Determinación de VITAMINA en Harina de Trigo Por HPLC

CAPITULO I
MARCO TEORICO
1.1 BASES DE LA CROMATOGRAFIA LIQUIDA
Desde comienzos de los aos 70 la Cromatografa Lquida ha tenido una

creciente difusin siendo ahora de especial importancia entre los mtodos
analticos modernos.
En un principio HPLC significaba HIGH PRESSURE LIQUID

CHROMATOGRAPHY (Cromatografa Liquida de Alta Presin), siglas que
debieron ser cambiadas cuando los cromatografistas se dieron cuenta de que la
PRESION slo constitua una herramienta que forzaba a la fase mvil a
atravesar la columna, sin constituirse por s en una variable del sistema.
Hoy, en el mundo especializado, se entiende por HPLC ms bien como HIGH

PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (Cromatografa Lquida de Alta
Eficiencia o de Alta Resolucin).
1.1.1 DEFINICION DE CROMATOGRAFIA
La Cromatografa Lquida es un mtodo de anlisis qumico para la separacin

de los componentes de una mezcla, los cuales se reparten en dos fases: una fase
estacionaria que tiene una gran rea de superficie y una fase lquida mvil que
fluye sobre la fase estacionaria. La fase estacionaria puede, entonces, ser un
slido activo o un lquido inmvil. Dependiendo de la seleccin de la fase mvil,
del tipo de partcula usado para la fase estacionaria y de las condiciones de
operacin, los componentes disueltos en la fase mvil viajarn a diferentes
velocidades, ocasionando una separacin.
1
1.1.2 APLICACIONES
Para conseguir anlisis qumicos que puedan dar excelente confiabilidad y que
puedan ser duplicados se utiliza el HPLC. Siendo adems una tcnica que
permite separar, aislar y cuantificar los componentes de una mezcla de
compuestos qumicos, sus aplicaciones pueden ser en:
Antibiticos
Analgsicos
Vitaminas
Antihistamnicos
Hormonas
Antibacterianos
Cationes
Aniones
Azcares
Metales
Protenas
Otros
1.1.3 SISTEMA TIPICO DE UN CROMATOGRAFO LIQUIDO
Si observamos un cromatgrafo lquido (Fig. 1), veremos que est formado por
varios mdulos y accesorios, entre los cuales se tiene:
Reservorios de solventes (Fase mvil)

Tuberas, por donde fluye la muestra a travs del sistema
Bomba distribuidora de solventes, la cual trabaja a altas presiones
Sistema de inyeccin (Inyector, que permite introducir la muestra a la columna)
Columna (horno o termostato de la columna)
Detectores
Registrador (Integrador procesador de datos)
2
FIG. 1 SISTEMA TPICO DE UN CROMATGRAFO LQUIDO
3
1.1.4 GENERALIDADES DEL SISTEMA DE OPERACION
Mediante la bomba que opera como el corazn del equipo, los solventes se
distribuyen por las tuberas. Succiona el solvente que proviene de los
reservorios y los lleva a travs de un sistema de flujo constante. Es necesario
aplicar presin con bombas porque el material de relleno de las columnas, est
formado por partculas muy pequeas, que ofrecen resistencia al flujo de los
solventes o de la fase mvil.
Se consideran bsicamente dos tipos de bombas:
1. Bombas Mecnicas:
Bombas Reciprocantes (pistn o diafragma), son las ms usadas
Bombas de desplazamiento continuo
2. Bombas Neumticas
Cuando la muestra es inyectada es forzada o llevada a travs de la columna y se

separa en bandas, las cuales eluirn de la misma hacia el detector y de all la
seal elctrica ser enviada hacia el registrador del sistema, aqu la seal se va
a transformar en medidas que puedan relacionarse con la cantidad de muestra
(rea). Por lo tanto, la muestra ha sido distribuida entre dos fases, una
estacionaria y la otra mvil, de tal forma que cada uno de los componentes de la
muestra son selectivamente retenidos (tiempo de retencin) por la fase
estacionaria.
Los detectores pueden clasificarse en generales y selectivos. Los detectores

generales miden el cambio de alguna propiedad fsica de la fase mvil que
contiene el analito en comparacin con la misma fase mvil pura. Ejemplos tpicos
son el Indice de Refraccin y el de Conductividad. Los detectores selectivos son
aquellos sensibles a alguna propiedad propia del soluto, por ejemplo el detector
UV, que producir una seal proporcional a la absorbancia del soluto a una
longitud de onda dada. Otro ejemplo es el detector de Fluorescencia, empleado
para la deteccin de solutos con fluorescencia natural o conferida por reaccin
4
con un reactivo fluorognico. Otro detector selectivo es el Electroqumico,
empleado para la deteccin de analitos que pueden oxidarse o reducirse ante la
aplicacin de un potencial.
La separacin de los componentes de la muestra se va a llevar a efecto en la

columna rellena de pequeas partculas que son empacadas por compresin para
formar el lecho cromatogrfico. La separacin de la muestra es el resultado de la
adhesin o difusin de los diferentes componentes en las partculas del empaque
(separacin por tamao o por afinidad, Fig. 2).
Cuando la muestra y la fase mvil son forzadas a atravesar la fase estacionaria,

entran en juego distintos tipos de interaccin entre cada uno de estos
componentes. Interacciones hidrofbicas, puentes de hidrgeno, interacciones
dipolares y electrostticas, son las responsables de la mayor o menos afinidad de
cada uno de los componentes de la muestra por la fase mvil o la fase
estacionaria. As, el componente ms afn a la fase estacionaria se retiene ms y
tarda ms en eluir (es decir, en salir de la columna) y el ms afn a la fase mvil
se retiene menos y eluye antes.
Esta separacin de los componentes se logra en todo lo que es ZONAS, las

cuales se conocen como bandas cromatogrficas, la seal para la elucin de
una sola banda se conoce como pico y el trazado de todos los picos se
denomina CROMATOGRAMA (Fig. 3).
Los picos son identificados por su tiempo de retencin (RT), que corresponde al
tiempo que tarda en eluir una determinada banda de la columna.
Es necesario diferenciar el mtodo por el cual la muestra es introducida:

jeringuillas de alta presin; que son ms convenientes y recomendadas para la
investigacin. Existiendo adems vlvulas inyectoras y suspendiendo el flujo
momentneamente.
5
Se requiere tambin el empleo de los denominados SEPTUM que van a limpiar la
aguja antes de cada inyeccin; los cuales deben tener suficiente resistencia como
para soportar sucesivas penetraciones de la aguja.
FIG. 2 SEPARACIN DE LOS COMPONENTES DE UNA MEZCLA
MEZCLA
SEPARACION POR TAMAO
SEPARACION POR AFINIDAD
6
FIG. 3 CROMATOGRAMAS (TRAZADO DE PICOS)
7
Es importante que la muestra sea soluble en la fase mvil para que pueda ser
transportada a travs de la columna.
Para evitar que la fase mvil disuelva la fase estacionaria, se debe saturar la fase
estacionaria con la fase mvil, ya sea con anterioridad a su introduccin al
instrumento, o mediante el uso de una precolumna (Fig. 4), que consiste en una
seccin cerca del tubo relleno de un soporte slido poroso que contiene un alto
porcentaje de fase estacionaria. A travs de esta precolumna se hace pasar la
fase mvil antes de que entre a la columna, y as se evita la prdida de sta.
FIG. 4 PRECOLUMNAS
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1.1.5 SISTEMAS DE GRADIENTES
La HPLC isocrtica puede separar un nmero limitado de picos, entre 10 y 12.

Para sistemas ms complejos, o cuando la polaridad de los componentes a
separar es muy diferente, podra ser que la modalidad isocrtica no la resuelva.
Para estos casos hay dos alternativas: la corrida multidimensional o la utilizacin
de un gradiente de solventes. En un gradiente de solventes, lo que se hace es
variar la composicin de la fase mvil (contenido porcentual del componente
fuerte de la mezcla), se comienza la elucin con un solvente dbil y se aumenta
progresivamente la proporcin del solvente fuerte. Esta variacin puede seguir
un perfil lineal, cncavo, convexo o una mezcla de estos perfiles en un mismo
cromatograma. El gradiente de solventes se grada por el intervalo de variacin,
es decir, por la velocidad de cambio del solvente dbil al fuerte. Por ejemplo,
puede iniciarse un gradiente en fase reversa comenzando con una fase mvil
constituida por agua-metanol (80:20) y cambiando gradualmente hacia agua-
metanol (20:80) con un perfil lineal (velocidad de cambio constante),
completndose el proceso en 15 minutos. En todos los casos el gradiente debe
comenzar con el solvente dbil, aumentando gradualmente la fuerza de la que
recibe la columna.
Existen bsicamente dos tipos de formadores de gradientes: los de baja presin y

los de alta presin. Los primeros emplean en general slo una bomba de vlvulas
selenoides que entregan cada solvente en una cmara de mezclado de pequeo
volumen; de esta manera se puede mezclar 2 a 4 solventes individuales. Los
segundos, en cambio requieren una bomba de alta presin para cada solvente
individual. (Fig. 5)
9
FIG. 5 SISTEMA DE GRADIENTES
10
1.1.6 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE UN HPLC
1.1.6.1 VENTAJAS
1. Separaciones rpidas: se pueden obtener separaciones en trminos de

minutos, requiriendo para ello, el empleo de columnas de alta eficiencia y el
empleo de bombeo de alta presin.
2. Alta resolucin: permite separar mezclas muy complejas.
3. Resultados cuantitativos: proporciona muy buena informacin, siendo posible
efectuar con facilidad anlisis cuya precisin suele ser menor del 1%.
4. Buena sensibilidad: los detectores habitualmente empleados proporcionan
buena sensibilidad y segn el tipo de muestra es posible medir hasta 10-9 ng;
otros dispositivos muy especiales pueden medir hasta 10-12 pico gramos.
5. Automatizacin: realiza el anlisis completo de la muestra, desde su
introduccin en el cromatgrafo hasta el clculo e impresin de los resultados.
6. Amplio espectro de aplicaciones: tanto en muestras orgnicas como
inorgnicas, slidas o lquidas, inicas o covalentes; las nicas muestras no
susceptibles de poder analizar con facilidad son las gaseosas.
La identificacin de cada seal se realiza comparando los tiempos de retencin

con valores previamente determinados y la cuantificacin se la realiza midiendo
las reas integradas de la seal.
1.1.6.2 DESVENTAJAS
1. No existe detector universal y sensible:

a) El detector de ndice de refraccin es de respuesta universal, pero de limitada
sensibilidad
b) El detector UV es sensible pero su respuesta es selectiva respondiendo solo a
compuestos que absorben radiacin UV.
Difcil anlisis cualitativo: la cromatografa lquida es una tcnica de separacin y

no de identificacin, aunque se podra obtener informacin cualitativa, adicional
(espectrometra de masas, espectroscopa infrarrojo o resonancia magntica
11
nuclear) que permite identificar con certeza un determinado compuesto; ya que
los parmetros cromatogrficos sirven de gua, no son confiables en grado
absoluto para identificacin.
2. Experiencia indispensable: el personal que opera estos mtodos debe tener
experiencia para as obtener el mayor provecho de esta tcnica instrumental.
3. Instrumentacin costosa: representa una inversin apreciable.
1.1.7 TIPOS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA
Existen cinco formas de realizar la Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia, cada

