. Ejercicio de Parcial

El mentol es ampliamente utilizado en la preparacin de formulaciones para la tos e inhalaciones
nasales. A continuacin se presenta un protocolo para la determinacin de mentol en el aceite
esencial de menta por cromatografa gaseosa con columna HP-5, 30 m, 0,32 mm x 0,25 mm (5 %-
fenilmetilpolisiloxano) y corrida isotrmica a 110 C.
a. Pesar 10 mg de mentol patrn y llevar a volumen con etanol en un matraz aforado de 10,00
mL (Solucin A)
b. Pesar 10 mg de estandar interno (octanol) y llevar a volumen con etanol en un matraz
aforado de 10,00 mL (Solucin B)
c. Tomar 1,00 mL de Solucin A y 1,00 mL de Solucin B y llevar a volumen con etanol en un
matraz aforado de 5,00 ml (Solucin C)
d. Pesar 10 mg de aceite esencial y llevar a volumen con etanol en un matraz aforado de
10,00 ml (Solucin D)
e. Tomar 1,00 mL de la Solucin D y 1,00 mL de la Solucin B y llevar a volumen con etanol
en un matraz aforado de 5,00 ml (Solucin M)
f. Inyectar 1 L de la Solucin C en el cromatgrafo. Repetir para 1 L de la Solucin M

36
En base a los datos de la siguiente tabla, determine la concentracin de mentol en el aceite
esencial expresando el resultado en % m/m
Solucin Area Mentol Area Octanol
C 95.000 98.000
M 100.000 120.000

Si en las condiciones de la corrida la resolucin entre el mentol y el octanol es de 1,5, qu

condiciones variara para mejorarla?

11) Problema Parcial

En una planta industrial se cuenta con un CGL equipado con una columna capilar polar para
realizar controles de calidad sobre los productos obtenidos en la misma. En particular, se utiliza
para cuantificar la concentracin de alcohol (etanol) en vodka.
Los patrones y la muestra incgnita -diluida 1:10- se inyectan (1 L) a 50C en el CGL, el gas
carrier utilizado es N2. Los resultados obtenidos son:
Concentracin
Solucin Componente (m/m) Area
Metanol 1.00 42009
Patrn 1
Etanol 1.00 60900
Metanol 1.00 42504
Patrn 2
Etanol 2.00 117587
Metanol 1.00 44600
Patrn 3
Etanol 3.00 210172
Metanol 1.00 44979
Patrn 4
Etanol 4.00 290570
Metanol 1.00 41283
Patrn 5
Etanol 5.00 320105
Vodka Metanol 1.00 41300
(1:10) Etanol -- 255570

Las regresiones lineales de dos curvas de calibracin (y=mx+b) posibles son:

m=1.63, b=-0.26, Sx=0.01, t=12.7

m= 69139.3, b= -7551.1, Sx=0.08, t=12.7

La medicin de la muestra incgnita se ha realizado por triplicado y el valor informado en la tabla

indica el promedio de los valores obtenidos.

a)Determine a partir de los datos cul es la concentracin de etanol en la muestra de vodka sin
diluir. Recuerde que debe informarlo junto con el error correspondiente. (Utilice la curva de
calibracin que considere adecuada indicando a qu tipo de calibracin pertenece puede usar los
datos de la tabla para identificar a qu tipo de calibracin pertenece cada regresin lineal-.)

b) Indique qu tipo de detector puede ser utilizado para esta muestra. Justifique

c) Cul de los compuestos tiene el menor tiempo de retencin para este tipo de columna?
Porqu?

d) Indique qu parmetro relevante de la cromatografa (k,,R) utilizara usted para determinar las
condiciones ptimas de separacin de ambos componentes. Qu condiciones puede variar -o ha
variado en el laboratorio- para obtener un cromatograma con la separacin de picos deseada ?

37
HPLC
1. Cual(es) es(son) los criterios de elucin para cada una de las siguientes cromatografas:
a.- lquida con columna con fase estacionaria inversa
b.- inica con columna de intercambio aninico.
2. Los parabenos se utilizan en la industria cosmtica como conservantes. Su frmula general es
dada en la figura 1, donde R es un grupo alqulico. Un fabricante de columnas de fase reversa
C18 recomienda las siguientes condiciones de uso: Fase mvil: 40/60 Acetonitrilo/agua, buffer
fosfato pH 7.0 con los resultados observados en la Figura 1.
i.- Cuando se intent hacer un cambio en la fase mvil usando 40/60 Acetonitrilo/agua,
buffer pH 4.0 se obtuvo el cromatograma de la figura 2. Qu efecto tiene en la corrida
una disminucin del pH.
ii.- Como reducira el tiempo de la corrida si tiene la posibilidad de aplicar un gradiente de
solventes.

