UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE MORELOS

Anteproyecto de tesis en Ciencias Bioqumicas

DISEO DE UNA XNAzima PARA CORREGIR LA DEFICIENCIA DE LA

ENZIMA GLUCOSA-6-FOSFATASA CAUSANTE DEL SINDROME DE
VON GIERKE.

CANDIDATURA A OBTENER EL TITULO DE LICENCIATURA

PRESENTA:

ALBA VERONICA DEMESA CASTAEDA

TUTORA PRINCIPAL: M.C. FRANCISCA VILLANUEVA FLORES

INSTITUTO DE BIOTEGNOLOGIA-UNAM

CUERNAVACA, MORELOS JUNIO 2016

Resumen
La enfermedad de Von Gierke es un trastorno por depsito de glucgeno
causado por la deficiencia en el cuerpo de la enzima Glucosa-6-Fosfatasa. La
enzima se encarga de hidrolizar la glucosa 6 fosfato dentro del citoplasma
celular durante la gluconeogenesis y la glucogenolisis, los efectos de esta
enfermedad estn dados por hipoglucemia severa, osteoporosis, gota y
tambin alteraciones en el crecimiento. La causa principal es debida a una
mutacin en el gen que codifica a esta enzima y que tiene un patrn de
herencia autosomica recesivo. En el presente anteproyecto se pretende
disear una enzima que tenga la misma actividad que la glucosa-6-fosfatasa
a partir de xna (cido xeno nucleico) el cual es un polmero sinttico que
puede llevar la misma informacin que el ADN pero hecho con diferentes
componentes moleculares, capacidad que hace que los XNA tengan
capacidad cataltica. El diseo que hemos ideado estar conformado por una
biblioteca de XNA, polimerasas dependientes de ADN de XNA, un biotinilado
quimrico de ADN cebador, perlas de estreptavidina que permitirn la
desnaturalizacin y eliminacin de las plantillas de ADN para que las
enzimas exitosas escindan y as poderles hacer las pruebas necesarias. En
un futuro cercano esta podr ser la alternativa para curar este tipo de
enfermedades causadas por la deficiencia de alguna enzima.
Introduccin

Se denomina enfermedad de Von Gierke a un error congnito del

metabolismo donde por falta de la enzima Glucosa-6-Fosfatasa el glucgeno
no puede ser descompuesto a glucosa. El glucgeno es una forma polimrica
de azcar que se almacena en hgado y msculos, su descomposicin a
glucosa produce energa y le es proporcionada al cuerpo cuando le es
requerida. Existen muchos tipos de glucogensis los cuales son causados
todos principalmente por la deficiencia de una enzima relacionada con la
degradacin del glucgeno entre ellas podemos mencionar a: la enfermedad
de Pompe donde la enzima deficiente es la alfa-1-glucosidasa, la enfermedad
de Hers donde la enzima que se carece es la fosforilasa heptica entre otras.
Esta enfermedad se clasifica en los dos primeros subtipos de glucogenosis la
1 y 1b ya que existen al menos 10 de estos adems es poco frecuente por
lo que se estima que la incidencia en nacimientos es de 1/100000 a
1/200000 a nivel mundial [9].

Algunos de los tratamientos actuales se basan en manejos nutricionales

asociados a varios frmacos convencionales como infusiones de glucosa por
sonda nasogstrica o por va parenteral y los pacientes que toleran va oral
reciben maicena no cocinada ya que acta como un carbohidrato de
liberacin lenta y permite prolongar el tiempo de euglicemia entre las
comidas. Este manejo permite a los pacientes alcanzar un crecimiento y
desarrollo puberal casi normal. Sin embargo la enfermedad no se corrige y
los pacientes continan presentando, hiperlipidemia, hipercalciuria,
hiperuricemia y academia lctica. La dieta no previene todas las
complicaciones a largo plazo [10]. Cabe resaltar que actualmente no existe
ningn tratamiento mdico que atienda de manera integral este tipo de
trastornos por lo que tratamos de generar una estrategia a travs de la
terapia enzimtica por medio de XNAzimas. La biologa sinttica es un
campo de la biologa que tiene como objetivo desarrollar polmeros genticos
artificiales (XNA) que pueden replicarse in vitro y eventualmente en los
organismos celulares modelo [3]. Con avances realmente sorprendentes la
biologa sinttica promete cambiar la forma de entender y tratar algunas
enfermedades ya que utiliza algunas partes biolgicas de diseo como un
punto de partida para una nueva clase de terapias adems de herramientas
de diagnostico que son ms eficaces [4] y tienen una vida til ms larga que
las herramientas normales, esta ciencia promete ser de gran ayuda dentro
de la medicina ya que gracias a ella se pueden modificar, variar o tambin
alterar las propiedades vitales por otras que anteriormente no existan [1].