una de ellas emplea diferentes mecanismos de separacin de los componentes
de la muestra.
Con un cambio de columna se puede utilizar cada uno de ellos.
Cromatografa Lquido Lquido ( C.L.L.) o de Particin.
En esta cromatografa, las molculas de soluto van a distribuirse entre dos

lquidos inmiscibles: Fase mvil o Fase estacionaria, esta ltima consta de una
capa de lquido dispersa en un soporte slido finamente dividido. Debido a varios
inconvenientes, en especial derivados del tipo de fijacin de la fase estacionaria
al soporte, hizo que este mtodo haya sido casi totalmente desplazado.
Cromatografa Lquido Slido (C.L.S.) o de Adsorcin.
El mecanismo de separacin est basado en la competencia que existe entre las

molculas de la muestra y las de la fase mvil, por ocupar los sitios activos en la
superficie de un slido como la almina y gel de slice. Este mtodo emplea una
fase estacionaria polar como el gel de slice o slicagel y la fase mvil no polar
como el hexano, en general con el agregado de algn aditivo que provee
selectividad.
12
Cromatografa de Fase Ligada (C.B.P.)
Tan claras como las virtudes de la C.L. L. eran tambin sus limitaciones. Por esto
es lgico pensar que si se reemplazan el tipo de unin de la fase estacionaria a su
soporte, hacindola perdurable por medio de una unin qumica covalente, el
xito del material estara asegurado.
Es as como, variando la naturaleza de los grupos funcionales de la fase

estacionaria, es posible obtener diferentes tipos de selectividades, por lo tanto la
C.L.L. se puede realizar por 2 maneras:
a) FASE NORMAL
b) FASE REVERSA o INVERTIDA.
La primera se basa en el principio de que la fase estacionaria es una sustancia de

baja polaridad con grupos aminos (-NH2) y grupos nitrilos (-CN), el primer
mecanismo fue agregar a la base de slica un radical C18; y la fase mvil es no
polar como por ejemplo el hexano. La separacin se produce por interacciones de
acuerdo a la polaridad entre la molcula y la fase estacionaria.
En la segunda la fase estacionaria es no polar con grupos octilo (-C8H17),

octadecilo (-C18H37), fenilo (-C6H5), etc., y la fase mvil es polar usualmente una
mezcla agua-metanol y/o acetonitrilo.
La Fase Reversa ms comn utilizada en la industria farmacutica es -C18.

Por medio de este mecanismo las molculas que eluirn primero sern las de
alta polaridad y finalmente las de menor polaridad.
Este tipo de mecanismo se puede contaminar con todas las molculas de muy
baja polaridad las cuales quedarn retenidas irreversiblemente.
Es el mecanismo que ms se utiliza, su aplicacin se encuentra en ms del
70% de los anlisis por HPLC.
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Cromatografa Lquida de Exclusin por Tamao (C.L.E.)
Aqu se emplean materiales de porosidad controlada, es decir que la separacin

se va a efectuar de acuerdo con el tamao de las molculas. Puesto que la fase
estacionaria est compuesta de polmeros entrecruzados formando una red
abierta con numerosos poros de tamao uniforme que van a formar un filtro y
clasificar las molculas de la muestra segn un orden decreciente de tamao
molecular (las ms grandes son las primeras en elur mientras que las ms
pequeas son las ltimas) Si se dispone de estndares apropiados, de peso
molecular adecuado, puede evaluarse el peso molecular de un compuesto
desconocido, o bien la distribucin de pesos moleculares de un polmero sinttico.
Cromatografa de Intercambio Inico
La separacin por intercambio inico, se basa en el empleo de rellenos en los

cuales la partcula est constituida por un polmero o por silicagel, en cada caso
unida a un grupo funcional: aninico (amonio cuaternario para el intercambio de
aniones), y catinico (sulfnico para el intercambio de cationes).
Las columnas son ms largas que las utilizadas en estas cromatografas debido a
la baja eficiencia de los materiales intercambiadores de iones.
1.1.8 MATERIALES DE EMPAQUE Y COLUMNAS
La columna cromatogrfica analtica clsica en HPLC est formada por un tubo

cilndrico de acero inoxidable, de 25 a 30 cm de longitud y con un dimetro interno
en un rango de 2 a 4,6 mm. Contiene en su interior a la fase estacionaria y las
columnas de acero inoxidable pueden ser empacadas por dos mtodos, seco o
hmedo dependiendo del tamao de las partculas.
Estructura, forma y tamao son tres caractersticas importantes en las partculas

del empaque.
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LA SILICA es el material ms utilizado, actualmente se est recomendando el
material POLIDRICO por ejemplo: poliestireno- divinil benceno.
La slica provee alta rigidez fsica, alta eficiencia y gran compatibilidad con los
componentes orgnicos. Tiene limitada estabilidad al pH, generalmente se
recomienda trabajos en el rango de pH de 2.0 a 7.5. Para una mayor duracin se
sugiere trabajos de pH 3.5 a 7.5. En condiciones especficas se puede ampliar a
pH 8.5 a 11.
Los polmeros son ms estables pero poseen compatibilidad limitada con

solventes orgnicos. Se recomienda trabajos en un rango de pH de 0 a 14. Se
limpian con hidrxido de sodio o cidos fuertes para remover endotoxinas. No se
pueden utilizar a altas presiones. Tienen baja eficiencia en la separacin y pueden
usarse en fase reversa e intercambio inico.
El carbn es el material polimrico derivado, con alta estabilidad al pH y con alta

retencin para compuestos hidrofbicos.
Como alternativa se puede utilizar Almina, la cual tiene mejor estabilidad al pH

que la slica; pero no puede ser enlazada con rgano-silanos para robustecer la
fase enlazada. Presenta alta rigidez fsica, alta eficiencia y buena compatibilidad
con solventes orgnicos. La almina se enlaza con material polimrico
presentando excelente estabilidad en soluciones acuosas.
Existe en la actualidad columnas hbridas que ofrecen mayor resistencia

qumica, resuelve problemas de presin y ofrecen mxima resolucin.
Respecto a la forma y tamao de la partcula se puede decir que los primeros

materiales en HPLC fueron irregulares; usualmente de tamao grande (mayor de
5 micras), con baja eficiencia en la separacin. Luego vinieron los de forma
esfrica dando resultados ms eficientes; el tamao de partcula vara entre 1 a
20 micras, su capacidad de carga es menor que la de forma irregular. (Fig. 6)
15
- Para mayor reproducibilidad y estabilidad escoja esfricas
- Para mayor carga elija irregular.
FIG. 6 COLUMNAS
MATERIAL DE RELLENO
PARTICULAS IRREGULARES PARTICULAS ESFERICAS
16
Las columnas analticas se rellenan con partculas de 3 a 10 mm de dimetro,
tamao de 25 a 10 o 15 cm y 4 cm de dimetro con partculas de 5 mm, y 3 a 6 cm
de longitud para cromatografa de alta velocidad.
La partcula esfrica permite mejor empaquetamiento y as mayor eficiencia y as

mayor resolucin, menor sensibilidad al desgaste, mejorando la permeabilidad de
la columna al paso de la fase mvil, dando menor presin en el equipo.
La porosidad: es la relacin entre el volumen interno de los poros y el volumen

de la partcula.
El dimetro del poro determina el rea superficial (que determina la capacidad de

retencin de la fase estacionaria), a menor dimetro de poro mayor rea
superficial y mayor retencin.
El analito tendr completo acceso a la superficie interna del poro si el tamao de

la molcula es menor o igual a 1/10 veces el dimetro del poro, as: una molcula
de 6 A0 tendr acceso a 60 A0.
Las columnas pueden clasificarse segn la polaridad de su empaque en Fase

Normal y Fase Reversa. La fase Normal, tiene empaques altamente polares,
generalmente slica. La fase Reversa tiene empaques de baja polaridad, ejemplo:
Bondapak C18, es verstil e ideal para este tipo de anlisis, tambin pueden
usarse las C8.
En las columnas de intercambio inico clsicas, el empaque es una resina a la

cual se fija el compuesto de inters y luego se lo saca variando el pH de la fase
mvil.
Existen las llamadas columnas especiales para anlisis de carbohidratos, cidos

grasos, triglicridos y otros.
17
Todas las columnas tienen un instructivo en donde se indica qu cuidados tener
para su uso y almacenamiento.
1.1.9 SOLVENTES
La fase mvil o solvente, es un factor muy importante en Cromatografa Lquida.

Hay algunas caractersticas bsicas, las cuales deben tenerse en cuenta:
a. La fase mvil debe tener baja viscosidad para lograr una buena separacin.
Viscosidades altas tambin van a originar mayor presin sobre la columna.
b. Es importante que la muestra sea soluble en la fase mvil para que as pueda
ser transportada fcilmente a travs de la columna.
c. No debe degradar o disolver la fase estacionaria.
d. Debe ser compatible con el tipo de detector utilizado. Cuando se utiliza el

detector UV se debe tener cuidado de usar solventes que puedan absorber
fuertemente en el UV.
e. Debe tener una polaridad adecuada para permitir una retencin conveniente
de la muestra en la columna.
f. Debe ser de alta pureza o grado cromatogrfico, en especial al realizar anlisis

de alta sensibilidad con detectores como el UV y el de fluorescencia.
g. Deben estar libres de partculas, por lo que se aconseja filtrarlos a travs de

un filtro de tefln de 0,45 0,22 micrones de porosidad antes de su uso en
equipos de filtracin adecuado, con esto se eliminan partculas y
microorganismos.
h. El agua destilada debe ser de alta pureza o grado cromatogrfico.
18
i. Las soluciones buffers pueden causar problemas debido, a las impurezas., y
su calidad depender de los materiales que se usen para su preparacin.
j. Es mejor utilizar solventes libres de preservativos., por cuanto estos pueden

alterar sus caractersticas, entre los ms usados estn: tetrahidrofurano y el
cloroformo.
k. Es importante tomar en cuenta el costo y la toxicidad del solvente.
l. Los solventes deben desgasificarse debido a que los gases disueltos pueden
producir inconvenientes en el equipo. Para la desgasificacin se puede
emplear de un ultrasonido, vaco, o mediante el burbujeo de un gas inerte.
Entre los solventes ms empleados en Cromatografa Lquida tenemos:
-HEXANO
-CLORURO DE METILO
-CLOROFORMO
-TETRAHIDROFURANO
-ACETONITRILO
-ISOPROPANOL
-METANOL
-AGUA
Estos solventes estn nombrados segn su polaridad en orden creciente con

respecto a la adsorcin en gel de slice. Una gua para seleccionar el solvente o
mezcla de solventes apropiados para una determinada separacin, es la de las
escalas de polaridades de los solventes.
19
1.2 VITAMINAS
1.2.1 DEFINICION
Las vitaminas son compuestos orgnicos esenciales en el metabolismo y