3. Ejercicio de Parcial
El siguiente cromatograma corresponde a una mezcla de cuatro compuestos separados sobre una
columna de 25 cm longitud x 4.6 mm dimetro interno. La fase mvil utilizada fue methanol:etanol
80:20 y el flujo 0.9 mL/min. Si un compuesto no retenido en la columna tarda 1 minuto en salir,
calcular:
a) El tiempo de retencin, tiempo de
retencin corregido y el factor de
retencin para todos los analitos.
b) El factor de separacin de la columna
para todos los analitos.
c) El nmero de platos tericos y la
altura equivalente de plato terico de
la columna, calculados a partir del
analito mas retenido.
d) La resolucin de la columna para los
analitos.

4. Ejercicio de Parcial
a) Se ha llevado a cabo un estudio de determinacin de 4 antidepresivos tricclicos por HPLC
utilizando tres columnas de polaridades diferentes: C8, con grupos fenilo terminales y con grupos
ciano terminales. A continuacin se muestran las estructuras de los cuatro compuestos estudiados,
las constantes de acidez correspondientes al grupo mas bsico, y los tres cromatogramas
obtenidos en las mismas condiciones de flujo y composicin de fase mvil.

38
 Nortriptilina Doxepina Amitriptilina Trimipramina
pKa: 10,1 9,76 9,4 9,42

A partir de los cromatogramas anteriores, asigne cada uno de ellos a cada tipo de columna
utilizada, justificando adecuada y brevemente su respuesta.
b) Se estudia la separacin de dos compuestos A y B por HPLC utilizando una columna C-18. La
fase mvil es una fase binaria compuesta por agua y acetonitrilo. Se ha encontrado una relacin
lineal entre el logaritmo del factor de retencin y el % de acetonitrilo en la mezcla utilizada.
Se obtuvieron una serie de cromatogramas a composiciones variables, obtenindose dos rectas
cuyas ecuaciones son:
Para el compuesto A:
log KA = - 6.075x10-3 (%CH3CN) + 1.3283

Para el compuesto B:
log KB = - 0.0107 (%CH3CN) + 1.5235

i) Encuentre la composicin de la fase binaria para la cual el factor de selectividad = 1.

ii) Teniendo en cuenta su respuesta anterior, cmo debera ser la composicin de la fase
mvil para obtener una mejor separacin?

c) Un fabricante presenta los resultados de la separacin de dos compuestos A y B utilizando una

nueva columna, para la cual no muestra los cromatogramas a distintas composiciones de fase
mvil, sino una tabla de valores de k, y R.
i) Qu es y qu representa cada uno de los parmetros mencionados?
ii) Cul de ellos es el mejor para determinar la eficiencia de separacin de esta columna?
Justifique adecuadamente su respuesta.
ESPECTROSCOPIA DE EMISION ATOMICA

39
1) Discuta la influencia de la temperatura de la llama sobre las seales obtenidas en EEA y en
EAA.
2) Analice ventajas y desventajas de la utilizacin de una llama de xido nitroso-acetileno frente a
una llama de aire-acetileno en el trabajo prctico. Podra utilizar una llama de aire-butano?
3) Analice la influencia de cantidades sub-, sobre- y estequiomtricas de fosfato, con respecto a
Ca, en la muestra a analizar.
4) Utilizara el procedimiento del trabajo prctico para determinar Ca en agua de mar? Discuta.
5) Discuta la conveniencia de utilizar el mtodo del agregado patrn frente al mtodo de la curva de
calibracin en determinaciones por espectrometra de emisin por llama.
6) Discuta brevemente cmo espera que vare la sensibilidad en la determinacin de Ca en agua
mineral cuando se aumenta la ranura del monocromador.
7) Sugiera posibles explicaciones para las siguientes observaciones efectuadas cuando se
determina Ba en solucin acuosa por espectrometra de emisin en llama:
i) La emisin a la longitud de onda analtica, para bajas concentraciones, es despreciable si la
llama es de aire-acetileno, pero apreciable cuando la llama es de xido nitrosoacetileno.
ii) El Ba presenta lneas de emisin a 553.55 nm y 455.40 nm. La intensidad observada en
una llama laminar de xido nitroso-acetileno para una solucin de 10 m/ml es apreciable a
ambas longitudes de onda. Pero si se agregan a la solucin cantidades crecientes de
cesio, la emisin de la primera lnea se incrementa hasta alcanzar un valor constante, en
tanto que la emisin de la segunda disminuye.
iii) Con la llama de xido nitroso-acetileno, al variar la altura de observacin sobre el
quemador de 4 mm a 20 mm, la intensidad de emisin disminuye abruptamente, pero
vuelve a aumentar al incrementar ligeramente el flujo de acetileno.
8) Para determinar Ca por emisin atmica, 5 g. de una muestra de origen geolgico se disuelven
en un volumen dado de una mezcla cida, se filtra y se disuelve a 100 ml. Para estimar la
concentracin residual de Ca se prepara un blanco de reactivos con un volumen de mezcla
cida igual al doble del anterior, diluido a 100 ml. Muestra y blanco se analizan por el mtodo del
agregado patrn, con los siguientes resultados (las concentraciones indicadas corresponden a
mg/ml de Ca agregado en cada caso, a alcuotas de 20 ml, despreciando la variacin de
volumen). Calcular el % de Ca en la muestra original.
MUESTRA BLANCO
Agregado (mg/ml) Apromedio Agregado (mg/ml) Apromedio
0 0.100 0 0.100
0.1 0.160 0.02 0.170
0.2 0.220 0.04 0.290
0.3 0.290 0.06 0.380

