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Resolucin (HPLC)
Fundamentos
La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de los componentes de una mezcla
debido a la influencia de dos efectos contrapuestos:
a) Retencin de los componentes de la mezcla por parte de la fase estacionaria (FE, slido o lquido
anclado a un soporte slido).
b) Desplazamiento de los mismos componentes con la fase mvil (FM) que fluye (lquida o gaseosa).
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Clasificacin
Segn el estado FM
de las fases:
Gas Lquido Slido
Gas
FE Lquido
GC LC
Slido
Tiempo
Cromatograma
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Magister de Plantas Medicinales
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Cromatograma
tR : Tiempo de retencin
t0 : Tiempo muerto
Intensidad de la seal de deteccin
A: rea de pico
tR
h: Altura de pico
t0
h
A
Tiempo
Cromatografa lquida
en columna Disminucin del tamao
de partcula FE
Equipamiento capaz de
generar y tolerar
altas presiones
Sistemas de deteccin
ms sensibles
Cromatografa lquida
de alta resolucin (HPLC)
Mayor grado de separacin (mayor resolucin, HP)
Menores tiempos de anlisis
3
Hplc - ventajas y limitaciones
+
Alta capacidad de separacin (anlisis multicomponente)
Alta resolucin / rapidez
Aplicaciones cuantitativas reproducibles, gran sensibilidad
Requiere poca cantidad de muestra
Versatilidad
Automatizacin
-
Posibilidad de escala preparativa
Costo
Gran consumo de solventes
Personal capacitado
Identificaciones no precisas
Detectores
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1. Sistema
cromatogrfico
y Fase Mvil
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1. Sistema Cromatogrfico y FM
Equipamiento cromatogrfico
Reservorio de FM
Opcional
Sistema de gradiente a baja presin
Desgasificador en lnea
Bomba (flujo / presin)
Inyector (manual / automtico)
Columna (Opcional: horno)
Detector/es
Descarte
Sistema
Inyector
de
FM bombeo
Pre-mezclada o no
SV miscibles entre si, poco
viscosos
Filtrada y desgasificada
Compatible con detector
SV calidad HPLC
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Fase Mvil (FM)
Debe disolver la muestra
# No degradar ni disolver a la fase estacionaria
# Baja viscosidad y baja reactividad
# Compatible con el detector
# Alto grado de pureza (agua y SV calidad HPLC)
# Seguridad
Preparacin
# Ojo la miscibilidad!
Desgasificacin de la FM
Membrana filtrante
Vaco
(0,45 m poro)
Vaco
Ultrasonido
6
Equipamiento Bsico Sistema de
deteccin y
registro
Sistema de
gradiente
(opcional)
Desgasificador
en lnea
(opcional)
Descarte
Inyector
FM Sistema
de bombeo
Una o ms bombas
Desgasificador
en lnea
Cmara
mezcladora
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Equipamiento Bsico Sistema de
deteccin y
registro
Descarte
Inyector
Manual o automtico
FM Sistema Volumen fijo (loop) o variable
(jeringa)
de
bombeo
Inyector Horno
(opcional)
Columna
# Tubo de material inerte, capaz de resistir
altas presiones
# Longitud entre 3 y 50 cm
# Disco de tefln o metal poroso en los
extremos
# Se acondiciona antes y despus del
anlisis
FM Sistema # Se guarda llena de SV, segn
instrucciones
de bombeo # Bitcora u hoja de seguimiento
# Relleno: slido particulado (3 10 m),
puede ser polar (fase normal) o no polar
(fase reversa)
8
Equipamiento Bsico
Sistema de
deteccin y registro
Detector UV:
Espectrofotomtrico # Rango
Inyector Arreglo de fotodiodos # Sensibilidad
FM Sistema Detector de fluorescencia
# Ruido
Espectrmetro de masa
de bombeo Otros: # Linealidad
Electroqumico # Especificidad
ndice de refraccin
FE
Fase Normal
Silica gel: -Si-OH
Tipo ciano: -Si-CH2CH2CH2CN
Tipo amina: -Si-CH2CH2CH2NH2
Tipo diol: -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2OH
Hexano:MeOH
98:2
95:5
Polaridad
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Fase Reversa
# Fase estacionaria de baja polaridad (ej. C18, C8)
# Fase mvil polar (agua -buffers, cidos-, MeOH, AcCN)
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C18 (ODS)
Si -O-Si
C8 (octil)
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3
C4 (butil)
C18 (ODS) C8 (OS) Fenil, etc.