necesarios para el crecimiento y, en general, para que el organismo funcione
correctamente. Las vitaminas participan en la formacin de hormonas, clulas
sanguneas, sustancias qumicas del sistema nervioso y material gentico. No se
relacionan qumicamente y tienen una accin fisiolgica distinta; actan
generalmente como catalizadores al combinarse con las protenas crean
metablicamente enzimas activas produciendo de esta manera importantsimas
reacciones qumicas en el organismo; por lo tanto su presencia es importante, ya
que sin las vitaminas las reacciones se realizan tardamente o no se producen.
Existen trece vitaminas identificadas que se clasifican por su disolucin:
Hidrosolubles (en agua); y Liposolubles (en grasa).
1.2.2 VITAMINAS HIDROSOLUBLES
Dentro de los nutrientes esenciales para mantener la salud y el crecimiento

normal, estn las vitaminas hidrosolubles que se caracterizan por su alta
disolucin en agua, por lo que fcilmente pueden pasarse al agua de lavado y
coccin de los alimentos, por este motivo muchos alimentos ricos en este tipo de
vitaminas al final de prepararlos pierden la cantidad que tenan en su inicio.
Como estas vitaminas no se almacenan en el organismo, deben ser incorporadas

con regularidad. Se considera que no tienen efecto txico por muy altos que sean
sus niveles de ingesta, puesto que sus excesos son excretados por la orina.
Hablaremos especficamente de las vitaminas hidrosolubles que son aadidas en
las harinas de trigo para su fortificacin.
20
1.2.2.1 VITAMINA B1
Denominada TIAMINA, acta como catalizador en el metabolismo de los

carbohidratos liberando su energa y metabolizando el cido pirvico, participa en
la sntesis de sustancias que regulan el sistema nervioso. Su insuficiencia
produce beriberi (una enfermedad que se caracteriza por presentar parlisis,
atrofia muscular, inflamacin del corazn, calambres en las piernas; incluso
ataque al corazn y muerte en casos graves).
Aunque muchos alimentos la contienen, son pocos los que aportan cantidades
considerables. Los alimentos ms ricos en B1 son: carne de cerdo, vsceras
(hgado, corazn, riones), levadura de cerveza, carnes magras, huevos,
vegetales de hojas verdes, la cascarilla de los cereales, el germen de trigo, bayas,
frutos secos y legumbres.
En la molienda de los cereales queda eliminada la parte ms rica en Tiamina, por

lo que se realiza la fortificacin de las harinas para evitar su insuficiencia.
Su molcula consiste en un anillo de pirimidina y otro de tiazol, ambos unidos por

un puente de metileno. Las formas ms comerciales son el cloruro-clorhidrato y el
mononitrato.
1.2.2.1.1 Estabilidad
Inestable al calor, lcali, oxgeno y radiaciones. Se pierde alrededor de un 25%

en la coccin habitual de los alimentos.
1.2.2.2 VITAMINA B2
Denominada Riboflavina, acta como coenzima; por lo que debe asociarse a una
porcin de otra enzima para que se haga efectivo el metabolismo de los hidratos
de carbono, grasas, y de las protenas que participan en el transporte de oxgeno;
adems acta en el mantenimiento de las membranas mucosas. Se puede
21
complicar su insuficiencia si existe carencia de otras del grupo B. Su insuficiencia
no tiene sntomas muy definidos como el caso de la B1; se producen lesiones en
la piel, cerca de los labios y nariz, y alteraciones en la mdula sea.
Los alimentos que contienen B2 son: hgado, leche, carne, espinacas, huevos,
cereales enteros y enriquecidos, pan, pastas, setas.
Se define qumicamente como un 7,8-dimetil-10-(1-D-ribotil) isoaloxazina y es

una estructura planar.
Estable al calor, pero se puede perder hasta el 50% de su contenido en los

alimentos si estos estn expuestos a la luz durante la coccin. La esterilizacin
de los alimentos por irradiacin o con xido de etileno puede destruir el contenido
de B2 en los mismos.
1.2.2.3 VITAMINA B3
A esta vitamina del complejo B ( Vitamina PP) se le asigna el trmino Niacina, se

lo usa como descriptivo genrico del cido nicotnico y sus derivados que poseen
actividad biolgica cualitativa de nicotinamida. Funciona como una coenzima
liberando la energa de los nutrientes. Su insuficiencia produce pelagra (cuyo
primer sntoma es una erupcin en la piel expuesta al sol parecida a una
quemadura solar); otros sntomas son lengua roja e hinchada, diarrea, confusin
mental, irritabilidad, tambin existe depresin y trastornos mentales cuando se ve
afectado el sistema nervioso central.
Los alimentos que la contienen son: hgado, carne, salmn, atn enlatado,
legumbres, frutos secos, cereales enteros o enriquecidos. El cuerpo tambin la
fabrica a partir del cido triptfano.
22
Qumicamente se presenta como cido o como amida; en el trigo existen varias
formas de niacina unida a diversos pptidos, pentosas, hexosas, por lo que se
denomina niacingeno o niacitina.
Es estable al calor, la luz, y a los lcalis.
1.2.2.4 VITAMINA B9
Es otra vitamina del grupo B, denomina Acido flico. Tiene otros trminos
intercambiables como son folato, folatos y folacina. Varias investigaciones sobre
metabolismo, caractersticas analticas y de absorcin, demostraron su
importancia nutricional en la defensa del cncer, enfermedades cardacas,
accidente cerebrovasculares y los defectos congnitos; es efectivo en el
tratamiento de cierta anemias.
Los alimentos que la contienen son: vsceras de animales, verduras de hoja

verde, legumbres, frutos secos, germen de trigo, levadura de cerveza.
El folato de los alimentos es inestable. Se pierde en la coccin de los alimentos, y

en los conservados a temperatura ambiente como en el caso de los vegetales de
hojas verdes que pierden hasta un 70% de su contenido en tres das.
23
1.3 ALIMENTOS FORTIFICADOS
Alimentos fortificados, segn el Artculo 1363 del Cdigo Alimentario Argentino,

son productos suplementados en forma significativa en su contenido natural de
nutrientes esenciales. Deben aportar entre el 20% y el 100% de los
requerimientos diarios recomendados para adultos y nios de ms de 4 aos de
edad.
Las empresas utilizan la fortificacin como una estrategia de diferenciacin para

elaborar alimentos que puedan ser percibidos como productos de mayor valor.
Por esta razn generalmente se fortifican alimentos a los que se puede agregar
valor con poco costo adicional, como los panificados, cereales para desayunos,
lcteos, lcteos, galletas y pastas.
1.3.1 CONTENIDO DE MICRONUTRIENTES EN TRIGO Y EN HARINA DE

TRIGO
La harina de trigo es el alimento ms utilizado en la fortificacin ya que en muchos

pases y sectores poblacionales, constituye casi la mitad de la ingesta calrica
diaria.
El grano de trigo (Fig. 7) en su estado natural posee una buena fuente de

vitaminas del complejo B, hierro y Zinc, perdindose ms de la mitad de estos
nutrientes con la molienda.
1.3.2 LEGISLACION
Es obligatoria la fortificacin de la harina de trigo con las vitaminas B1, B2,

Niacina, e Hierro, en Bolivia, Colombia, ECUADOR, Costa Rica, Chile, El
Salvador, Guatemala, Honduras, Panam, Repblica Dominicana, Venezuela,
Nigeria, Arabia Saudita, Canad, Estados Unidos y Reino Unido.
24
En Bolivia, Canad , Colombia, ECUADOR y Guatemala, es obligatorio tambin
aadir cido flico.
FIGURA 7
25
Los niveles de nutrientes agregados varan segn el pas, cuando la dieta global
es deficiente en algn micronutriente debido a las caractersticas nutricionales de
la poblacin.
1.3.3 COSTOS Y TECNOLOGIA
Las industrias molineras de estos pases productores de la materia prima para el

ms importante de los alimentos ofrecen la gran oportunidad de mejorar la salud
de sus habitantes a tan bajo costo y en tan corto tiempo.
El costo de fortificar es mucho menor que la que se reconoce generalmente.

Estudios realizados demuestran que representa el 0.1% del costo de la harina en
los locales comerciales.
De igual manera, la tecnologa para fortificar la harina es simple, ya que se

necesita de una Premezcla de los micronutrientes que se van a agregar, la cual
tiene una concentracin y distribucin adecuada de los mismos.
La fortificacin se realiza por medio de un alimentador volumtrico (Fig. 8)

conectado hacia el final del proceso de molienda. La cantidad de Premezcla que
se agrega puede ser modificada si se cambia la velocidad del motor; la
concentracin de esta Premezcla se calcula pesando la cantidad depositada en el
alimentador en un minuto, dividido por el volumen del flujo que pasa por debajo
durante el mismo perodo de tiempo.
26
FIGURA 8
27
CAPITULO II
2.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Por medio del estudio de control analtico cuantitativo Podra unificar la

determinacin de las vitaminas hidrosolubles en harinas de trigo fortificadas por
HPLC?
2.2 HIPOTESIS
El proceso de control analtico cuantitativo por HPLC (Cromatografa Lquida de

Alta Eficiencia) unifica la determinacin de vitaminas hidrosolubles presentes en
harinas de trigo fortificadas.
2.3 OBJETIVOS
2.3.1 OBJETIVO GENERAL
Contribuir al establecimiento de un proceso de control analtico cuantitativo para la

determinacin de vitaminas hidrosolubles por HPLC en harinas de trigo
fortificadas.
2.3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Separar las vitaminas hidrosolubles por HPLC, mediante un tratamiento

adecuado de las muestras.
2. Fijar las condiciones de operacin para el proceso analtico cuantitativo como:
sistema, tipo de columna, fase mvil, volumen de inyeccin, velocidad de flujo,
detector.
3. Verificar si los resultados satisfacen los requerimientos al ser comparados con
los resultados obtenidos en Premezcla vitamnica.
28
4. Verificar si la concentracin de Premezcla vitamnica aadida en las harinas
de trigo cumple con las especificaciones mnimas establecidas por la Norma
INEN 616.
2.4 VARIABLES
2.4.1 DEFINICION DE VARIABLES
2.4.1.1 VARIABLES CUALITATIVAS:
Textura de la muestra: polvo fino, homogneo.