9) En la llama de N2O - C2H2 el Ba(I) presenta una lnea de emisin a 553.55 nm que se superpone
a una banda molecular correspondiente a CaOH. El espectro observado para 0.5 mg Ba/mL en
presencia de concentraciones elevadas de Ca es el siguiente:

Cmo determinara en este caso la relacin de intensidades lnea -

fondo?
Indique qu parmetros instrumentales podran variarse para
mejorar ese valor.
Justifique su respuesta.
10) Ejercicio de Parcial

40
 El cloruro de rubidio (RbCl) es un excelente biomarcador no invasivo. Este compuesto se
disuelve bien en agua y es fcilmente asimilado por el organismo. Una vez en el cuerpo, el ion Rb+
reemplaza el ion potasio (K+) en los tejidos debido a su similitud qumica (pertenece al mismo grupo
de la tabla peridica). Un ejemplo de esto es el uso de 82RbCl, istopo radiactivo, para evaluar la
perfusin (llevar oxgeno y nutrientes a un tejido por medio de la sangre) del msculo del corazn,
el miocardio.
El rubidio tiene intensas lneas de emisin a 420.1 nm y 780.0 nm. Para hacer una
determinacin cuantitativa del analito se procede a hacer una calibracin externa con un estndar
certificado del mismo en cada una de esas lneas de emisin.
Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla. El valor informado para cada patrn
es el obtenido de integrar durante 10 segundos la seal para cada solucin.
Lnea 780,0 nm Lnea 420,1 nm
ppm Rb Intensidad ppm Rb Intensidad
0 47 0 5
0 44 0 45
0 46 0 30
0 45 0 16
0 43 0 54
0,2 61 10 155
1,0 124 20,0 280
2,0 206 25,0 602
10,0 845 35,0 468
25,0 2045 40,0 531
40,0 2429 60,0 780
50,0 2534 80,0 1030
60,0 2606 100,0 1055
1. Se quiere cuantificar una solucin de rubidio. Se toman dos alcuotas de la muestra y se mide su
emisin a las dos longitudes de onda obtenindose los siguientes resultados. Cuantifique.
Explique.
Alcuota 1 2
780,0 nm - Intensidad 1361 1369
420,1 nm - Intensidad 238 234
Ayuda: Haga un boceto de ambas rectas.
2. El cloruro de rubio presenta polimorfismo dependiendo de las condiciones de cristalizacin.
Se quiere determinar el porcentaje de rubidio en un mineral para ello se toman dos
porciones del residuo (Masa Mineral), se disuelven completamente en agua milliQ, se lleva
a volumen en matraz de 50 mL y se mide su emisin con un equipo similar al utilizado en la
prctica. Cuantifique.
Porcin 1 2
Masa Mineral / g 1,0483 1,14538
780,0 nm - Intensidad 2419 2483
420,1 nm - Intensidad 515 575

3. Explique las siguientes observaciones

a. Cuando se realiza la misma calibracin en el rango de bajas concentraciones
agregando KCl o CsCl respectivamente se obtienen las siguientes curvas de

41
 calibracin. Asigne cul curva corresponde a KCl y cul a CsCl. Explique
brevemente.

