Rev Inst Nal Cancerol (Mex)
1999; 45 (4).
Artculo original
ADN del virus del papiloma humano
en plasma de pacientes con
carcinoma cervicouterino: Un potencial
marcador de enfermedad residual mnima
Alfonso Dueas,*,** Adela Carrillo,* Litzie Fresnedo,*
Luz Mara Hinojosa,*** Citlalli Rojas,* Alejandra Snchez-Navarro,*
Catalina Trejo,* Carlos Lpez G,*** Blanca Segura,* Marcela Lizano*
RESUMEN
Antecedentes: El carcinoma cervicouterino es la primera
causa de muerte por cncer en mujeres mexicanas. Estudios
moleculares han demostrado que el virus del papiloma hu-
mano (VHP) es el principal agente etiolgico de esta enfer-
medad. En este tumor no existe un marcador sensible y espe-
cfico que pudiera utilizarse como marcador de enfermedad
residual mnima y para prevenir recadas tempranamente.
Dado que la amplificacin en plasma de secuencias de ADN
especficas a tumores se ha utilizado con este fin, en este tra-
bajo se determin la factibilidad de amplificar, mediante reac-
cin en cadena de la polimerasa en el ADN del plasma, se-
cuencias de VPH en pacientes con cncer cervicouterino.
Material y mtodos:Se analizaron 34 pacientes con carci-
noma cervicouterino invasor con diferentes estadios clnicos
sin tratamiento previo y 24 mujeres con infeccin cervical
por VPH pero sin lesiones invasoras. La extraccin del ADN
se realiz mediante tcnicas estndar: digestin con proteina-
sa K, extraccin con fenol-cloroformo y precipitacin con
etanol. Para verificar la calidad del ADN, se amplific un
fragmento del gen de la -globina. Las secuencias del VPH se
amplificaron con los oligonucletidos generales LICI-LIC2.
Las muestras positivas tambin se amplificaron con oligonu-
cletidos especficos para VPH tipos 16 y 18. Resultados:
ADN del VPH se encontr en el 70% de los casos de pacientes
con cncer y no se amplific en los 24 controles. No se en-
contr correlacin entre el resultado de la reaccin en cadena
de la polimerasa con el estadio clnico ni con el tipo viral,
pero se observ menor frecuencia de positividad en los tumo-
res adenoescamosos. Conclusin: Los resultados sugieren
* Divisin de Investigacin Bsica. Instituto Nacional de
Cancerologa (INCan). Mxico, D.F.
* * Departamento de Oncologa Mdica. (INCan).
*** Departamento de Ginecologa. (INCan).
Fecha de recepcin 03/08/99. Fecha de aceptacin 07/09/99.
203
Vol. 45, Nm. 4
Octubre-Diciembre 1999
pp 203 - 208
que la deteccin del ADN del VPH en el plasma de las pacien-
tes es especfica de aqullas con cncer invasor y que esto po-
dra constituir un marcador de enfermedad residual mnima
y predictor temprano de recadas.
Palabras clave:Cncer cervicouterino, virus del papiloma
humano, reaccin en cadena de la polimerasa.
ABSTRACT
Background: Cervix carcinoma is the main cause of cancer
death in Mexican women. There are molecular evidences that
the human papillomavirus (HPV) is implicated in its develop-
ment. In this tumor there is not yet a useful marker of mini-
mal residual disease nor to detect early recurrences. In other
tumors, the PCR amplification of tumor-specific DNA se-
quences from the plasma of cancer patients with that aim has
been reported. In this work we have determined the feasibility
of amplifying VPH sequences from the plasma DNA in patients
with cervix cancer. Material and methods:We analyzed 34
patients with untreated cervix cancer irrespective of the clini-
cal stage and 24 patients with proven HPV cervical infection
but no invasive disease. DNA was obtained from the plasma
using standard techniques: proteinase K digestion, phenol-
chloroform extraction and ethanol precipitation. To verify the
quality of DNA a fragment of the -globin gene was ampli-
fied. HPV sequences were amplified using the primers LICI-
LIC2 and the positive samples were also typified using prim-
ers specific for types 16 and 18. Results: HPV sequences were
amplified in 70% of the patients with cancer and the PCR was
negative for the 24 control women. There was no correlation
between the DNA amplification and clinical stage or viral
type, however, adenosquamous tumors were more frequently
negative. Conclusion: Our results suggest that the detection
of HPV DNA in plasma is specific for patients with invasive
cervical cancer and that it could be a marker for minimal re-
sidual disease and for early detection of relapse.