Color de la muestra: propio del producto.
Solubilidad de la muestra: fcilmente soluble en agua a temperatura
ambiente.
Forma de conservacin de la muestra y estndares secundarios: apropiados
para evitar la degradacin de los micronutrientes.
2.4.1.2 VARIABLES CUANTITATIVAS:
Peso de la muestra: cantidad suficiente, cuya dilucin contenga valores

cuantificables de cada vitamina.
pH de la solucin muestra: cido.
Concentracin de micronutrientes en solucin muestra y solucin estndar:
relacionada al mnimo requerido de cada uno de los micronutrientes por cada
kilogramo de harina.
Fase Mvil: lquido que permite atravesar la muestra por la columna.
Flujo: velocidad en la que pasa la fase mvil por el sistema.
Volumen de inyeccin: cantidad de muestra inyectada al sistema.
Longitud de onda: se escoge la de mxima absorcin de los micronutrientes.
Tiempos de retencin: tiempo en que eluye cada micronutriente.
29
CAPITULO III
MATERIALES Y METODOS
Se realizar un estudio de tipo analtico para determinar las vitaminas

hidrosolubles por HPLC en las harinas de trigo fortificadas, tomando datos en el
perodo comprendido desde Abril de 1999 a Julio del 2003, en el Laboratorio de
Bromatologa del Departamento de Registro y Control Sanitario de Alimentos
Procesados del Instituto Nacional de Higiene de la ciudad de Guayaquil.
3.1 METODO
Se realizar para el anlisis de las muestras, un mtodo analtico cuantitativo
mediante la utilizacin de un Cromatgrafo Lquido, en soluciones preparadas con
solventes orgnicos.
3.2 UNIVERSO
Todas las harinas de trigo fortificadas de produccin nacional y que han optado
por obtener el Registro Sanitario.
3.3 MUESTRA
Para realizar el estudio se han tomado en cuenta un total de 47 muestras de
harinas de trigo fortificadas, incluyendo las Premezclas vitamnicas utilizadas en
su fortificacin, que aplicaron para la obtencin del Registro Sanitario en el
Instituto Nacional de Higiene de la ciudad de Guayaquil, durante el perodo
comprendido entre Abril de 1999 a Julio del 2003.
3.4 DESARROLLO DEL PROCESO

En este estudio se siguieron varios procesos de ensayo hasta establecer el
ptimo. Se emple en todos los casos un sistema isocrtico en fase reversa. A
continuacin de detallan cada uno de ellos.
30
3.4.1 PROCESO # 1
Preparacin/Tratamiento de la muestra: 10 g muestra + 50 ml de solucin de

Bicarbonato de sodio 0,1 M + calentamiento, No se lleva a enrase.
Preparacin de la solucin estndar: se pesan y se hacen diluciones hasta llegar

a obtener una concentracin final equivalente a la solucin muestra.
Fase Mvil: Mezcla de dos soluciones metanlicas de Butano Sulfonato Sdico y

Heptano Sulfonato Sdico.
Condiciones de operacin:
Volumen de inyeccin: 5 ml
Deteccin: 280 nm
Flujo: 0,8 ml/min
Tiempo de corrida: 30 min
Resultados de acuerdo a clculos realizados e interpretacin: (ver Captulo 4)
3.4.2 PROCESO # 2
Preparacin/Tratamiento de la muestra: 10 g de muestra + 50 ml de Bicarbonato

de sodio 0,1 M + ligero calentamiento en Bao de Mara + enrasar a 100 ml con
metanol.

Fase Mvil: Mezcla de dos soluciones metanlicas de Butano Sulfonato Sdico y

Heptano Sulfonato Sdico.
31
Deteccin: 280 nm
Flujo: 0,8 ml/min
Tiempo de corrida 25 min
3.4.3 PROCESO # 3
Tratamiento de la muestra: 10 g de muestra + 40 ml de Acido Clorhdrico 0,1 N +

autoclave por 30 min + enfriar + 20 ml de agua destilada + 1 ml de Hidrxido de
sodio 1 N + enrasar con Fase Mvil hasta 100 ml.

Fase Mvil: Buffer PO4H2Na 0,02 M pH 2,8 Acido fosfrico/Acetonitrilo (90:10)
Deteccin: 280 nm
Flujo: 0,8 ml/min
3.4.4 PROCESO # 4
Tratamiento de la muestra: 10 g de muestra + 40 ml de Acido clorhdrico 0,1 N +

agitacin + calentar ligeramente a Bao de Mara a 60oC+ enfriar + 20 ml de agua
destilada + 1 ml de Hidrxido de sodio 1 N + enrasar con Fase Mvil.

32
Deteccin: 280 nm
Flujo: 0,8 ml/min
3.4.5 PROCESO # 5
A) Tratamiento de la muestra: 10 g de muestra + 20 ml de agua destilada + 1 ml

de Hidrxido de sodio 1 N + 40 ml de cido actico al 2 % + calentamiento a
Bao de Mara a 80oC por 5 minutos + enfriar + enrasar hasta 100 ml con
Fase Mvil.
Preparacin de la solucin estndar: se pesan y se hacen diluciones hasta

llegar a obtener una concentracin final equivalente a la solucin muestra.
Deteccin: 280 nm
Flujo: 0,8 ml/min
B) Tratamiento de la muestra: El mismo, lo que vara son las condiciones de

operacin: concentracin de la fase mvil, lo que hace disminuir el tiempo de
corrida.
33
Preparacin de la solucin estndar: se pesan y se hacen diluciones hasta
llegar a obtener una concentracin final equivalente a la solucin muestra.
Fase Mvil: Buffer PO4H2Na 0,026 M pH 2,8 Acido fosfrico/Acetonitrilo

(88:12)
Deteccin: 280 nm
Flujo: 0,8 ml/min
3.4.6 PROCESO # 6
Tratamiento de la muestra: 10 g de muestra + 40 ml de agua destilada + 2 ml de

hidrxido de sodio 1 N + agitar fuertemente + 40 ml de cido actico al 2 % +
agitar + calentar a Bao de Mara a 700C por 2 min. + enfriar hasta 350C + 0,5 g
de amilasa + agitar + enfriar a temperatura ambiente + enrasar con Fase mvil.

Fase Mvil: Buffer PO4H2Na 0,024 M pH 2,8 cido fosfrico/Acetonitrilo (88:12)
Deteccin: 280 nm
Flujo: 0,8 ml/min
Tiempo de corrida: 10 min.
34
3.4.7 PROCESO # 7
Tratamiento de la muestra: 10 g de muestra + 40 ml de agua destilada + 1 ml de

Hidrxido de sodio 1 N + agitar fuertemente + 40 ml de cido actico al 2 % +
agitar + enrasar a volumen final con Fase mvil.

Fase Mvil: Buffer PO4H2Na 0,024 M pH 2,8 cido fosfrico/Acetonitrilo (88:12)
Deteccin: 280 nm
Flujo: 1 ml/min
Tiempo de corrida: 8 min.
En vista de que los resultados obtenidos con el Proceso # 7 son los que se
ajustan a los requerimientos esperados, describo en detalle el mismo.
3.5 DESCRIPCION DEL PROCESO # 7
3.5.1 FUNDAMENTO
- Extraccin de las vitaminas hidrosolubles con cido actico diluido.
- Inyeccin de la solucin muestra y de la solucin standard conteniendo las

cuatro vitaminas en proporciones adecuadas sobre una columna de fase
reversa en HPLC.
- Sistema isocrtico.
35
- Deteccin espectrofotomtrica de las vitaminas a una longitud de onda
constante de 280 nm.
- Separacin de cada vitamina en tiempos de retencin (R. T) apropiados, para

facilitar su identificacin.
3.5.2 INSTRUMENTOS
Centrfuga
Bomba y equipo para hacer vaco
Filtros de membrana o Millipore de 0,45m
Filtros de polipropileno o Puradisc de 0,2m
Jeringas descartables
Sistema HPLC Modular (LaChrom de Merck-Hitachi):
-Automuestreador, Mod. L-7200
-Bomba de doble pistn, Mod. L-7100
-Detector UV, Mod. L-7400
-Oven Columna, Mod. L-7351
-Integrador, Mod. D-7500
-Gradiente de solventes(Solvent Degasser), Mod. L-7612
3.5.3 MATERIALES
Matraces volumtricos de 100 ml

Pipetas volumtricas de 10 ml
Pipetas graduadas de 2 ml
Cilindros graduados de 1000 ml
Cilindros graduados de 50 ml
Tubos para centrfuga de 50 ml
36
Esptulas
3.5.4 REACTIVOS
En lo posible todos los reactivos deben ser de grado analtico para Cromatografa
en fase Lquida.
Agua destilada
cido actico al 2 %
Acetonitrilo
Fosfato cido de sodio 0,024 M
cido fosfrico
Hidrxido de sodio 1 N
Estndares de vitaminas:
-Mononitrato de Tiamina
-Nicotinamida
-cido flico
-Riboflavina
3.5.5 PREPARACION DE LA FASE MOVIL
Parte A (Solucin Buffer): Preparar 1 litro de Fosfato cido de sodio 0,024 M y

llevar a pH 2,8 con cido Fosfrico, filtrar con bomba de vaco a travs de un filtro
de membrana de celulosa de 0,45 micras. Esta solucin se la puede almacenar
hasta 72 horas en refrigeracin.
Parte B: Acetonitrilo
Nota: Cuando se va a utilizar Fase Mvil para enrasar las soluciones estndar o
la solucin muestra, se debe hacer una mezcla de la Parte A y de la Parte B
(88:12, respectivamente).
37
3.5.6 PREPARACION DE LA SOLUCION ESTANDAR
La solucin estndar de vitaminas se prepara al momento del anlisis, se pesa

una cantidad equivalente a la concentracin de las mismas en 10 g de harina de
trigo.
Vitamina B1 (Tiamina): 28,0 mg diluidos hasta concentracin final de

0,44mg/ml.
En un matraz volumtrico de 50 ml se pesan alrededor de 28,0 mg de Tiamina, se
agregan 25 ml de agua destilada recientemente filtrada al vaco a travs de un
filtro de membrana de 0,45 micras; se aaden 2 ml de hidrxido de sodio 1 N y 2
ml de cido actico al 2%, se enrasa con Fase Mvil.
Vitamina B2 (Riboflavina): 25,0 mg diluidos hasta concentracin final de

0,8mg/ml.
En un matraz volumtrico de 50 ml se pesan alrededor de 25,0 mg de Riboflavina,
se agregan 25 ml de agua destilada recientemente filtrada al vaco a travs de un
ml de cido actico al 2 %, se enrasa con Fase Mvil.
Vitamina B3 (Nicotinamida): 25,0 mg diluidos hasta concentracin de 4,0

mg/ml.
En un matraz volumtrico de 25 ml se pesan alrededor de 25,0 mg de Niacina, se
agregan 12,5 ml de agua destilada recientemente filtrada al vaco a travs de un
Vitamina B9 (cido Flico): 16,0 mg diluidos hasta concentracin final de