Ayuda: Mr Cl = 35.35 gr/mol ; Mr K = 39.09 gr/mol ; Mr Rb = 85.46 gr/mol ; Mr Cs = 132.91 gr/mol

b. Cuando se realiza la misma experiencia que el punto 1, pero cambiando las condiciones de la
llama (FA: flujo acetileno ; FO: flujo oxidante) se observa el siguiente fenmeno. Explquelo e
indique en que llama tiene mayor temperatura.

c. A continuacin se observa un grafico de Intensidad (c.a) vs. longitud de onda (nm).

420.1 nm
415.1 nm
425.1 nm

42
 I. Que tipo de interferencia espectra para este sistema. Como la remedia?
II. El analista percibio la interferencia y para contrarrestarla realiz una curva de agregado
patron, para lo cual tom 5 matraces de 50 ml y agreg 1 ml de una solucion de 1000
ppm de cloruro de rubidio en cada uno. Como resultado de la cuantificacion obtuvo 25
ppm de Rb. Es correcto lo realizado? Ud informaria ese valor?
III. Si se quisiera medir la misma muestra por absorcin atmica (con la lmpara de catodo
hueco correspondiente), tendra sentido medir utilizando correccin de fondo con una
lmpara de deuterio?? En las 2 lineas??

11) Ejercicio de Parcial

Se desea cuantificar el contenido de Ca en 30 muestras de orina y para ello se compararon tres
metodologas distintas en una misma muestra. En todas ellas se utilizaron los siguientes
parmetros:
Lnea 422,7 nm. Ranura 0,7 m. Llama aire-acetileno estequiomtrica.

a) Absorcin atmica con correccin de fondo espectral

Curva de Calibracin con 5 soluciones entre 0 y 3 mg Ca/l, diluciones con agua milliQ.
A = (0.0470.001) . (Ca) + 0.001 r2= 0.9997
con (Ca) en mg/l
Dilucin 1:100 de la muestra A = 0.031

b) Emisin atmica en llama

b.1 Curva de Calibracin con 5 soluciones entre 0 y 12 mg Ca/l, diluciones con solucin 0.5% de
LaCl3 y 0.1% de KCl
Ie = (3779) . (Ca) + 28 r2= 0.998
con (Ca) en mg/l
Dilucin 1:25 de la muestra Ie = 1350

b.2 Agregados patrn de 2, 4 y 6 mg Ca/ l en la dilucin final, sobre 2 ml de muestra llevados a 50

ml con solucin 0.5% de LaCl3 y 0.1% de KCl
Ie = (38010) . (Ca) + 1390 r= 0.9996
con (Ca) en mg/l
a) Seleccione una de las tres metodologas para analizar las 30 muestras y justifique su eleccin.
b) Cuantifique el contenido de Ca en la muestra analizada
c) Explique, si fuera posible, cmo podra mejorar la exactitud de las dos metodologas que no
eligi.

12) Ejercicio de Parcial

Se desea cuantificar Cr en acetona para lo cual se prueban los siguientes cuatro protocolos
experimentales:
a) Se preparan patrones de cromo en solucin acuosa cubriendo un rango de concentraciones
entre 2 y 8 ppm, se selecciona como longitud de onda de trabajo 357,9 nm y se emplea una llama
estequiomtrica de aire-acetileno, una intensidad de lmpara de 5 mA y un ancho de ranura de 0,5
nm.

Los parmetros de mrito obtenidos fueron:

A = a*[Cr] + b con a = 0,078 +/- 0,001 ppm-1 b = 0,090 +/- 0,009 r2 = 0,9975
Una dilucin 1/5 de la muestra en agua destilada arroj una lectura de absorbancia de 0,610

43
b) Se realiz una curva de agregado patrn con las mismas condiciones experimentales sobre
alcuotas diludas 1/5 de la muestra en agua destilada, obtenindose las siguientes figuras de
mrito:
A = a*[Cr] agregado + b con a = 0,086 +/- 0,001 ppm-1 b = 0,608 +/- 0,009 r2 = 0,9895

c) Se preparan patrones de cromo en solucin acuosa cubriendo un rango de concentraciones

entre 10 y 40 ppm, se selecciona como longitud de onda de trabajo 425,4 nm y se emplea una
llama estequiomtrica de aire-acetileno, una intensidad de lmpara de 5 mA y un ancho de ranura
de 0,5 nm. Los parmetros de mrito obtenidos fueron:
A = a*[Cr] + b con a = 0,025+/- 0,002 ppm-1 b = 0,000 +/- 0,004 r2 = 0,9901
Una dilucin 3/5 de la muestra en agua destilada arroj una lectura de absorbancia de 0,508 y la
muestra tal cual un valor de 0,924

d) Se realiz una curva de agregado patrn con las mismas condiciones experimentales del
protocolo 3 sobre alcuotas diludas 3/5 de la muestra en agua destilada, obtenindose las
siguientes figuras de mrito:
A = a*[Cr] agregado + b con a = 0,0282 +/- 0,002 ppm-1 b = 0,510 +/- 0,004 r2 = 0,9877