Key words: Cervical cancer, human papillomavirus,
polymerase chain reaction.
 Dueas A y cols. ADN del virus del papiloma humano como marcador de enfermedad residual mnima en cncer cervicouterino
204
El cncer cervicouterino (CaCu) representa la prin-
cipal causa de muerte por neoplasias en mujeres
mexicanas.1 El virus del papiloma humano (VPH)
es el principal agente etiolgico, ya que el cido
desoxirribunocleico (ADN) de este virus se ha iden-
tificado en ms de 90% de las muestras de carcino-
ma cervicouterino.2 En el tumor no existe un mar-
cador de utilidad demostrada para evaluar la res-
puesta al tratamiento ni para detectar de manera
temprana las recurrencias.
Desde hace varios aos se ha demostrado que el
ADN se encuentra circulando en el suero tanto de
individuos normales como de pacientes que pade-
cen cncer. En stos ltimos la cantidad de ADN
circulante se relaciona directamente con la carga
tumoral, ya que los niveles de ADN en suero dis-
minuyen en el 99% de losenfermos con mejora cl-
nica, reduccin del tamao tumoral; o aumentan
en caso de progresin. 3
La amplificacin mediante reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR) del ADN en plasma de se-
cuencias especficas a tumores como oncogenes
mutados, podra utilizarse como un marcador de
enfermedad residual mnima, como predictor de re-
cada y para valorar la respuesta al tratamiento.
En este sentido, el oncogn K-ras mutado se ha
encontrado en suero de pacientes con carcinoma de
pncreas y colorrectal,4 as como el oncogn N-ras
en la leucemia mieloblstica aguda y sndromes
mielodisplsicos. 5 Se ha observado que el tipo de
mutacin encontrada en el tumor primario es
siempre la misma que la detectada en el suero o
plasma de los pacientes con estas neoplasias, lo
cual hace factible su utilizacin como marcador de
respuesta al tratamiento.
Por otro lado, tanto en carcinomas de cabeza y
cuello, como en el de clulas pequeas de pulmn,
se ha detectado la presencia de microsatlites de
ADN en suero, lo que correlaciona especficamente
con la alteracin detectada en el tumor prima-
rio. 6,7 Finalmente, se ha amplificado con PCR 8,9
reordenamientos del gen de cadenas pesadas de in-
munoglobulinas en plasma de pacientes con linfo-
mas. Esto resulta de gran utilidad para evaluar la
respuesta al tratamiento y para detectar la presen-
cia de enfermedad molecular residual; adems de
que pudiera predecir recadas. Por lo anterior,
dado que el ADN del VPH se encuentra ya sea en
forma episomal o integrado en las clulas tumora-
les del crvix, su deteccin en el suero o plasma
podra ser posible y de utilidad para monitorear la
respuesta y predecir recadas tempranas.
MATERIAL Y MTODOS
Pacientes
Pacientes con cncer: Se analizaron 34 mujeres con-
secutivas con cncer cervicouterino, independiente-
mente del estadio clnico e histologa del tumor, que
acudieron al Instituto Nacional de Cancerologa. El
nico requisito para ser incluidas en el estudio fue
la disponibilidad de biopsia del tumor primario y
sangre, y que otorgaran su consentimiento para par-
ticipar en el estudio.
Pacientes sin cncer: El grupo control estuvo
constituido por pacientes que acudieron a la con-
sulta externa del Hospital Gea Gonzlez por diver-
sos motivos, todos ellos patologa benigna del
tracto genital inferior o simplemente para citolo-
ga de rutina. A estas mujeres, se les tomaba biop-
sia cervical y muestra de sangre como parte de
otro estudio (no relacionado y efectuado por otra
institucin) relacionado con el factor de crecimien-
to epidrmico.