0,06 mg/ml.
En un matraz volumtrico de 100 ml se pesan alrededor de 16,0 mg de cido
flico, se agregan 50 ml de agua destilada recientemente filtrada a travs de un
filtro de membrana de 0,45 micras, se aaden 2 ml de hidrxido de sodio 1 N y 2
38
3.5.6.1 Dilucin final de solucin estndar
Para realizar las diluciones y obtener una solucin estndar que contenga las 4
vitaminas en su respectiva concentracin final ya antes indicada, se debe
proceder de la siguiente manera:
-A un matraz volumtrico de 25 ml se agregan de las soluciones anteriormente
preparadas, 2 ml de Tiamina, 4 ml de Riboflavina, 10 ml de Niacina y 1 ml de
cido flico; se enrasa finalmente con agua destilada.
-Luego, de esta misma solucin cogemos 1 ml y llevamos a un matraz de 100 ml

y enrasamos con agua destilada.
-Esta ltima dilucin es la que consideraremos como nuestra solucin estndar de

vitaminas hidrosolubles. Finalmente esta solucin se la filtra a travs de un filtro
de polipropileno de 0,2 micras, se la coloca en su respectivo vial para luego ser
inyectada en el Cromatgrafo Lquido.
3.5.7 PREPARACION DE LA SOLUCION MUESTRA
3.5.7.1 Preparacin de muestra de harina de trigo fortificada
En un matraz volumtrico de 100 ml se pesan 10 g de muestra (harina de trigo),

se disuelve con la ayuda de 40 ml de agua destilada recientemente filtrada al
vaco a travs de un filtro de membrana de celulosa de 0,45 micras; agregamos 2
ml de hidrxido de sodio 0,1 N para ayudar a una mejor disolucin de las
vitaminas, en vista de que el medio adecuado para ello es el alcalino; despus de
una agitacin vigorosa se aaden 40 ml de cido actico al 2% para extraer las
vitaminas disueltas; finalmente enrasamos con Fase Mvil y agitamos. Luego
llevamos a centrifugacin durante 30 minutos en tubos de 50 ml. El sobrenadante
se filtra a travs de filtros de polipropileno de 0,2 micras. La solucin filtrada
transparente se la coloca en su respectivo vial para luego ser inyectada en el
Cromatgrafo Lquido.
39
3.5.7.2 Preparacin de solucin muestra de Premezcla vitamnica
Para trabajar con Premezcla, se debe considerar el valor declarado para cada
vitamina en su frmula de composicin, adems de la cantidad que es aadida
por cada tonelada de harina; de acuerdo a estos datos se pesar y se harn
diluciones respectivas para finalmente obtener una concentracin de las mismas
equivalentes a lo que podra tener 10 g de harina de trigo fortificada. Se
expresar la concentracin en mg/Kg, realizando los clculos como se indica para
las harinas de trigo fortificadas.
3.5.8 CONDICIONES DE OPERACION
Columna C18 : de acero inoxidable de 25 cm de longitud y 4 mm de dimetro

(Ej.: Purospher RP-18e (5mm) LichroCART 250-4)
Precolumna o guarda columna: de acero inoxidable (Ej.: LichroCART 4-4)
Fase Mvil: Buffer/Acetonitrilo (88:12)
Magnitud de flujo: 1,0 ml/min
Volumen de inyeccin: 96ml
Presin: hasta 4000 psi
Tiempo de corrida: menor a 10 min.
Tiempos de retencin:
-Tiamina (Vitamina B1) cerca de 2 min.
-Nicotinamida (Vitamina B3) cerca de 3 min.
-cido flico (Vitamina B9) cerca de 4 min.
-Riboflavina (Vitamina B2) cerca de 7 min.
Detector: UV a 280 nm
Temperatura: ambiente
40
3.5..9 DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO # 7
ESQUEMA 1
PREPARACIN DE LA SOLUCION ESTANDAR
SOLUCION SOLUCION SOLUCION SOLUCION
TIAMINA NICOTINAMINA AC. FOLICO RIBOFLAVINA
1 28,0 mg 25,0 mg 16,0 mg 25,0 mg

(matraz 50 ml) (matraz 25,0 ml) (matraz 100 ml) (matraz 50ml)
agua destilada
NaOH1N
Ac.actico 2%
Enrase con fase mvil
DILUCIN FINAL DE SOLUCION ESTANDAR
2 ml 10 ml 1 ml 4ml
3 enrasar agua destilada

(25 ml)
1ml
4 enrasar agua destilada

(100 ml)
Solucin estndar de vitaminas hidrosolubles contiene
aprox.(0.44 mg/ml T; 4,0 mg/ml N; 0.06 mg/ml Ac.F.; 0,8mg/ml R)
5 filtrar a un vial pormedio de filtro p.p de 0.2 m
6 Inyectar en el HPLC 96 ml
41
ESQUEMA 2
PREPARACIN DE LA SOLUCION MUESTRA
10 g harina de trigo fortificada

1
40 g agua destilada
2 ml NaOH 1N (disolucin de vitaminas)
Agitar
40 ml Acido actico 2% (extraccin de vitaminas)
2 Enrasar con fase mvil

(matraz 100 ml)
Solucin muestra de harina de trigo fortificada contiene como
Concentracin terica (0.4mg/ml T; 0.06mg/ml Ac. F; 4.0mg/ml N; 0,7 mg/ml R)
3 Centrifugar a 600 rpm por 30 minutos
4 Filtrar a un vial por medio de filtro de p.p de 0.2m
5 Inyectar en el HPLC 96ml
42
3.6 CLCULOS
3.6.1 Concentracin de cada vitamina en la solucin estndar final
Se calcula la concentracin (Cst) individual de las vitaminas en mcg/ml
PstxA1xA2 x1000
Cst =
V0xV1xV2
Pst = Peso en mg del estndar usado

A1 = volumen de alcuota para la primera dilucin
A2 = volumen de alcuota para la segunda dilucin
V0 = Volumen del matraz utilizado para pesar el estndar
V1 = Volumen de la primera dilucin
V2 = Volumen de la segunda dilucin
3.6.2 Concentracin terica de cada vitamina en la solucin muestra
Se realiza el clculo del contenido terico (CT) individual de las vitaminas

aadidas a la harina de trigo considerando el valor mnimo requerido de cada una
de ellas segn Norma INEN 616 en mg/Kg de harina.
PhtxVitx1000
CT =
Vx1000
Pht = Peso en g de la muestra: harina de trigo

Vit = miligramos de vitamina aadida por cada 1000 g de harina
V = Volumen del matraz utilizado para pesar la muestra
CT= mcg/ml
43
3.6.3 Contenido experimental de vitaminas en la solucin muestra
Para hacer el clculo del contenido experimental (CE)de vitaminas aadidas, se

siguen tres pasos:
1.- Se calcula la concentracin de vitaminas en la muestra (mcg/ml), tomando las

reas de los picos del cromatograma, tanto del estndar como de la muestra.
Fht x Cst
CE =
Fst
Fht = rea del pico de la solucin muestra

Fst = rea del pico de la solucin estndar
Cst = concentracin de vitamina en la solucin estndar en mcg/ml
2.- Sacamos el equivalente en porcentaje (% eq) del contenido terico (CT) de
vitaminas declaradas en frmula de composicin con el contenido experimental
(CE).
CE x 100
% eq =
CT
3.- El porcentaje equivalente finalmente lo relacionamos con la cantidad de

vitamina aadida considerando el valor mnimo requerido de cada uno de ellos
segn Norma INEN 616 (FC) y se expresa en mg/kg de muestra .
FC x % eq
mg/kg =
100
44
FC= Frmula de composicin aparente en el caso de harina de trigo.
FC= Frmula de composicin del fabricante en el caso de premezclas vitamnicas.
3.7 EJEMPLO ILUSTRATIVO
3.7.1CROMATOGRAMA DE UNA SOLUCIN ESTANDAR DE

VITAMINAS
Tiempo de Retencin (R.T en minutos)
1.72 Tiamina
2.64 Nicotinamida
3.56 cido flico
6.61 Riboflavina
45
3.7.2 CROMATOGRAMA DE UNA SOLUCIN MUESTRA DE
HARINA DE TRIGO FORTIFICADA
Tiempo de Retencin (R.T en minutos)
0.35
1.19
1.81 Tiamina
2.52 Nicotinamida
3.80 cido flico
6.78 Riboflavina
46
3.7.3 AREAS DE LOS PICOS DE UN CROMATOGRAMA
ESTNDAR DE VITAMINAS HARINA DE TRIGO
VITAMINA R.T Area R.T Area
(Tiempo de retencin) (Tiempo de retencin)
Tiamina 1.72 36209 1.81 97405
Ncotinamida 2.64 104159 2.52 505129
cido flico 3.56 54258 3.80 104598
Riboflavina 6.61 25930 6.78 57374
3.7.4 Concentracin de cada vitamina en la Solucin Estndar

PstxA1xA2x1000
Cst =
V0xV1xV2
TIAMINA
28 mg 1 00% pureza
X 99.56% pureza
X = 27.87 mg Tiamina
27.87 mg 50 ml
2ml 25 ml
1 ml 100 ml
27.87 mg x 2 ml x 1 ml x 1000
Cst =
50ml x 25 ml x100 ml
Cst = 0.445 mg/ml Tiamina
NICOTINAMIDA
25.0 mg 1 00% pureza
X 99.9% pureza
X = 24.97 mg Tiamina
24.97 mg 25 ml
10ml 25 ml
1 ml 100 ml
47
24.97 mg x 10 ml x 1 ml x 1000
Cst =
Cst =3.99 mg/ml Ncotinamida
ACIDO FOLICO
X 100.2% pureza
X = 16.03 mg cido flico
16.03 mg 100 ml
1ml 25 ml
1 ml 100 ml
16.3 mg x 1 ml x 1 ml x 1000
Cst =
100ml x 25 ml x100 ml
Cst = 0.064 mg/ml cido flico
RIBOFLAVINA
X 98% pureza
X = 24.5 mg Tiamina
24.5 mg 50 ml
4ml 25 ml
1 ml 100 ml
24.5 mg x 4 ml x 1 ml x 1000
Cst =
Cst = 0.784 mg/ml Riboflavina
48
3.7.5 Concentracin terica de cada vitamina en la solucin
muestra.
PhtxVitx1000
CT =
Vx1000
Peso harina de trigo = 10 g 100 ml
TIAMINA
10gx4.0mgx1000
CT =
100 mlx1000 g
CT= 0.4 mg/ml Tiamina
NICOTINAMIDA
10gx40mgx1000
CT =
100 mlx1000 g
CT= 4.0 mg/ml Ncotinamida
ACIDO FOLICO
10gx0.6mgx1000
CT =
100 mlx1000 g
CT= 0.06 mg/ml cido flico
RIBOFLAVINA
10gx7.0mgx1000
CT =
100 mlx1000 g
CT= 0.7 mg/ml Riboflavina
49
3.7.6 CONTENIDO EXPERIMENTAL DE VITAMINAS EN SOLUCION
MUESTRA.
Fht x Cst CE x 100 FC x % eq

CE = % eq = mg/kg =
Fst CT 100
TIAMINA
97405 x 0.44 1.183 x 100 4 x 295.75

CE = % eq = mg/kg =
36209 0.4 100
CE= 1.183 % eq = 295.75 mg/kg = 11.83 Tiamina
NICOTINAMIDA
505129 x 3.99 19.34x 100 40 x 483.74

CE = % eq = mg/kg =
104159 4.0 100
CE= 19.34 % eq = 483.74 mg/kg = 193.49

Nicotinamida
CIDO FLICO
104598 x 0.064 0.123 x 100 0.6 x 205.63

CE = % eq = mg/kg =
54258 0.06 100
CE= 0.123 % eq = 205.63 mg/kg = 1.23 cido Flico
RIBOFLAVINA
57374 x 0.784 1.734 x 100 7 x 247.81

CE = % eq = mg/kg =
25930 0.7 100
CE= 1.734 % eq = 247.81 mg/kg = 17.347 Riboflavina.
50
CAPITULO IV
RESULTADOS E INTERPRETACIN
Los resultados son el promedio de 3 o ms inyecciones de la muestra al sistema

cromatogrfico y estn distribuidos por ao.
Ao 1999
PROCESO # 1
Muestras trabajadas: Harina de trigo # 1, Premezclas vitamnicas A y B.

Total de muestras: 3
(mg/kg) H#1 Pre-vit. A Pre-vit. B
Tiamina 0,94 0,24 0,36

Nicotinamida 1,34 15,55 2,19
Acido Flico 0,26 0,10 0,18
Riboflavina 1,67 0,03 3,61
Interpretacin de resultados: Los resultados no reportan registro de vitaminas;

por lo tanto se prueba con otro proceso.
51
PROCESO # 2
Muestras trabajadas: Harinas de trigo # 1, # 2, # 3, # 4, # 5, # 6, # 7 .