Se pide:
a) Cuantifique el contenido de cromo en la muestra a travs de cada uno de los protocolos
experimentales tanto para las muestras diludas como para la muestra sin diluir
b) Justifique las diferencias entre cada uno de los valores encontrados
c) Indique cual de los protocolos seleccionara para analizar nuevas muestras
d) Qu variables experimentales cambiara para realizar la determinacin por emisin atmica?
Justifique
e) Calcule el lmite de deteccin y cuantificacin de la metodologa utilizada.

13) Ejercicio de Parcial

Verdadero o Falso. Justifique su respuesta
a) El tiempo muerto depende principalmente de la temperatura de trabajo.
b) Si se obtiene una buena recta por calibracion externa, no es necesario usar un patron interno.
c) Para determinar los parametros cromatograficos se utiliza tr, ya que es el que mide el tiempo
total de residencia del analito en la columna.

14) Ejercicio de Parcial

El piruvato de sodio (Frmula molecular: C3H3NaO3; Mr = 110,04 g/mol) se utiliza comnmente
para la preparacin de soluciones reguladores en medios de cultivo. Para determinar la pureza de
la sal el laboratorio de control de calidad en el que usted es analista utiliza como metodologa
analtica Espectrometra de Emisin Atmica.
Para ello se desarrolla el siguiente protocolo: se disuelven por quintuplicado
0,5000 g de muestra en HNO3 al 1 % y se trasvasan a matraces aforados de 250,0 mL
completndose el volumen con agua Milli-Q. De estas soluciones se toman alcuotas de 0,10 mL,
se transfieren a matraces aforados de 100,0 mL y se completa el volumen. Estas soluciones se
rotulan como M1, M2, M3, M4 y M5, respectivamente. Por otra parte se preparan patrones de Na
de 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 ppm.

44
Los patrones de calibrado y las muestras se miden en un espectrmetro de emisin atmica con
llama de aire/acetileno a 589,0 nm usando un paso de banda de 0,1 nm (el sodio tiene un doblete
de emisin a 589,6 nm). Los parmetros de regresin y la curva de calibracin se muestran al final.
Paralelamente se realiza un blanco metodolgico obtenindose los siguientes valores de intensidad
de emisin: 0, 1, 2, 3, 1, 2, 0,2, 1 y 2.
a) Explique a qu se deben las diferencias entre los dos sets de parmetros de regresin
b) Cul es la mnima concentracin de sodio detectable por esta metodologa?
c) Las intensidades de emisin de las muestras fueron de 73, 74, 72, 71 y 75,
respectivamente. De acuerdo a las especificaciones tcnicas del producto el contenido mnimo de
piruvato de sodio debe ser de 99,5 +/- 0,5. Qu decisin adoptara con respecto a la aprobacin o
rechazo de la partida? (el valor del t de Student para n-1 grados de libertad y 95 % de confianza es
de 2,78)
d) Cmo espera que se modifiquen las figuras de mrito del anlisis si utiliza un ancho de
banda de 1 nm?.
e) En caso de que decidiera implementar una metodologa basada en absorcin atmica,
discuta si los siguientes argumentos resultaran convincentes para que el laboratorio adquiera una
lmpara de ctodo hueco de Na, i) las medidas por absorcin atmica son ms exactas y
sensibles, ii) las medidas por absorcin atmica son ms precisas

200
y = 162.41x + 2.0877
150
Intensidad

R = 0.9679
100

50

0
0 0.5 1 1.5
Na, ppm

Frmula auxiliar:
X +/- t.s / n1/2

Parmetros de regresin sin considerar los patrones de 0,1 y 1,0 ppm:

y = 178,1x + 0,5005
R2 = 0,9984

ESPECTROSCOPIA ABSORCION ATOMICA

1) Discuta las ventajas y desventajas que reporta trabajar con intensidades de lmpara ms altas
que las recomendadas por el fabricante.
2) Por qu si la lmpara de ctodo hueco es una fuente de lneas es necesario utilizar un
monocromador?
3) Es posible utilizar la instrumentacin de espectrofotometra molecular para realizar medidas en
absorcin atmica?
4) En la determinacin de nquel el ancho de banda espectral juega un rol fundamental cuando se
trabaja a una longitud de onda de 232 nm, ya que si se pasa de un ancho de banda de 0,1 nm a
0,5 nm la sensibilidad y el mbito dinmico lineal disminuyen. Sin embargo, cuando se
determina Cu a una longitud de onda de 324,7 nm, el mismo cambio de ancho de banda no