Si Si
fuerte medio
Analito Analito
H2O H2O H2O H2O
H2O H2O H2O H2O
H2O H2O
H2O H2O H2O H2O
Fase Reversa
FE RP-18
FM MeOH:Agua
MeOH:Agua
60:40 Polaridad
70:30
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Detectores de absorcin UV-Vis
Detector UV-Vis
Muestra de
concentracin (C)
I0 I
Simboliza un
T= I / I0 A=-log(T)
fotodiodo
A = -bC = log (I / I0)
Muestra de
concentracin (C)
I0 I
Simboliza un
T= I / I0 A=-log(T)
fotodiodo
A = -bC = log (I / I0)
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Detectores de absorcin UV-Vis
Detector UV-Vis
Cromatograma a 1
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Detectores de
absorcin UV-Vis
Arreglo de diodos
Detector Universal
Cuantificacin + Identificacin
13
LC
3. Modo de
Operacin
14
3. Modo de Operacin
Flujo (ml/min)
Temperatura (si el equipo cuenta con horno)
Modo isocrtico o gradiente (si se tiene sistema de gradiente)
MeOH:H2O (6:4)
Modo Isocrtico:
Picos con >> tr
composicin
constante de la FM
MeOH:H2O (8:2)
3. Modo de Operacin
Modo Gradiente
Concentracin de MeOH en la FM
95%
Separacin
ptima
30%
Columna: C18
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4. Muestras
a inyectar
4. Muestras a inyectar
Siempre se deben filtrar las muestras antes de inyectarlas (se
utilizan filtros de membrana de nylon o celulosa de 0.45 - 0.2
m de tamao de poro).
En el caso de no poder filtrar (ej. pequeo volumen de
muestra), se debe centrifugar.
Conviene prepararlas en FM o SV de menor fuerza
Desproteinizacin
# Precipitacin
# Adicin de solventes orgnicos (ej. acetonitrilo)
# Adicin de cidos (ej. TFA, perclrico)
# Adicin de metales pesados o sales neutras
# Ultrafiltracin
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Extraccin en fase slida
(1) (2)
(3) (4)
Acondicionamiento del Adicin de la
Lavado Elucin
cartucho muestra
Solvente de
menor fuerza de
elucin
Solvente de
mayor fuerza de
elucin
Compuesto de
inters
Otros compuestos
(matriz,
interferencias)
Extraccin lquido-lquido
Agitacin
Centrifug.
Otros pre-tratamientos
# Dilucin # Liofilizacin
# Destilacin # Evaporacin concentracin
# Extraccin en Soxhlet # Etc, etc, etc.
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Objetivos del pre-tratamiento
# Para mejorar la exactitud de la medida
# Para mejorar la sensibilidad y selectividad (especificidad)
# Para proteger y prevenir el deterioro de la columna y el equipo
No se deben inyectar:
Sustancias insolubles (ej. partculas, precipitados)
Sustancias que podran precipitar en las condiciones del mtodo
Sustancias que se adsorberan irreversiblemente a la columna
Sustancias capaces de disolver o reaccionar qumicamente con el relleno
de la columna
Sustancias agresivas para cualquier parte del equipo
5. Aptitud
del Sistema
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5. Aptitud del Sistema (System suitability)
Se realiza para verificar que la resolucin y la reproducibilidad del sistema cromatogrfico
son adecuadas para el anlisis farmacopeico a realizar.
El ensayo considera que el equipamiento, el software, el mtodo analtico y las muestras
constituyen un sistema integral que se evala como tal.
La eficiencia del sistema se evala mediante el parmetro resolucin (Rs, debe haber al menos dos picos), o menos
comnmente mediante el clculo del nmero de platos tericos (N). Ambos parmetros deben superar un cierto valor
mnimo aceptable.
La precisin del sistema se evala mediante el coeficiente de variacin (CV) entre los valores de rea obtenidos por
inyecciones repetidas de una misma solucin de referencia
La asimetra del pico se evala mediante el clculo del factor de asimetra (As), y es importante ya que a mayor asimetra
de pico, mayor imprecisin en el valor de rea obtenido por integracin.
En el captulo general de Cromatografa 621, se establecen los cambios que pueden realizarse para lograr cumplir con este test.
