Biocaracterizacin

SECUENCIACIN DE ADN

Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polmero de nucletidos, es decir, un polinucletido.

Un polmero es un compuesto formado por muchas unidades simples conectadas entre s, como si
fuera un largo tren formado por vagones. En el ADN, cada vagn es un nucletido, y cada nucletido,
a su vez, est formado por un azcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser
adeninaA, timinaT, citosinaC o guaninaG) y un grupo fosfato que acta como enganche de
cada vagn con el siguiente. Lo que distingue a un vagn (nucletido) de otro es, entonces, la base
nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando solo la secuencia de sus bases.
La disposicin secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento de los
cuatro tipos de vagones a lo largo de todo el tren) es la que codifica la informacin gentica: por
ejemplo, una secuencia de ADN puede ser ATGCTAGATCGC...

El anlisis ms detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucletidos.

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN se necesitan los siguientes
compuestos:

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Adems, debe estar en estado
de hlice sencilla.
Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4, ya
que va aadiendo nucletidos a partir de un cebador o "primer".
Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucletido corto de alrededor de 20 bases de
longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a aadir nucletidos.
Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), son los nucletidos
precursores utili para incorporar la base nitrogenada adenina al DNA durante el proceso de
replicacin de
Por ltimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los
nucletidos didesoxi son nucletidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la
posicin 3' de la desoxirribosa. Por tanto, una vez incorporado un nucletido didesoxi se
termina la sntesis de la cadena de ADN.

Preparacin de la muestra

En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reaccin. Cada
mezcla de reaccin contiene los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN
polimerasa I, un cebador marcado con un fluorocromo y un nucletido didesoxi, por ejemplo
ddATP, a una concentracin baja. El nucletido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo)
competir con su homlogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se est sintetizando,
produciendo la terminacin de la sntesis en el momento y lugar donde se incorpora.

Breve descripcin del mtodo automtico de secuenciacin

En el mtodo automtico se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reaccin,

cada una con nucletido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema
permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva
sntesis producto de las cuatro mezclas de reaccin.

La deteccin del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reaccin se lleva a cabo al mismo
tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamao que ya han
sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el nmero de
nucletidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada
secuenciacin.

El siguiente esquema representa de forma abreviada el mtodo automtico de secuenciacin.

Equipos secuenciadores
Dispone de un equipo ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer de 16 capilares de 80cm de longitud,
capaz de obtener secuencias de hasta 1000 bases. En 24 horas pueden ser procesadas hasta
un mximo de 150 muestras.

Geometra del equipo

El Analizador Gentico AB 3130 consta de:

Unidad de Electroforesis Capilar con placa de calentamiento capaz de controlar la temperatura

desde 18C hasta 65C.
Fuente de alimentacin que controla la tensin hasta 20.000 voltios.
Un detector simultneo de distintas emisiones de fluorescencia con capacidad de deteccin de
hasta 5 fluorocromos.
Unidad ptica compuesta por un laser de argn inico con potencia de 10mV y con lneas
espectrales de 488 nm y 514,5 nm.
 Unidad de deteccin compuesta por cmara CCD que recoge en multi-frecuencia todas las
emisiones de fluorescencia de 514 a 680 nm
Sistema de excitacin de doble haz ptico, que compensa la diferencia de energa a lo largo de
los 4 capilares y proporciona as una mayor sensibilidad en la deteccin de las distintas
emisiones de fluorescencia en todas y cada una de las muestras.
Un Soporte electrofortico de 4 capilares de 50 micras, disponible en 22 cm., 36 cm., 50 cm., y
80 cm. que se rellenan de forma automtica.
Cargador automtico de muestras compuesto por una bandeja de 96 384 pocillos y un sistema
automtico de inyeccin electrocintica de los fragmentos de ADN.
Un sistema de control de temperatura de los capilares que asegura la mxima reproducibilidad.
Ordenador PC con procesador Pentium 4, 2GHz., sistema operativo Windows XP, 1GB de RAM,
dos discos duros de 36 GB, Monitor color de 17 pulgadas, unidad lectora CD-ROM (40x), unidad
grabadora de CDs, tarjeta Ethernet e impresora color

Manejo de datos

El AB 3130 Genetic Analyzer incluye el control del sistema y el anlisis de los datos que se realiza
mediante los programas cargados en una WorkStation en Windows XP lo que permite que el
equipo funcione sin intervencin del usuario de forma automtica y continuada durante las 24
horas alcanzando una capacidad de procesamiento de muestras mayor de 144 secuencias 144
anlisis de fragmentos diarios.