45
 produce prcticamente variacin de sensibilidad ni de los mbitos de linealidad. Discuta las
causas de este comportamiento diferente.
5) Discuta la conveniencia de corregir el fondo espectral en las mediciones realizadas en el trabajo
prctico.
6) Discuta crticamente las siguientes afirmaciones:
a) La absorcin atmica es ms sensible que la emisin atmica.
b) Modular electrnicamente la lmpara de ctodo hueco permite corregir la absorcin
inespecfica de los componentes de la llama.
c) En absorcin atmica el mbito de linealidad depende del tipo de llama utilizada.
7) Una muestra de NaCl contiene Cu (II) en una concentracin de aproximadamente 0,003 %.
Disee un protocolo de anlisis que permita la cuantificacin del cobre indicando: masas,
volmenes, reactivos a utilizar, preparacin de la muestra y patrones, procedimiento general y
clculos.
8) Ejercicio de Parcial
El agua de consumo que recorre caeras de plomo puede presentar niveles peligrosos de este
metal. La ingesta continua de aguas contaminadas con plomo provoca intoxicaciones por elevada
plumbemia (nivel de plomo en sangre). El valor lmite de plumbemia que considera a los individuos
fuera de peligro es de 50 g/L.
Se tomaron muestras de sangre (M1 a M4) a cuatro habitantes de un edificio muy antiguo del
centro porteo, las cuales fueron sometidas a anlisis por espectrometra de absorcin atmica de
llama. Para esto se ensayaron diferentes mtodos utilizando una lmpara de ctodo hueco del
metal, una ranura estrecha, y se realiz una digestin cida que trajo aparejada la dilucin al medio
en los cuatro casos. El blanco de reactivos fue realizado y restado antes de confeccionar toda
curva de calibracin. Se utilizaron dos lneas de plomo diferentes, 1 = 217 nm y 2 = 283,3 nm. La
curva de calibracin para todos los casos fue externa, de cinco patrones entre 50 y 500 g/L. Las
variaciones entre mtodos fueron:
A) 1 sin correccin de fondo.
B) 1 con correccin de fondo con lmpara de deuterio.
C) 2 con correccin de fondo con lmpara de deuterio.
Los resultados obtenidos fueron:
Mtodo Regresin Seal M1 Seal M2 Seal M3 Seal M4
A y=0,003x+0,200 0,520 0,295 0,987 0,241
B y=0,003x+0,001 0,307 0,079 0,751 0,031
C y=0,0015x+0,001 0,144 0,037 0,383 0,013
Nota: considerar el error en los parmetros de regresin en la ltima cifra indicada. Los valores de x
se deben tomar en g/L.

a) qu mtodo seleccionaras y por qu?

b) se pueden identificar interferencias de matriz? de qu tipo?
c) Cuantific plumbemia para todos los individuos. qu le recomendaras a cada uno?

9) Ejercicio de Parcial
Se desea cuantificar el contenido de aluminio en una muestra de Titanio Grado 5 (contiene aluminio
y vanadio como aleantes), utilizando espectrometra de absorcin atmica. Se mide la seal de
absorbancia a 309.3 nm., utilizando llama de N20- C2H2 y correccin de fondo con lmpara de
deuterio.

46
Para ello se pesan 380 mg., se disuelven en una mezcla cida y se llevan a 250 ml en matraz
(Solucin A). Se toma una alcuota de 10 ml y se lleva a 100 ml previo agregado de solucin de Cs
y La (concentracin final de ambos 1000 ppm). La Absorbancia medida es 0.079.
Se realizan las siguientes curvas: a) curva de calibracin sin agregado de Cs y La. b) curva de
calibracin con agregado de Cs y La (concentracin final de ambos 1000 ppm). c) mtodo de
agregado patrn con 10 ml de Solucin A) y Volumen final 100 ml, con agregado de Cs y La.