Extraccinde ADN
Extraccin del ADN: El tejido (biopsias de crvix) se
deposit en un tubo eppendorf; se disgreg mecni-
camente y se adicionaron: 400 L de tampn de lisis
(Tris 50 mM +EDTA 1 mM), 12 L de SDS 20% y 6
L de proteinasa K (20 mg/mL). Posteriormente, la
muestra se incub a 55o C durante toda la noche.
Extraccin del ADN de plasma: Se recolectaron
3 mL de sangre en un tubo que contena EDTA
(tubo para biometra hemtica) y, una vez centri-
fugados, se tomaron 500 L de plasma en un tubo
eppendorf al cual se adicionaron 1,000 L de tam-
pn de lisis (Tris 50 mM +EDTA 1 mM), 25 L de
SDS 20% y 12 L de proteinasa K (20 mg/mL).
Posteriormente, la muestra se incub a 55 o C toda
la noche. Despus de la digestin con proteinasa
K, la extraccin del ADN de las muestras de tejido
y plasma, se realiz mediante fenol-cloroformo y
precipitacin con etanol de acuerdo a lo descrito
por Sambrook. 10 El ADN obtenido se cuantific
mediante espectrofotometra.
Reaccin en cadenade
la polimerasa(PCR)
Amplificacin del gen de -globina: Para comprobar que
el ADN extrado del plasma era adecuado para utilizarse
en la PCR, todas las muestras se probaron para la am-
plificacin del gen de la -globina, que es un gen muy
Rev Inst Nal Cancerol (Mex)
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conservado. Se utilizaron los siguientes oligonucleti-
dos11: GH20: 5-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3 y
PC04: 5-CAACTTCATCCACGTTCACC-3
Estos oligonucletidos amplifican un fragmento de
268 pares de bases (pb) a una temperatura de 55o C.
Amplificacin de una regin del gen L1: El ADN
que se comprob adecuado para la reaccin de PCR
fue utilizado para amplificar secuencias del VPH. Con
este fin, se utilizaron los oligonucletidos generales
L1C1: 5-CGT AAA CGT TTT CCC TAT TTT TTT-3
y L1C2: 5-TAC CCT AAA TAC TCT GTA TTG-3, que
generan un fragmento de aproximadamente 240 pares
de bases de la regin L1 y detectan un gran nmero de
secuencias de VPHs.12 Para un volumen de 20 L por
reaccin, se aadieron 20 pmoles de cada uno de los
primers; 2 L de tampn 1X para PCR, 2 L de dNTPs
(dATP, dGTP, dCTP ydTTP) a 200 mM, cloruro de
magnesio a una concentracin final de 2 mM y 0.15 L
(0.75U) de la enzima Taq Gold Polimerasa (Perkin El-
mer). Las reacciones se sometieron a 40 ciclos de am-
plificacin en un termociclador (Modelo 480, Perkin-
Elmer). El programa consisti en: un ciclo de 12 minu-
tos a 94o C, 38 ciclos de 94o C por un minuto, 48o C por
un minuto y 72o C por un minuto; ms un ciclo final de
extensin a 72o C por 10 minutos.
Determinacin de VPH16 y VPH18: Con el fin de
determinar el tipo viral en las muestras de biopsias
positivas a VPH, se utilizaron oligonucletidos espe-
cficos para los tipos de VPH ms frecuentes en le-
siones invasoras del crvix: VPH16 y VPH18.13
Para VPH16, se utiliz un par de oligonucletidos
que amplifican un fragmento de 792 pb de la regin
E6-E7:14 16E6.1: 5-ATGCACCAAAAGAGAACTGC- 3
y 16E7.2: 5- GGATCAGCCATGGTAGATTA- 3
Para VPH18, se utilizaron oligonucletidos que
amplifican un fragmento de 220 pb de la regin larga
Figura 1.