Antecedentes

Descripcin del XNA

Los cidos xeno nucleicos XNAs son polmeros sintticos de estructura muy
similar al DNA y RNA con algunas diferencias en su estructura tales como el
poseer un azcar distinta a la ribosa o desoxiribosa, como manosa o
fluoroarabinosa, el tener esqueletos con pptidos unidos covalentemente al
azcar o utilizar bases no convencionales [2]. Estos XNA dada su naturaleza
polimrica y variable en secuencia son capaces de almacenar y transmitir
informacin gentica en la misma forma que sus anlogos naturales y de
igual forma se ha descubierto que tienen la capacidad de evolucionar si se
les coloca en un ambiente favorable [1][6]. Para su sntesis se utilizan tanto
nucletidos no convencionales que poseen las modificaciones qumicas
propias de cada XNA como polimerasas modificadas con la capacidad de unir
estos nucletidos siguiendo un templado, que puede ser DNA, RNA o XNA, y
un primer con una secuencia determinada o aleatoria [3].

El uso de XNAs como enzimas

Una capacidad resaltable de los XNA es que poseen una estructura

secundaria capaz de plegarse de manera similar a un RNA monocatenario
[2], este plegamiento depende de su secuencia y se ha encontrado que esta
forma de plegamiento es capaz de conferirle propiedades catalticas a los
XNA, generando XNAzimas de forma anloga a las ribozimas [4] constituidas
de RNA [7]. Esta capacidad se puede enriquecer gracias a las modificaciones
qumicas que los XNA poseen en su esqueleto [4][7]. Debido a este conjunto
de caracteres se ha planteado el uso de seleccin artificial para generar
sistemas evolutivos que nos permiten obtener XNAzimas con una actividad
cataltica particular [4] cuya potencial estiba en la creacin dirigida de
molculas capaces de realizar una funcin enzimtica en reacciones muy
especficas y cuya obtencin natural es compleja. Otra de las ventajas de las
XNAzimas es su gran estabilidad en sistemas biolgicos debido a que al no
ser polmeros naturales el sistema inmunolgico es incapaz de reconocerlos
y por tanto no se monta una respuesta inmune que lleve a su degradacin,
pudiendo permanecer ms tiempo en el organismo que una enzima biolgica
[3].