Total de muestras : 7
H #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 (mg/kg)
Tiamina 13,7 8,99 10,46 8,82 10,67 13,08 9,58
Nicotinamida 23,52 10,97 40,65 19,62 37,25 15,8 12,69
Acido Flico 0,83 1,04 1,22 0,87 0,96 5,25 0,59
Riboflavina 0,05 0,14 0,11 0,07 0,12 0,06 0,07
Interpretacin de resultados: Los resultados son favorables para la Tiamina y el

Acido Flico, no as para Riboflavina y Ncotinamida.
PROCESO # 3
Muestra trabajada: Harina de trigo # 1

H #1
Tiamina 2139,0
Nicotinamida 97,71
Acido Flico 179,27
Riboflavina 9,83
Interpretacin de resultados: Los resultados solo son confiables para

Nicotinamida y Riboflavina. En la siguiente prueba se sugiere no llevar al
autoclave.
52
PROCESO # 4

H #1 (mg/kg)
Tiamina 8,71
Nicotinamida 2,89
cido Flico 0,68
Riboflavina 0,08
Interpretacin de resultados: Los resultados son favorables para la Tiamina y el

cido Flico.
PROCESO # 5

H #8 (mg/kg)
Tiamina 9,46
Nicotinamida 87,86
Acido Flico 0,93
Riboflavina 6,21
Interpretacin de resultados: El tratamiento de la muestra con cido actico nos

da resultados satisfactorios para Tiamina, Nicotinamida y cido Flico.
53
Variando la concentracin del Buffer y de la Fase mvil se trabaj el mismo
proceso con otras dos muestras.
Muestras trabajadas: Harinas de trigo # 9 y # 10

H #9 # 10 0 (mg/kg)
Tiamina 16,39 42,07
Nicotinamida 131,58 220,09
Acido Flico 0,16 0,29
Riboflavina 16,81 7,08 0
Interpretacin de resultados: Notamos que los valores de Tiamina,

Nicotinamida y Riboflavina son satisfactorios; no as para Acido flico.
Bajo las mismas condiciones anteriores, pero disminuyendo el volumen de

inyeccin (5 ml), se trabaj una premezcla vitamnica.
Muestras trabajadas: Premezcla vitamnica A

(g/kg) Pre-vit. A Frm. Comp. x s C.V.

Tiamina 26,17 25,66 25,915 0,36 1,39 %
Nicotinamida 260,36 234,59 247,48 18,22 7,36 %
Acido flico 4,24 3,81 4,025 0,304 7,55 %
Riboflavina 50,04 44,4 47,22 3,98 8,44 %
0
Interpretacin de resultados: El C.V. calculado entre los resultados obtenidos y
lo declarado en frmula de composicin por el fabricante est en un rango menor
al 10 %; lo cual significa que los resultados son aceptables en un porcentaje
mayor al 90 %. Este proceso es aplicable a las Premezclas vitamnicas, no as
para las harinas de trigo que por su naturaleza no muestra resultados
54
satisfactorios para todas las vitaminas. Se deber adems notar que en este caso
el volumen de inyeccin es menor al volumen de inyeccin de una muestra de
harina.
Total de muestras trabajadas durante el ao 1999: 16

Total de procesos probados: 5
55
Ao 2000
PROCESO # 6
Muestras trabajadas: Harinas de trigo # 11 y # 12.

H #11 #12 (mg/kg)

Tiamina 12,92 14,38
Riboflavina 43,20 27,31 0
Interpretacin de resultados: Se puede notar que con la adicin de la enzima

amilasa, los valores de Acido Flico no son aceptables.
Se verific este resultado tratando nuevamente la muestra # 12 (Proceso # 6), en

las mismas condiciones anteriores, pero utilizando estndares secundarios
individuales y otra Premezcla vitamnica (B) de frmula de composicin conocida,
esto se hizo con el afn de comprobar si los estndares que se han estado
usando mantienen su eficacia, de lo cual se obtuvo los siguientes resultados:
(mg/kg) (con St. Individuales) (con Prem. Vitamnica B)

Tiamina 22,58 19,75
Riboflavina 11,19 11,04
Interpretacin de resultados: En los resultados obtenidos se aprecia que los

valores de Acido Flico siguen saliendo altos, lo que quiere decir que la amilasa
interfiere para que esto suceda; en cambio los valores para las dems vitaminas
son similares a los anteriores resultados. Adems queda comprobado que los
estndares que se usan mantienen su eficacia.
56
PROCESO # 7
Muestras trabajadas: Harinas de trigo # 12, # 13, # 14, # 15.

H #12 #13 # 14 #15 (mg/kg)

Tiamina 22,13 29,21 25,55 25,88
Nicotinamida 140,58 131,18 128,40 154,11
Acido Flico 3,35 3,46 2,71 3,88
Riboflavina 10,39 7,0 8,98 11,47
Comparacin de resultados de la muestra de harina # 12, obtenidos con los

procesos # 6 y # 7
Proceso # 6 Proceso # 7
(mg/kg) ( St. Indiv) ( Pre-vit. B)
x s C.V.
Tiamina 22,58 19,75 22,13 21,48 1,52 7,07 %
Nicotinamida 138,39 115,69 140,58 139,82 1,24 0,89 %
Riboflavina 11,19 11,04 10,39 10,87 0,42 3,91 %
Interpretacin de resultados: Se trabaj bajo las mismas condiciones

anteriores; pero con la diferencia de que no se agreg la enzima amilasa, ni se
llev a calentamiento. Podemos notar que en el caso de la Muestra # 12, los
valores de cido Flico mejoraron notablemente, si comparamos con los
resultados del proceso # 6, notamos que para las vitaminas, Tiamina,
Nicotinamida y Riboflavina los valores se mantienen, y esto lo verificamos con el
C.V. calculado entre los resultados obtenidos por los procesos # 6 y # 7, los
cuales no son mayores al 10 %. En cuanto a las Muestras # 13, 14, 15, los
resultados son tambin satisfactorios.
57
Bajo las mismas condiciones anteriores, pero variando el volumen de inyeccin
(40 ml), se trabajaron cuatro Premezclas vitamnicas.
Muestras trabajadas: Premezclas vitamnicas C, D, E, F.

(g/kg) Pre-vit. C Frm. Comp. x s C.V.

Tiamina 30,15 27,4 28,78 1,94 6,75 %
Nicotinamida 222,2 253,0 237,6 21,78 9,16 %
cido Flico 4,07 3,77 3,92 2,12 5,41 %
Riboflavina 42,58 47,9 45,24 3,76 8,31 %
(g/kg) Pre-vit. D Frm. Comp. x s C.V.

Tiamina 29,2 25,66 27,38 2,43 8,9 %
Nicotinamida 252,9 234,59 243,75 12,94 5,31 %
cido Flico 4,30 3,81 4,06 0,35 8,54 %
Riboflavina 43,7 44,40 44,05 0,49 1,12 %
(g/kg) Pre-vit. E Frm. Comp. x s C.V.

Tiamina 29,8 26,08 27,94 2,63 9,41 %
Nicotinamida 241,6 240,84 241,22 0,54 0,22 %
cido Flico 3,70 3,25 3,48 0,32 9,15 %
Riboflavina 50,4 45,58 47,99 3,40 7,10 %
(g/kg) Pre-vit. F Frm. Comp. x s C.V.

Tiamina 29,10 25,88 27,49 2,27 8,28 %
Nicotinamida 290,56 254,11 272,33 25,77 9,46 %
cido Flico 3,50 3,88 3,69 0,27 7,28 %
Riboflavina 49,23 44,47 46,85 3,36 7,18 %
Interpretacin de resultados: El C.V. calculado entre los resultados obtenidos y

la frmula de composicin es menor al 10 %. Si estos resultados los comparamos
58
con los obtenidos en la premezcla vitamnica A por el Proceso # 5, notaremos que
en ambos casos son satisfactorios; esto quiere decir que para premezclas
vitamnicas ambos procesos dan buenos resultados, no as en harinas de trigo,
debido a que por la naturaleza de la muestra y los dems aditivos aadidos, hubo
la necesidad de darles un tratamiento ms adecuado y de cambiar ciertas
condiciones de operacin para obtener cromatogramas ms limpios, es decir que
tengan la menor cantidad de picos o bandas de interferencia, apareciendo en
forma clara los correspondientes a las vitaminas extradas, y todo esto se ha
logrado con el Proceso # 7.

59
Ao 2001
PROCESO # 7
Muestras trabajadas: Harinas de trigo # 16, # 17, # 18, # 19, # 20, # 21, # 22, #
23, # 24.
H #16 #17 #18 #19 #20 #21 (mg/kg)

Tiamina 22,38 13,65 7,07 12,94 7,51 8,12
Nicotinamida 91,68 65,24 53,95 60,61 70,23 75,60
cido Flico 1,03 0,81 1,08 1,27 1,42 2,71
Riboflavina 8,66 13,45 15,74 14,62 20,10 13,82
H #22 #23 #24 (mg/kg)

Tiamina 7,44 14,58 5,26
Nicotinamida 47,15 87,52 85,16
cido Flico 2,39 2,44 3,83
Riboflavina 8,78 8,97 11,43
Interpretacin de los resultados: Podemos observar que los resultados

obtenidos se ajustan a los requerimientos, por lo que podemos decir que son
satisfactorios.

Total de procesos: 1
60
Ao 2002
PROCESO # 7
Muestras trabajadas: Harinas de trigo # 25, # 26, # 27, # 28.

H #25 #26 #27 #28 (mg/kg)

Tiamina 8,39 14,46 8,35 25,59
Nicotinamida 85,57 78,42 79,28 298,79
Acido Flico 3,72 2,97 2,51 5,50
Riboflavina 10,18 9,13 9,30 53,82
Las muestras anteriores se trabajaron nuevamente, luego de varias semanas,

aprovechando el hecho de que se trataban de muestras enviadas de una misma
industria molinera, obtenindose los siguientes resultados:
H #25 #26 #27 #28 (mg/kg)

Tiamina 7,68 13,32 9,86 27,95
Nicotinamida 87,17 81,63 82,21 290,78
Acido Flico 4,17 3,08 2,88 4,98
Riboflavina 9,31 8,35 8,96 55,37
61
De las repeticiones se obtuvieron los C.V. dando los siguientes resultados:
H #25 (mg/kg) x s C.V.