Amplificacin mediante reaccin en
cadena de la polimerasa en plasma de
un fragmento de la regin L1 del virus
del papiloma humano, utilizando los
oligonucletidos L1C1 y L1C2 de
muestras de pacientes con cncer
cervicouterino. El fragmento esperado
es de 240 pares de bases. Como control
negativo se utiliz el ADN extrado de la
lnea celular C33 y como control positivo
el extrado de la lnea celular HeLa.
205
de control (LCR).15 18LCR.a 5 -GGGGATCCCGG-
TTGCATAAACTATGTAT- 3 y 18LCR.b 5 -GGA-
AGCTTTCGGTTGCCTTTGGCTTATG- 3
En las reacciones se utiliz como control positivo
ADN extrado de la lnea celular HeLa (que contiene
secuencias de HPV18 integradas); y como control ne-
gativo ADN de la lnea celular C33, originada de un
tumor epidermoide de crvix que no contiene secuen-
cias de VPH.
Los productos de la amplificacin por PCR de las
muestras se visualizaron en geles de agarosa al 1.5%
teidos con bromuro de etidio.
Se analiz la correlacin entre los resultados de
la amplificacin por PCR de las muestras de plasma
de las mujeres con y sin cncer mediante la prueba
exacta de Fisher. Se utiliz la misma prueba para
el anlisis de la correlacin entre los resultados de
la amplificacin por PCR en el plasma, el tipo de
VPH encontrado y las caractersticas clinicopatol-
gicas de las pacientes.
RESULTADOS
Se realiz la prueba de PCR para la deteccin de se-
cuencias del ADN del VPH del plasma de las 34 pa-
cientes cuyas biopsias del tumor primario estuvie-
ron asociados a VPH. El 70% (24 pacientes) resul-
taron positivas, lo cual representa un 70% de
sensibilidad de la prueba. La figura 1 muestra un
ejemplo de la amplificacin por PCR de la regin L1
de dichas muestras.
Se analizaron 24 muestras de plasma provenien-
tes de pacientes con infeccin cervical por VPH, pero
sin cncer. El ADN del VPH no se amplific en nin-
guna de las muestras de plasma de estas pacientes.
Para descartar que en los casos negativos la falta de
 Dueas A y cols. ADN del virus del papiloma humano como marcador de enfermedad residual mnima en cncer cervicouterino
206
amplificacin haya sido debido a mala calidad del
ADN u otros problemas tcnicos, a todas las mues-
tras se les amplific un fragmento del gen de la -glo-
bina (Figura 2).
Al comparar los resultados de la amplificacin en-
tre las mujeres con y sin cncer, se encontr una di-
ferencia altamente significativa (p < 0.0000001) ya
que en el 70% de las mujeres (24 de 34 pacientes) con
cncer se les detect el ADN, mientras que no se de-
tect en ninguna (0%) de las 24 sin cncer. Esto in-
dica que la sensibilidad de la prueba es del 70% y la
especificidad del 100%.
El anlisis de la correlacin entre el resultado
de la PCR con el estadio clnico de las enfermas no
mostr asociacin significativa. Se encontr posi-
tividad desde estadios clnicos IB1 hasta en esta-
dios IV; sin embargo, casi la mitad de los casos
fueron IIIB, por lo que estos resultados deben to-
marse con precaucin debido al pequeo nmero
de casos con estadios I. Al analizar los resultados
con relacin al tipo histolgico (cuadro I) se encon-
tr que los tumores adenoescamosos grado 2 (epi-
dermoides poco diferenciados productores de moco)
fueron ms frecuentemente negativos (p = 0.0001).
La relacin fue la siguiente: de 23 tumores de clu-
las escamosas, 20 resultaron positivos y tres nega-
tivos; y de nueve adenoescamosos, tres fueron po-
sitivos y seis negativos.
El anlisis del tipo de VPH en las biopsias L1
positivas, mostr que 17 de las 34 pacientes fueron
positivas a VPH16 (50%), mientras que ocho re-
sultaron positivas a VPH18 (20%), y nueve corres-
pondieron a otros tipos virales. Sin embargo, no
existe ninguna correlacin entre el tipo de VPH de
la muestra y la positividad o negatividad a VPH
en plasma.