Bases de datos

* Programa SeqScape v2.5: permite el uso de herramientas de comparacin de secuencias e

identificacin y descubrimiento de SNPs.

* SeqScape: contiene funciones de llamadas da base de datos, ensamblando las secuencias y

realizando el alineamiento de las mismas.

* Programa de Anlisis de Fragmentos. Dispone de dos estrategias de marcaje fluorescente de

fragmentos de ADN:

Marcaje fluorescente del cebador con cuatro posibles fluorocromos diferentes y marcaje
fluorescente de los nucletidos.

Consumibles

Calibracin espectral/Generacin de la matriz

Antes de realizar un anlisis del tamao de los fragmentos de ADN es necesario realizar una
calibracin espectral con las cinco etiquetas fluorescentes 6-FAM, BTG, BTY, BTR y BTO para cada
analizador. La calibracin crea una matriz que se utiliza para corregir la superposicin de los
espectros de emisin de fluorescencia de los colorantes.

La calibracin espectral incluye los pasos siguientes:

1. Preparacin de los estndares de la calibracin espectral

2. Carga de los estndares en la placa de reaccin de 96 pocillos (una muestra por capilar)
3. Creacin del protocolo del instrumento para la calibracin espectral (Protocol Manager
[Administrador de protocolos])
4. Definicin de la composicin de la placa en el editor de placas (Plate Manager
[Administrador de placas])
5. Realizacin de un ciclo de calibracin espectral y comprobacin de la matriz

Costos

Ubicacin

Personal encargado

Ejemplo

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el mtodo automtico
de secuenciacin. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el
nucletido existente en esa posicin de la secuencia.

PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica de laboratorio comn utilizada para
hacer muchas copias de una regin particular de ADN. Esta regin de ADN puede ser cualquier cosa
que le interese al experimentador. Por ejemplo, podra ser un gen cuya funcin quiere entender un
investigador o un marcador gentico usado por cientficos forenses para relacionar el ADN de la
escena del crimen con los sospechosos.

Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la regin blanco para que pueda
analizarse o usarse de alguna otra manera.

La Taq polimerasa
 La PCR requiere de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el
uso de las cadenas existentes como molde. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR
se llama Taq polimerasa. Es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad trmica.

Cebadores para PCR

Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si hay un cebador, una
corta secuencia de nucletidos que proporciona un punto de partida para la sntesis de ADN. En una
reaccin de PCR, la regin de ADN que ser copiada, o amplificada, se determina por los cebadores
que el o la investigadora elija.

Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla. En cada reaccin de PCR se
utilizan dos cebadores que estn diseados para flanquear la regin blanco (la regin que debe ser
copiada). Es decir, les agregan secuencias que harn que se unan a cadenas opuestas del molde de
ADN solo en los extremos de la regin a copiar.

Cuando los cebadores se unen al molde, la polimerasa los extiende y la regin que se encuentra
entre ellos se copia.

Los pasos de la PCR

Los ingredientes clave para una reaccin de PCR son Taq polimerasa, cebadores, ADN molde y
nucletidos (los bloques bsicos del ADN). Los ingredientes se colocan en un tubo, junto con los
cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento
que permiten la sntesis del ADN.

Los pasos bsicos son:

Desnaturalizacin (96C): la reaccin se calienta bastante
para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto
proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente
paso.

Templado (55 - 65C): la reaccin se enfra para que los

cebadores puedan unirse a sus secuencias complementarias
en el molde de ADN de cadena sencilla.

Extensin (72C): la temperatura de la reaccin se eleva para

que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice as
nuevas cadenas de ADN.

Este ciclo se repite 25 35 veces en una reaccin de PCR

tpica, que generalmente tarda 2 4 horas, segn la
longitud de la regin de ADN que se copia.

El nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de
sntesis de ADN. Hay muchas copias de los cebadores y muchas molculas de Taq polimerasa
flotando en la reaccin, por lo que el nmero de molculas de ADN casi puede duplicarse en cada
ciclo. La siguiente imagen muestra este patrn de crecimiento exponencial.

Manejo de datos

Habitualmente, los resultados de una reaccin de PCR se visualizan (se hacen visibles) al usar
electroforesis en gel.

(Ejemplo en la imagen: Examinar un marcador gentico

determinado y ver si alguno de los tres sospechosos
coincide con el ADN del cabello para este marcador. El
sospechoso cuyo ADN coincide con el de la escena del
crimen para este marcador es el #3).