Tiamina 8,39 7,68 8,03 0,50 6,24 %
Nicotinamida 85,57 87,17 86,37 1,13 1,30 %
cido Flico 3,72 4,17 3,94 0,31 8,06 %
Riboflavina 10,18 9,31 9,74 0,61 6,31 %

Tiamina 14,46 13,32 13,89 0,80 5,80 %
Nicotinamida 78,42 81,63 80,02 2,26 2,83 %
cido Flico 2,97 3,08 3,02 0,07 2,57 %
Riboflavina 9,13 8,35 8,74 0,55 6,31 %

Tiamina 8,35 9,86 8,90 0,78 8,81 %
Nicotinamida 79,28 82,21 80,74 2,07 2,56 %
cido Flico 2,51 2,88 2,69 0,26 9,7 %
Riboflavina 9,30 8,96 9,13 0,24 2,63 %

Tiamina 25,59 27,95 26,77 1,66 6,32 %
Nicotinamida 298,79 290,78 294,78 5,66 1,92 %
cido Flico 5,50 4,98 5,24 0,36 7,01 %
Riboflavina 53,82 55,37 54,59 1,09 2,0 %

62
Ao 2003
PROCESO # 7
Muestras trabajadas: Harinas de trigo # 29, # 30.

H #29 # 30 (mg/kg)
Tiamina 7,99 15,60
cido Flico 1,94 1,07
Riboflavina 10,99 11,75
Interpretacin de los resultados: Se puede notar que los resultados obtenidos

son muy satisfactorios si se los compara con los valores mnimos que requiere la
Norma INEN # 616 para Harinas de Trigo Fortificadas.

63
TABLA DE RESULTADOS
CONDICIONES
TRATAMIENTO DE INTERPRETACIN DE
PROCESO MUESTRA FASE MOVIL DE
LA MUESTRA RESULTADOS
OPERACION
No existe registro de vitaminas.

Harina de Trigo Solucin Bicarbonato Mezcla: de dos V.I. = 5ml Los cromatogramas obtenidos no
1 #1 de Sodio 0.1M + soluciones metanlicas D = 280nm muestran una buena resolucin o
calentamiento sin de Butano sulfonato F=0,8ml/min separacin .
Premezcla enrasar. Sdico y Heptano Hay interferencia de los dems
Vitamina A,B Sulfonato Sdico. aditivos de la formula de
INICIAL composicin.
Tiempo de corrida 30 minutos.
Solucin de Mezcla: de dos V.I. =70ml Resultados fueron favorables para

2 Harina de Trigo bicarbonato de sodio soluciones metanlicas D = 280nm Tiamina, cido flico, no hay un
# 1 hasta # 7 0.1 M + ligero de Butano sulfonato F=0,8ml/min buen registro para Riboflavina,
calentamiento, Sdico y Heptano Nicotinamida.
enrasar con metanol. Sulfonato Sdico. Tiempo de corrida 25 minutos.
cido Clorhdrico 0.1 Mezcla: Buffer de V.I. = 80ml Resultados favorables para
N +autoclave x 30 PO4H2Na 0.02 M D = 280nm Nicotinamida y Riboflavina.
3 Harina de Trigo min. + agua destilada llevado a pH 2.8 con F=0,8ml/min Tiempo de corrida 25 minutos.
#1 + NaOH 1 N + cido fosfrico +
enrasar con fase Acetonitrilo: (90:10)
mvil.
64
................... CONTINUACIN TABLA DE RESULTADOS
TRATAMIENTO CONDICIONES DE INTERPRETACIN DE

PROCESO MUESTRA DE LA FASEMOVIL
MUESTRA OPERACION RESULTADOS
cido Mezcla: Buffer de V.I. = 80ml Resultados favorables para

Clorhdrico 0.1 PO4H2Na 0.02 M D = 280nm Tiamina y cido flico.
4 Harina de N + llevado a pH 2.8 con F=0,8ml/min Tiempo de corrida 25 minutos.
Trigo #1 calentamiento a cido fosfrico +
60 oC +agua Acetonitrilo: (90:10).
destilada +
NaOH 1 N +
enrasar con
fase mvil.
65

Mezcla: Buffer de V.I. =90ml Resultados favorables para

5A Harina de Agua destilada PO4H2Na 0.02 M D = 280nm Tiamina, Nicotinamida y cido
Trigo + NaOH 1 N + llevado a pH 2.8 con F=0,8ml/min flico.
#8 cido actico 2 cido fosfrico + Tiempo de corrida 25 minutos.
% Acetonitrilo: (90:10).
+ calentamiento
80 oC +
Harina de enrasar con Mezcla: Buffer de Resultados favorables para
Trigo fase mvil. PO4H2Na 0.026 M Tiamina, Nicotinamida y
# 9 y # 10. llevado a pH 2.8 con V.I. =5ml Riboflavina.
cido fosfrico + D = 280nm Tiempo de corrida12 minutos.
5B Acetonitrilo F=0,8ml/min
(8812).
Resultados favorables para
Agua destilada Tiamina, Nicotinamida, cido
Premezcla + NaOH 1 N + Mezcla: Buffer de flico, Riboflavina. El C.V.
Vitamnica cido actico 2 PO4H2Na 0.026 M calculado entre los resultados
A % llevado a pH 2.8 con obtenidos y la frmula de
+ calentamiento cido fosfrico + composicin es menor al 10 %,lo
80 oC + Acetonitrilo que significa que es aceptable.
enrasar con (8812). Tiempo de corrida 12 minutos.
fase mvil.
66

Harina de Agua destilada Mezcla: Buffer de V.I. =96 ml Se observa que mejoran los
Trigo + NaOH 1 N + PO4H2Na 0.024 M D = 280nm valores obtenidos para Tiamina,
6 # 11 y # 12 cido actico 2 llevado a pH 2.8 con F=0,8ml/min Nicotinamida y Riboflavina. No
% cido fosfrico + son aceptables los valores para
+ calentamiento Acetonitrilo cido flico.
70 oC + (8812). Tiempo de corrida 10 minutos.
enzima amilasa
+enrasar con
fase mvil.
67
TRATAMIEN CONDICIO-
PRO-
MUESTRA TO DE LA FASEMOVIL NES DE INTERPRETACIN DE RESULTADOS
CESO
MUESTRA OPERACION
Resultados favorables para Tiamina, Nicotinamida, cido flico,

Riboflavina.
Harina de Trigo Repitiendo la muestra # 12 con este proceso y calculando el C.V entre
los resultados obtenidos por los procesos 6 y 7, se observa que es
# 12 hasta #
menor al 10 % para Tiamina, Nicotinamida y Riboflavina, lo que
15 significa que es aceptable.
Tiempo de corrida 12 minutos.
Premezcla Agua Mezcla:
Vitamnica C, destilada + Buffer de Resultados favorables para Tiamina, Nicotinamida, cido flico,
D, E, F. NaOH 1 N PO4H2Na V.I. =96 ml Riboflavina.
+ cido 0.024M D = 280nm El C.V. calculado entre los resultados obtenidos y frmula de
actico 2 llevado a F=1,0ml/mi composicin es menor al 10 % lo que significa que es aceptable, por lo
7 % pH 2.8 con n tanto el proceso da resultados satisfactorios.
+ enrasar cido
Harina de Trigo con fase fosfrico +
Resultados favorables para Tiamina, Nicotinamida, cido flico,
#16 hasta # 24. mvil. Acetonitrilo
Riboflavina.
(8812).
Harina de Trigo El C.V. calculado de la repeticin de estas 4 muestras
#25 hasta #28. Es menor al 10 %, por lo tanto el proceso es aceptable.
Los resultados obtenidos de estas dos ltimas muestras que llegaron en

FINAL Harina de Trigo el ao 2003 para la obtencin del Registro Sanitario, demuestran una
#29 y # 30 vez ms que el proceso es aceptable ya que los valores encontrados de
las 4 vitaminas aadidas cumplen con los requerimientos mnimos de la
Norma INEN 616.
TOTAL DE MUESTRAS ANALIZADAS = 47
TOTAL DE PROCESOS ESTUDIADOS = 7
68
CAPITULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
1. Se puede concluir que se ha logrado unificar mediante un solo proceso la

determinacin cuantitativa de las cuatro vitaminas hidrosolubles aadidas en
harinas de trigo para ser fortificadas, al igual que para la determinacin de
vitaminas en premezcla vitamnica, y el proceso # 7 que ha quedado descrito
en este trabajo, es el que resulta ms apropiado. Mientras que en las
bibliografas se describen diferentes mtodos para la determinacin de cada
vitamina.
2. A pesar de que los valores reales de las vitaminas o de la premezcla aadida

en las harinas de trigo, no han sido suministrados por los fabricantes para de
acuerdo a esto obtener otro tipo de informacin como sera conocer si los
resultados encontrados mediante el proceso descrito estn dentro de las
especificaciones del fabricante. Nos sirve de gua entonces los valores
mnimos requeridos en mg de vitaminas por cada kg de harina de trigo segn
Norma INEN 616, y el Coeficiente de Variacin (C.V.%) calculado entre los
resultados obtenidos luego de repetir el anlisis de varias muestras, es menor
al 10 %, lo que significa que es aceptable.
3. Por otro lado, el realizar determinaciones de vitaminas en las premezclas

vitamnicas, ha sido de gran valor. En estos casos s se conocen los valores
reales de cada una de las Vitaminas , y el resultado de estas cumplen con las
especificaciones descritas por los fabricantes y los C.V. % calculados entre los
resultados obtenidos y la frmula de composicin respectiva, es menor
tambin al 10 %.
69
4. Los datos proporcionados al trabajar con el proceso # 7 indican que: El cido
Actico al 2 % es el apropiado para extraer de las harinas las vitaminas
aadidas. No se necesita calor y uso de enzimas para su extraccin.
5. La utilizacin de Hidrxido de Sodio 1 N, ayuda a mejorar la disolucin de las

vitaminas, y en especial del cido flico.
6. La concentracin del Buffer (Fosfato cido de Sodio 0,024 M a pH 2.8) es la

ideal para obtener una buena separacin de las Vitaminas por la disminucin
de la viscosidad, lo que origina una menor presin sobre la columna y por lo
tanto una mejor separacin de los componentes de la muestra.
7. De igual manera, la concentracin de la Fase Mvil (88:12) Buffer:Acetonitrilo,

contribuyen a lograr una buena separacin.
8. En el proceso # 7, el tiempo de corrida es de 10 minutos, lo cual es importante

porque nos permite reproducir los resultados en menor tiempo, utilizando
menor cantidad de Fase Mvil que cuando los tiempos de corrida son ms
largos.
70
5.2 RECOMENDACIONES
1. Una columna C18 de material de slica de 25 cm para cromatografa en Fase

reversa puede ser usada para la separacin de las Vitaminas. Sin embargo
para acortar el tiempo de corrida podra emplearse una columna ms pequea
de 15 cm, con lo que se estara disminuyendo tambin la cantidad de Fase
Mvil empleada, siendo esto beneficioso por los elevados costos que tienen
estos solventes.
2. Almacenar el Buffer preparado hasta 3 das en refrigeracin y filtrar por filtro

de membrana al vaco al momento de su uso.
3. El agua destilada deber estar filtrada por filtro de membrana al vaco, de igual
manera al momento de su uso o preferentemente utilizar agua Tipo I.
4. Se debe tener presente las propiedades fsicas y qumicas de los estndares,

para evitar su degradacin por mal almacenamiento de los mismos, lo cual
merma su tiempo de vida til, y su potencia. Esto s es un problema ya que se
pueden alterar los tiempos de retencin o no registrarse nada en el
cromatograma y los resultados obtenidos seran errneos.
5. Es recomendable utilizar un flujo de la Fase mvil de 1ml/min, para lograr una

mejor y ms rpida estabilizacin del equipo.
6. Se puede probar el proceso, trabajando con Gradiente; es decir, cambiando en