Figura 2.
Amplificacin mediante reaccin en
cadena de la polimerasa de un
fragmento del gen -globina de muestras
de plasma de mujeres con infeccin
cervical por virus del papiloma humano,
pero sin cncer. El fragmento esperado
es de 268 pares de bases. La banda de
454 pares de bases corresponde al
fragmento de la regin L1 (primers
MY09/MY11), empleado como control
positivo de la reaccin en cadena de la
polimerasa en la lnea celular HeLa.
Como control negativo se utiliz el ADN
extrado de la lnea celular C33.
DISCUSIN
El carcinoma cervicouterino es una neoplasia alta-
mente prevalente en nuestro pas y la principal cau-
sa de muerte por cncer en mujeres mexicanas.1
Aunque se estn realizando esfuerzos importantes en
la prevencin del mismo, la esperada reduccin de
mortalidad no es un efecto inmediato, por lo que es
necesaria la investigacin dirigida a mejorar, de una
u otra manera, el pronstico de estas pacientes una
vez diagnosticada esta enfermedad.
El tratamiento convencional del cncer cervi-
couterino no se ha modificado sustancialmente en
las ltimas dcadas y consiste en ciruga y/o radio-
terapia. Ms recientemente, la quimioterapia se ha
estado evaluando en combinacin con alguna de las
modalidades locales.16 El tratamiento del cncer de
crvix es efectivo en etapas clnicas tempranas; sin
embargo, en las etapas clnicas a partir del estadio
IB2 los resultados del tratamiento no son muy sa-
tisfactorios con supervivencias a cinco aos que va-
ran entre el 15 y 85%.
Los marcadores tumorales, sobre todo cuando
son sensibles y especficos, son de gran utilidad
para el manejo de los pacientes con cncer. El ejem-
plo ms tpico de ello es el carcinoma germinal de
testculo en donde las decisiones del manejo estn
en gran parte determinadas por los niveles de mar-
cadores; adems, la determinacin de marcadores
es til para predecir de manera temprana las reca-
das. En el carcinoma cervical no existe un marca-
dor sensible y especfico que se utilice rutinaria-
mente en el manejo de las pacientes.
En este trabajo se demuestra que el ADN del
VPH se encuentra circulando en el plasma del 70%
de las pacientes cuyos tumores primarios son posi-
Rev Inst Nal Cancerol (Mex)
1999; 45 (4).
tivos al virus e, importantemente, est ausente en
las pacientes sin cncer pero con infeccin cervical
por VPH lo que sugiere que lo detectado en suero
no se debe a viremia o la liberacin de ADN por
las clulas no tumorales infectadas por el virus.
Lo anterior sugiere que, de manera similar a lo
que sucede con marcadores tales como K o N-ras
mutados, microsatlites o reordenamientos de in-
munoglobulinas, la deteccin de estas secuencias
en el plasma o suero de los pacientes es indicativo
de que la nica fuente posible de las mismas son
las clulas tumorales.4-9
Es notorio que no todas las mujeres con carci-
noma de crvix asociado a VPH mostraron ADN
del virus en circulacin. El hecho de que en esas
pacientes se haya podido amplificar -globina des-
carta degradacin del ADN u otros problemas tc-
nicos de la prueba. Es posible que existan diferen-
cias biolgicas entre un tumor con mayor o menor
capacidad de liberar ADN a la circulacin. De he-
cho, aunque est demostrado in vitro que las clu-
las pueden liberar ADN al medio de cultivo,17,18 no
se conocen los mecanismos responsables, ni si esto
tiene una funcin biolgica. Lo que s se conoce es
que el ADN circulante no es consecuencia de des-
truccin celular (necrosis o apoptosis) ya que en
este caso el ADN estara degradado y, por lo tan-
to, incapaz de ser amplificado. Un dato que apoya
lo anterior es que en pacientes con cncer que son
tratados, ya sea con quimioterapia o radioterapia,
la respuesta tumoral que obviamente se produce
por apoptosis o necrosis no se acompaa de aumen-
to inmediato del ADN circulante, sino de disminu-
cin.3 Otra posibilidad es que el estado de integra-
cin del genoma de VPH y/o el nmero de copias in-
fluyen en la capacidad de las clulas tumorales de
liberar este ADN.