Aplicaciones

La PCR se utiliza para amplificar genes asociados con

trastornos genticos a partir del ADN de los pacientes (o de ADN fetal, en el caso de pruebas
prenatales). La PCR tambin puede utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el
cuerpo de un paciente: si el patgeno est presente, es posible amplificar regiones de su ADN de
una muestra de sangre o tejido.

PCR en tiempo real

En comparacin con las tcnicas convencionales de amplificacin es la posibilidad de realizar una

amplificacin semi-automatizada. Esto significa que se puede evitar pasos adicionales necesarios
para visualizar el producto de amplificacin y se reduce el riesgo de contaminacin por manipulacin
posterior a la PCR.

Equipo

El Sistema LightCycler es un termociclador veloz que realiza amplificacin y deteccin en forma

simultnea, combinado con un micro-fluormetro que utiliza un sistema ptico de alta calidad
Rodenstock. Los procesos de calentamiento y enfriamiento del aire son controlados alternando el
calor y el aire del ambiente como medio de transferencia de temperatura. Gracias a la baja masa
del aire es posible obtener muy rpidas transiciones de temperatura dentro de la cmara trmica.
La utilizacin de tubo capilar permite alcanzar las temperaturas rpidamente en el interior del tubo
de reaccin.

La unidad ptica del Sistema LightCycler contiene seis canales de deteccin: 530 nm (SYBR Green I
y Fluoresceina), 560 nm ((LC Red 640), 610 nm (LC Red 640), 640nm (LC Red 640), 670 nm (LC Red
705). y 710 nm (LC Red 705).

Calibracin

No necesita calibraciones ni validaciones en ningn momento de la operacin. Para otros equipos

se ocupan kits de soluciones de calibracin.

Servicio de Atencin Profesional (Call Center (0-810-810-5650) y Servicio Tcnico propio y

especializado entrenados en casa matriz.

Disponibilidad de un instrumento LightCycler de back-up (en las instalaciones de Productos Roche),

para ser utilizado en caso que la reparacin del instrumento de la institucin/usuario requiera del
retiro de su propio instrumento.

Consumibles

Pipetas, puntas, tubos.

Material para electroforsis

Encargados

Ventajas

Visualizacin del proceso de amplificacin cuando ste se va produciendo: la medicin de

la fluorescencia on-line a tiempo real permite ver los resultados de cada ciclo de PCR.
Disminucin del tiempo de procesamiento de la reaccin de PCR: 30-40 ciclos de reaccin
de la PCR se realizan en 20-30 minutos.
Verificacin de la especificidad de los amplicones y deteccin de mutaciones.
Reproducibilidad, Sensibilidad y Especificidad.
Disminucin de la contaminacin: los procesos de amplificacin y deteccin se realizan
simultneamente y en el mismo tubo capilar.
Limitaciones

La muestra clnica no es adecuada para este anlisis

El ADN no es adecuado para PCR (debido a la presencia de inhibidores de PCR o por el uso
de un mtodo de extraccin no apropiado),
El kit no se ha almacenado correctamente.

MARCADORES GENTCOS

Un marcador gentico es un segmento de ADN con una ubicacin fsica conocida en un cromosoma.
Los marcadores genticos pueden ayudar a vincular una enfermedad hereditaria con el gen
responsable. Los segmentos de ADN que se encuentran cerca en un cromosoma tienden a heredarse
juntos. Los marcadores genticos se utilizan para rastrear la herencia de un gen cercano que an no
ha sido identificado, pero cuya localizacin aproximada es conocida. El marcador gentico en s
puede ser parte de un gen o puede no tener ninguna funcin conocida.

Un marcador ideal debe ser:

altamente polimrfico o variable dentro y entre especies,

de herencia mendeliana no episttica (sin interaccin entre genes),
insensible a los efectos ambientales,
de rpida identificacin y simple anlisis
de posible deteccin en los estadios tempranos del desarrollo.

Tipos de marcadores genticos

En los anlisis genmicos, se han utilizado varios tipos de marcadores: morfolgicos, isoenzimas,
protenas y marcadores basados en ADN.

1. Marcadores morfolgicos

Son caractersticas fenotpicas de fcil identificacin visual tales como forma, color, tamao o altura.
Muchos de ellos se convierten en importantes descriptores, a la hora de inscribir nuevas
variedades.

Como se describi anteriormente, los marcadores morfolgicos presentan algunas limitaciones, no

obstante permanecen como caracteres tiles en la identificacin de materiales dado que
representan un conjunto de caracteres que pueden ser evaluados con mtodos sencillos y a bajo
costo.