diferentes tiempos durante la corrida, la concentracin de la Fase Mvil, en
lugar del sistema Isocrtico que hemos empleado como Fase Mvil Buffer:
Acetonitrilo (88:12); si se quiere obtener cromatogramas con mejor separacin
en los picos; pero para esto se debern realizar varias pruebas hasta
establecer el Sistema de Gradiente adecuado.
7. Una vez que he finalizado el estudio de este Proceso, la validacin del mismo
sera beneficioso, para que este sea empleado como el Mtodo de Anlisis en
71
el seguimiento de la calidad de las Harinas de Trigo Fortificadas realizadas en
el Laboratorio de Bromatologa del Departamento de Registro y Control
Sanitario de Alimentos procesados del Instituto Nacional de Higiene de la
ciudad de Guayaquil; a pesar de los elevados costos que esto implica.
72
ANEXOS
NOMENCLATURA BASICA
APLICADA A CROMATOGRAFIA LIQUIDA
Anlisis isocrtico: Un procedimiento en el cual la composicin de la fase mvil

se mantiene constante durante el proceso de elucin.
Bomba: Un aparato designado a repartir la fase mvil a un flujo controlado en el

sistema de separacin.
Columna: El tubo y la fase estacionaria contenida en su interior, por su seno pasa

la fase mvil.
Cromatgrafo: aparato que sirve para realizar cromatografas.
Cromatograma: Grfico o representacin de la respuesta del detector. Comienza

en el momento en que se inyecta la solucin ensayo.
Detector: Un aparato que mide el cambio en la composicin del eluente por una
medida fsica o propiedad qumica.
Fase estacionaria: Es una de las dos fases que forman un sistema

cromatogrfico. En Cromatografa Lquida est constituida por las columnas y sus
materiales de relleno.
Fase mvil: Es un fluido, el cual se filtra de un lado a otro o delante del lecho
estacionario, en una direccin definida. En el caso de Cromatografa Lquida este
es el lquido.
73
Fase normal: Un procedimiento de elucin en el cual la fase estacionaria es ms
polar que la fase mvil.
Fase reversa: Un procedimiento de elucin usado en Cromatografa Lquida en el
cual la fase mvil es significativamente ms polar que la fase estacionaria.
Flujo: Volumen de fase mvil que pasa a travs de la columna en una unidad de
tiempo.
Gradiente de elucin: Procedimiento en el cual la composicin de la fase mvil

es cambiada continuamente o por pasos durante el proceso de elucin.
Lnea de base: La porcin que registra el cromatograma como respuesta al

detector cuando solo la fase mvil emerge de la columna.
Pico: La porcin que registra un cromatograma diferencial como respuesta del

detector cuando un componente simple es eluido desde la columna.
Resolucin: Magnitud o distincin de separacin mayor o menor que puede

apreciarse entre dos picos.
Tiempo de retencin: Tiempo que tarda en eluir una determinada banda de la

columna.
Zona: Una regin en el lecho cromatogrfico donde estn localizados uno o ms

componentes de la muestra. El trmino banda puede tambin ser usado.
TERMINOS ESTADSTICOS EMPLEADOS
s.100 x = media aritmtica

C.V .(%) = s = desviacin estndar
x
El coeficiente de variacin C.V. est definido como desviacin estndar en

porcentaje, referida al valor medio. Este indica la desviacin aleatoria, quiere
74
decir, hasta qu punto los valores medios individuales se acerca el uno con
respecto al otro.
SISTEMA HPLC MODULAR LaChrom de Merck-Hitachi
75
BOMBA DE VACIO, PARA FILTRAR SOLVENTES
FILTRACIN DE MUESTRAS A TRAVES DE FILTROS DE
PROLIPOPILENO DE 0,2 m
76
AUTOMUESTREADOR DEL EQUIPO, COLOCACION DE
MUESTRAS
INTEGRADOR. REGISTRO DE RESULTADOS
77
BIBLIOGRAFIA
1. Ekharde Ziegler y L. J Filer, Jr., ILSI (International Life Sciences Institute),

Conocimientos actuales sobre NUTRICION, Publicacin Cientfica No 565,
7ma Edicin, OPS Washington, D. C. E.U.A, p. 170 225.
2. Firk R. S., Sawyer R., Egan H., Composicin y Anlisis de Alimentos,
Pearson, Novena Edicin en Ingls (Segunda Edicin en Espaol), Compaia
Editorial Continental, S. A. DE C. V. Mexico, 1999, p. 59.
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for Vitamins in Food/Pharma Premixes, F. Hoffmann-La Roche Ltd, CH-4002
Basel (Switzerland),1991.
4. Horwitz William, The Scientific Association Dedicated to Analytical Excellence,
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Additives; Natural Contaminants, 17th Edition, E.U.A, 2000.
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6. Microsoft Encarta, Biblioteca de consulta 2003, Microsoft Corporation, 1993
2002.
7. Miquelena Iraida y Olivo Esther, Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel,
Curso, Bases de la Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia, Caracas
Venezuela, 1996, p. 3 28.
8. Purifluidos cia. Ltda, Tercer Curso de HPLC Nivel Bsico, Quito Ecuador, 3
y 4 de Mayo del 2001, p. 3 18.
9. Purifluidos Cia Ltda, Primer Curso de HPLC Nivel Intermedio, Quito
Ecuador, 5 y 6 de Mayo del 2001.
10. Purifluidos Cia. Ltda, Segundo Curso Bsico de Cromatografa Lquida Alta
Resolucin HPLC, Quito - Ecuador, 9 y 10 de Diciembre de 1999, p. 7 10.
11. Roche USAID, OMNI (Oportunides for Micronutrient Interventions),
Fortificacin de Alimentos: Harina de Trigo.
12. Roche USAID, OMNI (Oportunides for Micronutrient Interventions),
Fortification Basics: Vitamin Stability During Processing and Storage.
13. Solrzano Luca, Instituto Nacional de Pesca, Boletn Cientfico y Tcnico:
Mtodos de Anlisis Qumicos utilizados en el curso Latinoamericano de Post-
78
Grado. Instrumentacin y Anlisis Qumico de Agentes Contaminantes en el
Mar, Guayaquil Ecuador, 1983. Vol. VII No. 1, p. 69 70.
14. www.biopsicologia.net/fichas/pag-1025.html.
15. www.icfes.gov.co/revistas/recolqui/972601_7.HTM Revista Colombiana de
Qumica Volumen 26, No. 1 de 1997.
16. www.sagpya.mecon.gov.ar/alimentos/inicio.htm Revista Alimentos Argentinos No.
14, p. 2,4,5. Direccin de Industria Alimentaria S.A.G.P. y A.
17. www.zonadiet.com/nutricion/hidrosol.htm
79

Determinación de VITAMINA en Harina de Trigo Por HPLC

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Determinación de VITAMINA en Harina de Trigo Por HPLC

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CAPITULO I

1.1 BASES DE LA CROMATOGRAFIA LIQUIDA

Desde comienzos de los aos 70 la Cromatografa Lquida ha tenido una

En un principio HPLC significaba HIGH PRESSURE LIQUID

Hoy, en el mundo especializado, se entiende por HPLC ms bien como HIGH

1.1.1 DEFINICION DE CROMATOGRAFIA

La Cromatografa Lquida es un mtodo de anlisis qumico para la separacin

1.1.3 SISTEMA TIPICO DE UN CROMATOGRAFO LIQUIDO

Reservorios de solventes (Fase mvil)

Se consideran bsicamente dos tipos de bombas:

Cuando la muestra es inyectada es forzada o llevada a travs de la columna y se

Los detectores pueden clasificarse en generales y selectivos. Los detectores

La separacin de los componentes de la muestra se va a llevar a efecto en la

Cuando la muestra y la fase mvil son forzadas a atravesar la fase estacionaria,

Esta separacin de los componentes se logra en todo lo que es ZONAS, las

Es necesario diferenciar el mtodo por el cual la muestra es introducida:

FIG. 2 SEPARACIN DE LOS COMPONENTES DE UNA MEZCLA

SEPARACION POR TAMAO

SEPARACION POR AFINIDAD

La HPLC isocrtica puede separar un nmero limitado de picos, entre 10 y 12.

Existen bsicamente dos tipos de formadores de gradientes: los de baja presin y

1. Separaciones rpidas: se pueden obtener separaciones en trminos de

La identificacin de cada seal se realiza comparando los tiempos de retencin

1. No existe detector universal y sensible:

Difcil anlisis cualitativo: la cromatografa lquida es una tcnica de separacin y

1.1.7 TIPOS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA

Existen cinco formas de realizar la Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia, cada

Con un cambio de columna se puede utilizar cada uno de ellos.

Cromatografa Lquido Lquido ( C.L.L.) o de Particin.

En esta cromatografa, las molculas de soluto van a distribuirse entre dos

Cromatografa Lquido Slido (C.L.S.) o de Adsorcin.

El mecanismo de separacin est basado en la competencia que existe entre las

Es as como, variando la naturaleza de los grupos funcionales de la fase

La primera se basa en el principio de que la fase estacionaria es una sustancia de

En la segunda la fase estacionaria es no polar con grupos octilo (-C8H17),

La Fase Reversa ms comn utilizada en la industria farmacutica es -C18.

Aqu se emplean materiales de porosidad controlada, es decir que la separacin

Cromatografa de Intercambio Inico

La separacin por intercambio inico, se basa en el empleo de rellenos en los

1.1.8 MATERIALES DE EMPAQUE Y COLUMNAS

La columna cromatogrfica analtica clsica en HPLC est formada por un tubo

Estructura, forma y tamao son tres caractersticas importantes en las partculas

Los polmeros son ms estables pero poseen compatibilidad limitada con

El carbn es el material polimrico derivado, con alta estabilidad al pH y con alta

Como alternativa se puede utilizar Almina, la cual tiene mejor estabilidad al pH

Existe en la actualidad columnas hbridas que ofrecen mayor resistencia

Respecto a la forma y tamao de la partcula se puede decir que los primeros

PARTICULAS IRREGULARES PARTICULAS ESFERICAS

La partcula esfrica permite mejor empaquetamiento y as mayor eficiencia y as

La porosidad: es la relacin entre el volumen interno de los poros y el volumen

El dimetro del poro determina el rea superficial (que determina la capacidad de

El analito tendr completo acceso a la superficie interna del poro si el tamao de

Las columnas pueden clasificarse segn la polaridad de su empaque en Fase

En las columnas de intercambio inico clsicas, el empaque es una resina a la

Existen las llamadas columnas especiales para anlisis de carbohidratos, cidos

La fase mvil o solvente, es un factor muy importante en Cromatografa Lquida.

c. No debe degradar o disolver la fase estacionaria.

d. Debe ser compatible con el tipo de detector utilizado. Cuando se utiliza el

f. Debe ser de alta pureza o grado cromatogrfico, en especial al realizar anlisis

g. Deben estar libres de partculas, por lo que se aconseja filtrarlos a travs de

h. El agua destilada debe ser de alta pureza o grado cromatogrfico.

j. Es mejor utilizar solventes libres de preservativos., por cuanto estos pueden

k. Es importante tomar en cuenta el costo y la toxicidad del solvente.