Si con eso no fuera suficiente VALIDACIN
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2. Factores Extracolumnares
Volumen de tuberas inyector-columna y columna-celda del detector
Volumen de inyeccin
Detector: volumen y velocidad de respuesta
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Picos asimtricos o con cola (tailing)
Posibles causas de asimetra:
Efectos extracolumnares
Sobrecarga de la columna
Mecanismos mixtos de
retencin
Sitios superficiales
heterogneos
Sistemas no buffereados
As = a+b = W0,05
2a 2a
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2
tR
= 5, 54
W1 / 2
H
W1/2 2
H1/2 tR * H
=2
W Area
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Equivalencias para el clculo de N
Resolucin (RS)
tR1 tR2
tR 2 t R1
RS =
1
(W1 W2 )
2
W1 W2
21
Para lograr una separacin completa...
(tR2 - tR1) (tR2 - tR1)
W1 W2 W1 W2
tR2 - tR1 = W1 = W2 tR2 - tR1 = W1 = W2
RS = 1 RS = 1
Tringulos, RS = 1 para Gaussianas, RS > 1.5 para
separacin completa separacin completa
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Optimizacin de la separacin
1 2
La resolucin es una funcin del =
1 +
factor de separacin, el nmero de 2 1 2
platos tericos y el factor de
1 2
capacidad. =
4 2 + 1
Ideal 3 < k < 10
2.0
Efecto sobre la Rs
0.8
0.6 1.0
0.4
0.2
0.0 0.0
0 5 10 15 20 0 1.104 2.104 3.104
Factor de capacidad (k) N de platos tericos (N)
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Optimizacin de la separacin
Cromatograma original
6. Anlisis cuali
y cuantitativo
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6. Anlisis cuali y cuantitativo
Anlisis
# Identificacin en base al tiempo de retencin
(mejor en mltiples sistemas: columnas,
cualitativo detectores)
# Comparacin de espectros (UV, MS)
cuantitativo
2. Inyeccin de la muestra
3. Separacin cromatogrfica
A. Normalizacin interna 4. Deteccin
B. Estndar externo
C. Estndar interno 5. Integracin de la seal
D. Estndar agregado 6. Clculo de la concentracin de analito
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Fundamentos
Los compuestos orgnicos en la muestra se separan debido a diferencias en
su comportamiento de reparto entre el gas portador (fase mvil, no
interacta con la muestra, solo la lleva) y la fase estacionaria lquida (GLC,
gas-liquid cromatography).
En el caso de GSC (gas-solid cromatography), la separacin es por adsorcin
entre la FM y la FE (menos comn).
Cundo se aplica?
Es la tcnica a elegir para la separacin de compuestos orgnicos e
inorgnicos trmicamente estables y voltiles
Cromatgrafos de gases
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En la cromatografa de gases, los componentes de una muestra vaporizada se separan al ser
distribuidos entre una fase mvil gaseosa y una fase estacionaria lquida o slida retenida en una
columna.
Al realizar una separacin por cromatografa de gases, la muestra es vaporizada e inyectada en la
parte superior de una columna cromatogrfica.
La elucin ocurre por el flujo de una fase mvil inerte gaseosa.
En contraste con la mayora de los tipos de cromatografa, la fase mvil no interacta con las
molculas del analito.
La nica funcin de la fase mvil es transportar al analito a travs de la columna.
Existen dos tipos de CG: cromatografa gas-lquido y cromatografa gas-slido.
La cromatografa gas-lquido est basada en la particin del analito entre una fase mvil gaseosa y una fase
lquida inmovilizada en la superficie de un empaque slido inerte o en las paredes del tubo capilar
La cromatografa gas-slido se basa en una fase estacionaria slida en la cual la retencin de los analitos
ocurre debido a una adsorcin fsica
Control de
temperatura
Control de
presin
FM
Gas inerte: Ar,
He, N2
Secos y alta
pureza
Compatibles
con el detector
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Fase mvil (gas portador)
Ms comunes: He, Ar, y N2 (por ser qumicamente inertes frente a la muestra y la fase
estacionaria).
Los gases deben estar secos y libres de oxgeno
(calidad cromatogrfica: pureza > 99,995%, con <0,5 ppm O2).
La eleccin del gas portador suele estar determinada por el detector a utilizar.
El gas es precalentado y filtrado antes de ingresar al sistema, pasando primero por la
cmara de inyeccin
Flujos tpicos:
Columna empaquetada: 25-150 ml/min.