(ppm) 0 5 10 20 30 50
Curva 1 (A) 0.002 0.021 0.074 0.162 0.239 0.402
Curva 2 (A) 0.003 0.052 0.099 0.214 0.295 0.511
Agregado patrn (ppm) 0 5 10 20 30 50
Curva 3 (A) 0.079 0.132 0.171 0.261 0.348 0.435

a) Justifique cul de las curvas utilizar para realizar la cuantificacin, explicando

detalladamente las diferencias observadas entre ellas.

b) Estime el mbito dinmico lineal en las condiciones de operacin elegidas.

c) Calcule el % de Al en la muestra.

10) Ejercicio de Parcial

Se quiere determinar la concentracin de Zn en una muestra de orina utilizando un espectrmetro
de absorcin atmica sin correccin de absorcin de fondo. Se supone que la muestra de orina
puede presentar interferencias espectrales y qumicas, las mismas de la orina sinttica.
Para ello se realizan los siguientes Protocolos de anlisis:
1) Curva de Calibracin a 213.9 nm (ranura 0.7 nm), con patrones preparados en matriz de orina
sinttica, intervalo 0.1 a 1.2 mg Zn/ litro:
A = 0.25 C (mg/l) + 0.060 r = 0.9996
Medicin de la muestra sin diluir A = 0.209
2) Curva de agregado patrn a 213.9 nm (ranura 0.7 nm), con agregado de solucin patrn de Zn a
alcuotas de una dilucin 1:5 de la muestra:
A = 0.21 C (mg/l) + 0.042 r = 0.09997
a) Justifique el valor de la ordenada al origen en la curva de calibracin
b) Justifique si puede emplear nicamente la Curva de agregado patrn para realizar el anlisis.
c) Calcule la concentracin de Zn en la muestra.

ESPECTROSCOPIAS OPTICAS (segundo parcial)

Los 4 ejercicios son de parciales
1) Indique V o F y justifique
a) Un instrumento con una fuente de luz monocromatica capaz de emitir ms intensidad de luz
aumentar la sensibilidad de una absorciometria y de una fluorimetria.
b) Se mide un espectro de fluorescencia en una solucin acuosa de riboflavina y se obtiene un
archivo con el valor de la emisin cada 0.1 nm. Si se hace un promedio de ventana con un
ancho de 10 mediciones se obtiene un espectro con menos ruido sin que cambie
apreciablemente la forma del espectro obtenido.
c) en el espectro obtenido en el punto (b) mediante el promedio de ventana de 10 mediciones,
el ruido se reduce aproximadamente a la decima parte.
d) para medir valores de absorbancia por medio de una cmara fotogrfica digital no es
necesario utilizar fuentes de luz de alta monocromaticidad, ya que la misma cmara
contiene filtros capaces de discriminar las diversas longitudes de onda.

47
(el siguiente punto NO ES un Verdadero o Falso)
e) se toman durante un da fotografas areas de una laguna donde navegan continuamente
lanchas y botes para determinar mediante el anlisis de la reflexin a ciertas longitudes de onda
la presencia de contaminantes y de esa forma hacer una mapa 2D del estado de la laguna. Se
puede tomar un fotograma cada 1 minuto. Explique en menos de 10 renglones cual es el primer
paso que efectuara en ImageJ (o cualquier programa similar) para obtener una imagen inicial
con el menor ruido posible, incluyendo eliminar las embarcaciones (que tambin son ruido).

2) Para determinar la concentracin de un analito, se marca este con una sonda fluorescente
cuyo fluoroforo es Rodamina 123. Los espectros de absorcion y de emision normalizados se ven en
la figura superior. (Max abs = 45000 M-1cm-1 a 513 nm, Max emi. a 533 nm)
Para efectuar la determinacion se utilizar un especrofluormetro de matriz de diodos con
excitacion a LED. Se dispone de 3 LEDS a 405, 473 y 510 nm cuyos espectros se muestran en la
figura inferior. Las cubetas tienen 1cm de paso ptico, de 4 caras pulidas y medicin en la parte
central de la misma, a 90 grados respecto de la excitacin.
Elija el LED mas adecuado para medicion de fluorescencia. Justifique brevemente.
a) Explique brevemente la razon por la cual el espectro
de emision est corrido a la derecha y tiene una 1.2
forma similar al de absorcion. 1
b) Sabiendo que el detector tiene un rango de 0 a 4096 0.8
unidades, y un error =43 u.a. constante en todo el 0.6
rango, y que una concentracin de analito de 1 M
0.4
produce una salida de 3040 u.a.,.estime los lmites
0.2
de deteccin y de cuantificacin para dicho analito.
c) Sabiendo que se puede reducir la sensibilidad del 0
detector, y que ste es lineal en todas las 350 450 550 650
condiciones de medida A que concentracin
estima Ud. que las medidas de fluorescencia
1
comenzarn a ser
alineales ? Justifique en menos de 5 renglones. 0.5
0
350 450 550 650