2. Isoenzimas

Se definen como diferentes formas moleculares de un tipo de enzima, que poseen una actividad
cataltica comn, es decir actan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en la secuencia de ADN
(mutaciones) que codifica para estas enzimas pueden resultar en cambios en la composicin de
aminocidos. Si estos cambios se producen, las protenas podran tener la misma actividad biolgica,
pero como su composicin de aminocidos vara, podran tener diferente carga neta y por tanto
diferentes velocidades de migracin en un campo elctrico. Estas diferencias determinan patrones
caractersticos de migracin electrofortica de las formas iso-enzimticas. Las enzimas que se
utilizan en estos estudios se clasifican de acuerdo a su funcin y se representan con una sigla de tres
letras. Por ejemplo:
 deshidrogenasas (alcohol deshidrogenasa ADH, glutamato deshidrogenasa
GDH),
oxidasas (peroxidasas PRX),
hidrolasas (fosfatasas cidas ACP, esterasas EST),
isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI)
transferasas (fosfoglucomutasas PGM).

Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar
variabilidad y estructura gentica, sistemtica y biologa evolutiva as como en identificacin de
variedades.

3. Protenas de reserva

El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que representa

aproximadamente el 80-90% de su peso seco. Almidn y protenas son las dos macromolculas ms
importantes.

El uso de protenas de almacenamiento en estudios de diversidad gentica sistemtica, se basa en

el hecho que las protenas de diferentes individuos, poblaciones y especies son homlogas, y que al
separarse en un gel producirn bandas similares o diferentes. Debido a que las protenas de reserva
carecen de actividad enzimtica, ellas son detectadas en el gel por medio de tcnicas generales de
teido.

4. ADN y marcadores moleculares

Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no

corresponder a un gen.

Existen diversas tcnicas de biologa molecular disponibles para detectar variabilidad en la

secuencia de ADN. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), las enzimas de restriccin, la
separacin electrofortica de los fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las hibridizaciones son
algunas de las tcnicas que permiten obtener un nmero virtualmente ilimitado de marcadores
moleculares. y cubrir la totalidad del genoma de un organismo.

Los marcadores moleculares pueden ser clasificados en tres grupos:

Aplicaciones
Ejemplo

Estimacin del flujo gnico

El flujo gnico entre poblaciones vegetales ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas.
La morfologa de semilla y polen, los mecanismos de dispersin, el tipo de polinizacin, etc., hacen
que la contribucin de estas dos vas al flujo total vare de acuerdo a la especie. Los marcadores
moleculares permiten cuantificar cada uno de estos procesos.

CUANTIFICACIN

Luego de la extraccin del ADN, son necesarias la cuantificacin y el anlisis de la calidad de las
molculas obtenidas.

Uno de los mtodos ms utilizados para la cuantificacin del ADN es el anlisis de la absorcin UV,
ya que los nucletidos poseen mximos de absorcin alrededor de 260 nm (por ejemplo, dATP: 259
nm; dCTP: 272 nm; dTTP: 247 nm). Este mtodo proporciona una estimacin simple y precisa de la
concentracin de una muestra, pero slo si sta se encuentra pura, sin contaminacin significativa
de protenas o solventes orgnicos que absorben a longitudes de onda cercanas. Para evaluar la
pureza de la muestra debe determinarse la proporcin OD 260nm/OD 280nm. Si la relacin es
mayor a 1,6 puede estimarse que la muestra es lo bastante pura para confiar en la cuantificacin
espectrofotomtrica.

Cuantificacin de cidos nucleicos en solucin

1) Tomar 2 l de la muestra de cidos nucleicos y agregar 98 l de agua desionizada. Mezclar y

transferir a una cubeta.

2) Medir en el espectrofotmetro la densidad ptica (OD) a 260 nm.

3) Para analizar la pureza de la muestra, tomar una segunda lectura a 280 nm. Determinar la relacin
de OD a 260nm / OD a 280 nm. Si sta es aproximadamente 2 (de 1,6 a 2) la absorcin es
mayoritariamente debida a cidos nucleicos. Si es menor a 1,6, hay protenas u otras molculas que
absorben a la misma longitud de onda en la muestra y es recomendable una re-extraccin con
fenol/cloroformo y precipitacin con etanol o isopropanol.
Cada tipo de cuantificacin posee un protocolo en particular para la preparacin de la muestra.
Para la determinacin de la cantidad de protena existen varios mtodos para su identificacin:

FOTODOCUMENTACIN

El sistema proporciona imgenes digitales de alta

resolucin para la documentacin de geles. El sistema
es fcil de usar y permite capturar imgenes en tiempo
real y verlas directamente en un PC.