Aunque en este trabajo no se encontr ninguna
asociacin entre el tipo viral contenido en la mues-
tra de biopsia y la deteccin de VPH en el plasma
de la misma paciente, no se descarta la posibilidad
de que este aspecto influya en la capacidad de libe-
racin de ADN de los tumores. Se ha propuesto
que existen diferencias en conductas biolgicas en-
tre variantes intratipo, 19 las cuales no se determi-
naron en este estudio.
Estos resultados preliminares podran ser de
gran inters ya que la determinacin mediante am-
plificacin por PCR del VPH en las pacientes con
cncer cervicouterino podra ser un marcador sen-
sible y altamente especfico. Hasta el momento, el
antgeno de clulas escamosas (SCC) ha sido eva-
luado extensamente no slo en cncer de crvix,
207
sino tambin en otras neoplasias escamosas; pero
su utilidad es muy limitada por su falta de especifi-
cidad ya que se ha encontrado elevado en varias
condiciones patolgicas no neoplsicas, como tuber-
culosis, sarcoidosis, quistes broncognicos, eccema,
pnfigo y psoriasis.20 Otros autores sealan que los
niveles del SCC muestran excelente correlacin con
el estadio clnico; sin embargo, es esta ltima varia-
ble la ms importante para determinar la respuesta
al tratamiento y el pronstico.21 Por otra parte, la
falta de especificidad y la necesidad de establecer
valores de corte para determinar su significado cl-
nico hacen poco til la aplicacin del SCC para eva-
luar la presencia de enfermedad residual mnima o
detectar recadas tempranamente.22
La determinacin mediante PCR del VPH en plas-
ma de las pacientes con cncer de crvix pudiera te-
ner implicaciones teraputicas en el sentido de que
su persistencia, pese a una respuesta clnica comple-
ta, podra ser un marcador de enfermedad residual o
molecular mnima ya que tericamente la fuente de
ese ADN necesariamente tendran que ser las clulas
tumorales. En esta situacin, el uso de terapias
adyuvantes o complementarias podra ser de mayor
utilidad por la seleccin de pacientes en riesgo de re-
currencia clnica. Por otra parte, como ha sido docu-
mentado con la deteccin de otras secuencias espec-
ficas de tumor en plasma o suero,4-9 una paciente
con PCR negativa para el VPH despus de trata-
miento que durante el seguimiento se transforme en
positiva podra ser un indicador de recada inminen-
te. De comprobarse esto, entonces se podr estar en
la situacin de investigar prospectivamente si el pro-
nstico de estas pacientes mejora al detectar y tratar
las lesiones de manera ms temprana. Finalmente,
se debe mencionar que el procedimiento es prctico y
muy simple, por lo que, de comprobarse su utilidad,
podra ser realizado rutinariamente en cualquier
hospital con un laboratorio que cuente con la capa-
cidad de efectuar la PCR.
En conclusin, nuestros resultados demuestran
por primera vez que mediante la PCR es factible de-
tectar la presencia de ADN del VPH en el plasma de
las pacientes con cncer de crvix; tambin indican
que esta prueba es altamente especfica y que podra
ser un marcador molecular de enfermedad residual
mnima y predictor de recadas.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido realizado con el apoyo del CONACYT a
los proyectos de investigacin I 29873-M y 28673-M otorgados
al Dr. Dueas y a la Dra. Lizano, respectivamente.
 Dueas A y cols. ADN del virus del papiloma humano como marcador de enfermedad residual mnima en cncer cervicouterino
208
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Direccin para correspondencia:
Dr. Alfonso Dueas Gonzlez
Instituto Nacional de Cancerologa
Divisin de Investigacin Bsica
San Fernando nm. 22
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