3) Es necesario determinar la concentracin de Hg2+ en una muestra incgnita. Para ello se

dispone de dos mtodos alternativos: uno absorciomtrico y uno fluoromtrico.
En el mtodo de absorcin, 1 mL de la muestra se mezcla con 2 mL de un reactivo colorimtrico
que genera un complejo coloreado de estequiometra 1:1 que tiene el espectro que se indica en la
figura 1. Al medir la muestra se encuentra que la absorbancia es 0.195 a 435 nm en una cubeta de
1cm de paso ptico. Cuando se lo utiliza del modo adecuado con este mtodo analtico, la medicin
espectrofotomtrica tiene una desviacin estndar experimental que se ve en la figura 2.

En el mtodo fluoromtrico, 1 mL de la muestra incgnita se mezcla con 2mL de otro reactivo que
produce un compuesto fluorescente. Al medir repetidamente la emisin en un espectrofluormetro
a 566 nm se miden 7620 u.a. (promedio) con un desvo estndar f = 27.

a) Estime el lmite de deteccin y de cuantificacin para Hg2+ con el mtodo de absorbancia.

b) Calcule la concentracin de Hg2+ en la muestra.
c) Estime cul de los dos mtodos presenta menos incertidumbre para determinar Hg2+ en las
condiciones indicadas. Justifique su respuesta en base a calculos simples.

48
(Suponga linealidad en el mbito de aplicacin, y ausencia total de interferencias y desviaciones a
la ley de Lambert Beer)

8000 0.001
Figura 1 0.0009
Figura 2
7000
1 0.0008
6000

sigma (absorbancia)
0.0007
epsilon / M-1cm-1

5000
0.0006

4000 0.0005

0.0004
3000
0.0003
2000
0.0002
1000 0.0001

0 0
250 350 450 550 650 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

lambda / nm absorbancia

4) Indicar Verdadero o Falso, justificando la respuesta.

a) Una imagen de 600 x 200 pixeles contiene la informacin sobre la concentracin de un frmaco
en la superficie de un comprimido. Cuando se toma un cuadrado de 10x10 pixeles, la medicin da
3.2 0.6 mg/cm2 (95%).
Si se quiere reducir la incertidumbre a 0.3 mg/cm2, basta con aumentar la superficie de la
medicin a 20x20 pixeles.

b) En una medicin de emisin fluorescente, es necesario colocar en la cubeta una solucion de

absorbancia baja, debido a que a absorbancias altas el corrimiento de Stokes se reduce,
impidiendo separar correctamente la luz de excitacion de la de emisin.
La emision de un compuesto se utiliza para determinar su concentracion. La forma del espectro de
emision de concentraciones crecientes 0, 1, 2, 4,10, 15 nM se muestra en la figura 1 y los valores
numericos se muestran en la tabla.

c / nM Integracin medida a
480-580nm 537 nm
0 -11117 -111.6
1 167632 714.2
2 318521 2336.2
4 656125 4012.3
10 1617965 9757.5
15 2420588 14212.0

Protocolo 1: integracion de la emision entre 480 y 480 580 680 780

580 nm y [u.a.] = 161668 c[nM] - 611.75 r2 = 0.9999
Protocolo 2: medicion a la lambda maxima de emision, a 537 nm, y[u.a.] = 954.07
c[nM] + 65.048 r2 = 0.998
La medicion de 10 blancos conteniendo solo la matriz dio a 537 nm dio promedio = -52 unidades
con = 302 unidades. La misma medicion integrando entre 480 y 580 nm dio un promedio = -4508
unidades con = 3900 unidades.

a) Justifique en menos de 10 renglones cual de los mtodos (medicion en el maximo a 537 nm vs

integracion entre 480 y 580nm) le parece mas adecuado.
b) Estime el limite de cuantificacion para ambos metodos. Explique en no mas de 5 renglones la
diferencia que encuentra entre estas cifras de merito.
c) una impureza fluorescente que se forma durante el tratamiento tiene un espectro de emision
entre 540 y 600 nm. Indique en este caso como modificaria el protocolo de medicion.

49
d) la absortividad molar maxima de la substancia medida es 456 = 16000 M-1cm-1. Explique en base
a este parmetro por qu su medicin por fluorescencia presenta un menor limite de deteccion y
cuantificacion. existen condiciones instrumentales en que la medicion de absorbancia seria mejor?

50