Estas opciones flexibles de iluminacin hacen que sea

adecuado para generar imgenes de una amplia
variedad de muestras fluorescentes, adems es posible
producir imgenes de geles de electroforesis teidos

El sistema Gel Doc XR + se basa en la tecnologa de

deteccin CCD de alta resolucin y alta sensibilidad y
en opciones modulares para acomodar una amplia gama de muestras y soportar mltiples mtodos
de deteccin incluyendo fluorescencia y deteccin colorimtrica. El sistema Gel Doc XR + es
controlado por el software Image Lab para optimizar el rendimiento de la imagen para una
captura de imagen rpida, integrada y automatizada y el anlisis de varias muestras.

El sistema aloja una amplia gama de muestras, desde grandes geles de poliacrilamida a mano, hasta
pequeos geles ReadyAgarose y varios blots. El sistema es un acompaamiento ideal para PCR,
purificacin y sistemas de electroforesis, permitiendo anlisis de imgenes y documentacin de
digestiones de restriccin, cidos nucleicos amplificados, huellas genticas, RFLPs y purificacin y
caracterizacin de protenas.
Caractersticas y beneficios del sistema Gel Doc XR +

Las imgenes y anlisis de gel y blot son rpidos y precisos

Rutinas automatizadas, manos libres; No se requiere entrenamiento
Guardar y recuperar todos los pasos del flujo de trabajo para obtener resultados
repetibles y reproducibles
Optimice el sistema en la configuracin para obtener datos de imagen siempre
precisos, reproducibles y libres de artefactos de imagen
Amplia gama de aplicaciones con accesorios especiales para preservar la
integridad de la muestra para la investigacin posterior, garantizando al mismo
tiempo la seguridad del usuario
Anlisis cuantitativo exhaustivo y automatizado de muestras de protenas y
ADN en segundos
Personalizar y organizar los datos en los informes

Calibracin

El sistema optimiza la reproducibilidad y fiabilidad de los datos experimentales, permitiendo

comparaciones cuantitativas entre diferentes experimentos. Usando algoritmos propietarios, este
sistema de imagen se calibra en la instalacin para asegurar:

Las imgenes estn enfocadas en todo momento, independientemente del

nivel de zoom o de la posicin de la muestra
La correccin de alineacin plana apropiada se aplica de forma automtica y
consistente a los datos de imagen para cada aplicacin
Los artefactos de imagen se corrigen automticamente

El Gel Doc XR + System permite una visualizacin rpida y sencilla, documentacin y anlisis de geles
de cidos nucleicos y protenas, blots y macroarrays con unos pocos clics del ratn. El sistema
soporta fluorescencia y mtodos de deteccin colorimtricos.

Componentes:

El sistema Gel Doc XR + consta de un cap de cmara oscura, cmara CCD y lente motorizada
controlada por software, iluminadores de luz UV y blanco, filtro deslizante con filtro estndar y
escudo de proteccin UV.

El sistema le permite:

Aumentar la eficacia de la clonacin y la produccin de protenas mediante la proteccin de las

muestras de electroforesis de ADN de la exposicin a los rayos UV utilizando la pantalla de
conversin XcitaBlue y las manchas excitables con luz azul como GelGreen, SYBR Safe y SYBR
Green I

Mantener los procedimientos operativos estndar o los criterios para el rendimiento de la muestra
ya que no hay prdida de sensibilidad en comparacin con la tincin con UV y el bromuro de etidio

Aplicaciones:

Fluorescencia
Colorimetra/densitometra
 Documentacin de geles

Visualizacin del gel

1. Prender la computadora conectada al fotodocumentador.

2. Inicializar el programa para la visualizacin de geles de agarosa.
3. Abrir la puerta del fotodocumentador.
4. Con la ayuda de una esptula de plstico se coloca el gel en el fotodocumentador.
5. Cerrar la puerta.
6. Prender la luz ultravioleta del fotodocumentador.
7. Visualizar la imagen en la pantalla de la computadora.
8. Enfocar, etiquetar los carriles con respecto a la muestra de DNA, los valores de las bandas
del marcador molecular.
9. Tomar foto y guardarla en una memoria externa.
10. Apagar la luz ultravioleta y abrir la puerta para poder sacar el gel.
11. Desechar el gel en un contenedor para residuos con bromuro de etidio

Tamao mximo de la muestra: 28x26 cm

Iluminacin: trans-UV, trans white, epi-white

Costo

Tcnico encargado