Enfermedad de Von Gierke

La glucogenosis por dficit de la glucosa-6-fosfatasa, es una enfermedad

metablica hereditaria que se caracteriza por una baja tolerancia al ayuno,
retraso del crecimiento y hepatomegalia por acumulacin del glucgeno y
grasa en el hgado afecta al 80% de los pacientes. La prevalencia es
desconocida. Pude manifestarse desde el nacimiento por hepatomegalia. Los
pacientes presentan: hgado agrandado, retraso del crecimiento, osteopenia
osteoporosis, cara redonda, nefromegalia y epixtasis debido a la disfuncin
plaquetaria. La transmisin es autosomica recesiva en los nios ms
pequeos la enfermedad tpicamente se presenta con crisis convulsivas y
hepatomegalia que se manifiestan a los 6 y 8 meses. Algunos pacientes
pueden requerir trasplante renal o trasplante heptico. El dao de la enzima
conllevar a un acumulo de G6P en el citoplasma activando vas metablicas
secundarias que la usan como sustrato. La G6Pasa se expresa
predominantemente en el hgado, los riones y en el intestino. Los genes
que codifican la G6Pasa y del G6PT se encuentran en los cromosomas 17q21
y 11q23. La incidencia ms alta se observa en los judos Ashkenazi con una
frecuencia de portador de 1:65 lo cual permite predecir una prevalencia
cinco veces mayor que en la poblacin caucsica en general. Sin embargo,
este tratamiento nutricional (ingesta de maicena) resulta muy dispendioso y
puede llegar a alterar de manera sustancial la calidad de vida de los
pacientes y sus acudientes, debido a que la maicena no procesada debe ser
administrada mltiples veces a lo largo del da. Teniendo en cuenta esto,
resulta necesario iniciar la investigacin de nuevas sustancias que permitan
disminuir el nmero de dosis necesarias a lo largo del da. Uno de los
tratamientos que ms se ha investigado es el tratamiento de remplazo
enzimtico en el cual se inyecta una versin de la enzima con la actividad
correcta en la vena porta del hgado. Sin embargo uno de los problemas que
se tiene con este enfoque es la rpida degradacin de la enzima y el rechazo
por el sistema inmunolgico [9][11].

Hiptesis

La sntesis de XNA utilizando una polimerasa de baja afinidad para su

replicacin as como la seleccin positiva de aquellas secuencias que
muestren capacidad cataltica para la hidrlisis de glucosa-6-fosfato
generara, mediante evolucin dirigida, una XNAzima capaz de llevar a cabo
la reaccin caracterstica de la glucosa-6-fosfatasa siendo posible su
utilizacin en el tratamiento de la enfermedad de Von Gierke.

Objetivo general

Sintetizar una XNAzima, utilizando faNTPs y evolucin dirigida, que sea

capaz de hidrolizar la glucosa-6-fosfato para sustituir la actividad deficiente
de la enzima glucosa-6-fosfatasa en la enfermedad de Von Gierke y evaluar
su actividad en ensayos in vitro e in vivo.
Objetivos particulares

1. Sintetizar polmeros sintticos de XNA utilizando faNTPs

2. Utilizar una polimerasa de baja afinidad y seleccin artificial de los

polmeros para generar un sistema capaz de evolucionar.

3. Obtener una XNAzima capaz de hidrolizar la glucosa-6-fosfato

4. Evaluar in vitro la capacidad cataltica de la XNAzima

5. Realizar ensayos in vivo de la XNAzima utilizando ratones con un knockout

en el gen de la enzima glucosa-6-fosfatasa para evaluar su posible utilizacin
en el tratamiento de la enfermedad de Von Gierke.

Metodologa

Nucletidos y oligonucletidos.

Se adquirirn nucletidos FANA (faNTPs) de Metkinen Chemistry, as como

dNTPs y se mandarn sintetizar oligonucletidos de DNA con secuencia
aleatoria para la primera ronda de sntesis de XNA.

Sntesis de oligonucletidos biotinados

Se sintetizar un oligo especial biotinado en el extremo 5 que tendr una

glucosa en sustitucin de un nucletido interno de la secuencia con un
enlace 6fosfato como se describe en [1] para evaluar si la XNAzima es capaz
de realizar un corte en este sitio. De igual forma se sintetizar un oligo
biotinado en 5 de 2O-Metil RNA para realizar la retrotranscripcin.

Sntesis de XNA y seleccin de XNAzimas

Utilizando como cebador un oligonucletido biotinado con una glucosa
interna en la secuencia se sintetizar un XNA usando la polimerasa D4K de
baja fidelidad y los nucletidos faNTPs como se describi en trabajos
anteriores [1] [5], posterior a esta sntesis se seleccionar positivamente los
oligos biotinados por medio de perlas de estreptavidina y se realizar una
electroforesis en gel que nos indicar si el XNA realiz un corte en el oligo de
DNA con la glucosa. De ser positivo este corte se visualizar como 2 bandas
de tamao predicho [4] en el gel de agarosa, se seleccionar la banda que
contenga el XNA y se realizar una retro transcripcin con la enzima RT521
de alta fidelidad que sintetizar una cadena de DNA complementaria a
nuestro XNA seleccionado utilizando como cebador un oligo biotinado de
2O-Metil RNA el cual se seleccionar por perlas de estreptavidina;
posteriormente una alcuota de este cDNA policlonal se mandar a
secuenciar y el resto se utilizar para sintetizar nuevos oligonucletidos que
funcionarn como templado para una nueva ronda de sntesis de XNA con el
fin de mejorar la capacidad de corte del XNA [4][6].