Columna capilar: 1-25 ml/min
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Equipamiento bsico en CG Sistema de
deteccin y
registro
Control de
temperatura
Control de
presin
Flujo constante del
gas portador
FM
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Control de
Inyector temperatura
Directa (columnas empacadas)
Split (columnas capilares)
Splitless (capilares, non-Split mode)
On-column
Control de
presin
FM
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Sistema de inyeccin
Sistema de inyeccin
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Sistema de inyeccin
Directa
Inyecciones por vaporizacin: el gas portador se introduce en la
(columnas empacadas)
columna a travs del inyector, el cual est dentro de un bloque metlico
Split que se calienta. All la muestra inyectada se vaporiza, se mezcla con el gas
(columnas capilares) portador, y se transfiere a la columna.
Requiere un sistema de inyeccin especial para guiar la aguja dentro de la columna (id < 0,3 mm), como as tambin
una jeringa especial. Es el mtodo de eleccin para muestras lbiles, que se degradaran a la temperatura del inyector
Control de
temperatura
Columna
Empacadas
(menos usadas, se rellenan
con FE slida o lquida)
Control de Capilares
(suelen ser tubulares
presin abiertas, sin restriccin para
el flujo, impregnadas con
distintas FE lquidas)
FM
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Columnas
cromatogrficas
empacadas
Columnas
cromatogrficas
capilares
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Alcaloides, derivados de
Trifluoropropilmetil polisiloxano (50%
Moderadamente polar OV-210 275 aminocidos, drogas, compuestos
trifluoropropil, 50% metil)
halogenados, cetonas
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Efecto de la
longitud de la
columna
Horno y control
de temperatura
El horno se debe poder
calentar y enfriar rpidamente
El programador de temperatura
permite trabajar en forma isotrmica
Control de o gradiente (solucin para muestras cuyos
componentes poseen Teb muy diferentes)
presin
FM
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Modo isotrmico
La temperatura ptima es aproximadamente el punto medio de la gama de ebullicin de la
muestra.
Este mtodo funciona bien cuando el intervalo de temperaturas de ebullicin de la muestra es
estrecho.
Para una muestra conteniendo compuestos con puntos de ebullicin diferentes, si se trabaja a
temperaturas:
Bajas: las fracciones de bajo punto de ebullicin se resuelven bien, pero las fracciones de alto
punto de ebullicin son lentos para eluir (bandas ensanchadas, >>tr)
Altas: los componentes de mayor punto de ebullicin se resuelven bien (picos afilados ) pero
los de menor punto de ebullicin salen con el frente, o a tr tan << que no logran separarse.
gradiente 1
2
3 5
4 6
1
2
3
4
5
6
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Equipamiento bsico en CG Sistema de
deteccin y
registro
Los detectores
ms comunes son
los de Conductividad
Trmica (TCD) y
Ionizacin por Llama
Control de
temperatura (FID)
Control de
presin
FM
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Sistemas de deteccin
Dispositivo que proporciona una medicin cuantitativa de los componentes de la mezcla que eluyen
con el gas portador.
En teora, cualquier propiedad de la mezcla gaseosa que sea diferente respecto al gas portador se
puede utilizar como un mtodo de deteccin.
Caractersticas ideales
Sensibilidad elevada
Bajo nivel de ruido
Respuesta lineal en un amplio rango dinmico
Tiempo de respuesta corto
Buena respuesta para toda clase de compuestos orgnicos (no-especfico)
Insensibilidad a las variaciones de flujo y temperatura
Estabilidad y robustez
Simplicidad en su operacin
Tcnica no destructiva
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Tipos de detectores
Los detectores ms comunes son los de Conductividad Trmica (TCD) y Ionizacin por Llama (FID)
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Detector de conductividad
trmica (TCD)
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Detector de ionizacin por llama (FID)
Es el ms ampliamente utilizado.
Al salir de la columna, la muestra se hace pasar por una llama
de aire-H2 donde sufre pirlisis o descomposicin qumica por
calentamiento intenso.
Esto genera e- y cationes orgnicos (CHO+). La aplicacin de un
pot ~ 300 voltios a travs de la llama crea una pequea
corriente (10-9 - 10-12 A), la que amplificada proporciona una
seal analtica til.
Ventajas: no se ve afectado por el flujo, los gases no
combustibles y agua, por lo que posee alta sensibilidad y bajo
ruido. La unidad es a la vez fiable y relativamente fcil de usar.
Sin embargo, esta tcnica requiere gas inflamable (es insensible
a los gases no combustibles como H2O, CO2, SO2 y NOx) y
tambin destruye la muestra.
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