Deep sequencing

Se llevar a cabo una secuenciacin de las XNAzimas seleccionadas por

medio del mtodo descrito anteriormente [4]. Esto nos indicar la secuencia
mayormente representada del cDNA policlonal complementaria a la
secuencia de la XNAzima de nuestro inters.

Reacciones de XNAzimas

Para comprobar la eficacia de las XNAzimas seleccionadas se realizar un

ensayo de actividad enzimtica por colorimetra utilizando el reactivo
molibdato y cuantificacin por espectrofotometra. Incubndose la XNAzima
con distintas concentraciones de G6P y obteniendo la grafica
correspondiente de acuerdo a la ecuacin de Michaelis-Menten
 [S ]
V 0=V max
K m +[S ]

V0 V max
Donde es la velocidad de formacin del producto, es la

Km
velocidad mxima de catlisis, es la constante de Michaelis propia de

cada enzima y [S ] la concentracin de sustrato.

Una vez obtenidos estos datos se elegirn las enzimas con las constantes de
mayor afinidad y se proceder a la realizacin del ensayo in vivo en ratones
knockdown para la glucosa 6 fosfatasa. Para esto se inyectar XNAzima en la
vena porta heptica (la concentracin se evaluar de acuerdo a las
constantes) y posteriormente se cuantificar la glucosa en sangre de los
ratones, as como la cantidad de glucgeno en hgado. Se utilizarn ratones
knockdown sin tratar y ratones de tipo salvaje como controles.

Presupuesto del proyecto:

-D4k XNApolimerasa $97.00 USD

-521 XNAretropolimerasa $102.00 USD

-6 Ratones Knockout G6pc2 $7200 USD

-Oligo de DNA $31.5 USD

-Oligo de DNA+glucosa biotinado $85.50 USD

-Oligo de RNA biotinado $45.50 USD

-FANA-A $203.00 USD

-FANA-G $223.00 USD

-FANA-C $95.00 USD

-FANA-U $54.00 USD

-Agarosa D1 $236.25 USD

-TAE 40X $191.27 USD

-10pb DNA Ladder $228.69 USD

-KIT phosphorus $107.37 USD

-Secuenciacion (por muestra) $15.00 USD (15)

Total: $9,127.00 USD

Referencias

1. Pinheiro, Vitor B. et al. Synthetic Genetic Polymers Capable of Heredity

and Evolution. Science (New York, N.Y.) 336.6079 (2012): 341344. PMC.
Web. 27 June 2016.
2. Anosova, Irina et al. The Structural Diversity of Artificial Genetic
Polymers. Nucleic Acids Research 44.3 (2016): 10071021. PMC. Web. 27
June 2016.

3. Pinheiro V.B., Holliger P. The XNA world: progress towards replication and
evolution of synthetic genetic polymers. Curr. Opin. Chem. Biol.
2012;16:245252

4. Taylor, Alexander I. et al. Catalysts from Synthetic Genetic Polymers.

Nature 518.7539 (2015): 427430. PMC. Web. 27 June 2016.

5. Wilds, Christopher J., and Masad J. Damha. 2-Deoxy-2-Fluoro--D-

Arabinonucleosides and Oligonucleotides (2F-ANA): Synthesis and
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6. Joyce GF. Directed evolution of nucleic acid enzymes. Annu. Rev.

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7. Lilley, David M. J. Mechanisms of RNA Catalysis. Philosophical

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8. Neigishi, H.; Benke, P. J. Epithelial cells and Von Gierke's disease. Pediatr.
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9. Weinstein D, Wolfsdorf J. Glycogen storage diseases: A primer for

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10. Heller S, Worona L, Consuelo A. Nutritional therapy for glycogen storage.

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