Brandon Steven Caballero Sandoval Microbiologa General

Q.F.B. 4 Rosa Salgado Brito

Fundamentos de la tincin de Gram

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado

en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobretodo en muestras clnicas.
Debe su nombre al bacterilogo danes Christian Gram, que desarrollo la tcnica en
1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para
poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana,
considerndolo bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color
morado, y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o
grosella.

La tincin de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas,
tamaos, morfologas y reaccin Gram (color). A nivel del laboratorio es til como test
para un rpido diagnostico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras
como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la
muestra clnica. Las bacterias se tien gram positivas (+), gram negativas (-) o no se
tien debido a sus diferencias en la composicin de su pared y arquitectura celular.

Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de pptidoglucano y gran
cantidad de cidos teicicos que no son afectados por la decoloracin con
alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y
visualizndose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro,
dependiendo de si la naturaleza de su pared celular est intacta o daada (por
tratamientos antibiticos, edad celular.).
Las bacterias gram (-) tienen en su pared celular una delgada capa de
pptidoglucano ligada a una membrana externa por molculas de
lipopolisacridos. Esta membrana externa es daada por el alcohol y/o
acetona de la decoloracin, permitiendo que el primer colorante acomplejado
con iodo escape y sea reemplazado por el contra-colorante.
Clsicamente los reactivos utilizados para la realizacin de la tincin de gram
han sido el cristal violeta como colorante inicial, la solucin de lugol para
acomplejar a este, el alcohol y/o acetona para la decoloracin y la safranina o
fucsina bsica como contra-colorante

Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones
de Gram, y que deben ser tenidas en cuenta antes de su realizacin, a saber:

Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la

solucin de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso.
La estabilidad de la solucin de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o
fucsina bsica es de 1 ao y la de la solucin de lugol de 6 meses, todas ellas
conservadas e frascos cerrados. (la evaporacin puede alterar su efectividad)
a temperatura ambiente.
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Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretacin de

extensiones demasiado gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o
desengrasados, sobrecalentamiento en la fijacin y excesivos lavados durante
la tincin. Todos los anteriores son causas comunes de pobres resultados en la
tincin de Gram
Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una
tincin pueden ser cultivados, y al contrario, alguno no observados pero
presentes consiguen ser recuperados en el cultivo.

Interpretaciones.

Otras consideraciones importantes que deben ser revisadas e inspeccionadas por

microscopia tras la realizacin de la tincin son:

Como regla para evidenciar una buena decoloracin y teniendo en cuenta la

fuente de la muestra, el fondo de la tincin deber ser claro o ligeramente gran
(-). Si hay leucocitos se observaran completamente gram (-), y si hay levaduras
tipo Cndida completamente gram (+).
Para una buena interpretacin de la tincin, el grosor de la extensin debe
permitir que aparezcan ms de 2 clulas solapadas unas encimas de otras.
Examinar la tincin en busca de evidencias de inflamacin (clulas polimorfo-
nucleadas, clulas mono-nucleadas y/o hemates) La presencia de clulas
epiteliales, bacterias de la flora, restos alimenticios, segn el producto
patolgico que estemos observando, puede indicar una mala obtencin de
este.

En cuanto a la reaccin gram y caractersticas morfolgicas de los microorganismos

visualizados, estas son:

Positiva: Violeta fuerte o azul claro

Negativo: roja o rojo (en el caso de carbol fucsina el rojo ser intenso)
Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser debido
a una mala extensin, fijacin o tincin, presencia de clulas viejas, dao en la
pared celular o por particularidades espaciales de la pared celular de ciertos
microorganismos
Neutro: No toman ningn color, siendo generalmente el fondo alrededor de
ellos de un ligero gram (-). Los microorganismos puede ser intracelulares. Esta
reaccin gram ha sido vista en tinciones de muestra clnica en donde estn
presentes elementos fngicos o algunas especies de micobacterias.
Otras caractersticas: A examinar en el gran son si la tincin de los
microorganismos es homognea, bipolar, en cuentas o gotas punteada, en
barras o irregular.
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Tipos de tinciones

Las tinciones puede dividirse en simples, diferenciales, selectivas o vitales. En el primer

caso se aplica un solo colorante, de manera que todas las clulas se observaran de un
solo color. En la tincin diferencial se utiliza ms de un colorante y permite diferenciar a
las clulas tenidas por su afinidad a uno u otro compuesto de este tipo. Cuando se
aplica la tincin selectiva el colorante tiene afinidad por una estructura particular del
microorganismo. Cuando se tien microorganismos vivos se est aplicando una tincin
vital.

Tincin de Schaeffer y Fulton (Tincin de esporas)

La esporulacin no es un mecanismo de multiplicacin en bacterias, pues usualmente

por cada clula se produce solo una endospora. En algunos casos excepcionales se
puede producir ms de una espora, por ejemplo. Metanobacterium polyspora una
arqueobacteria no cultivable actualmente y anaerobacter polyendosporus un bacilo
Gram positivo que puede presentar ms de 7 endosporas por clula. Por otra parte, los
actinomicetales. Un grupo especial de bacterias, forman numerosas exosporas como
forma de multiplicacin.

Las endosporas son formas de resistencia, altamente deshidratadas y con una serie de
cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difciles de teir, excepto si se
calienta la preparacin para permeabilizarlas, sin embargo, pueden evidenciarse en
preparaciones a fresco o con diversas tinciones, pues las esporas aparecen como
estructuras refringentes no coloreadas. Las esporas son producidas por Bacillus
Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus y desulfotomaculum, gneros de
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bacterias Gram positivas, aunque recientemente han sido descritas en algunas

bacterias Gram negativas. Las endosporas son ms resistentes a condiciones adversas,
entre ellas calor, radiaciones, desinfectantes y otras, que las clulas vegetativas y las
exosporas. Se producen en condiciones nutricionales que favorecen el proceso de
esporulacin. La endospora ocupa una posicin caracterstica de la clula, puede ser
terminal, subterminal o central. La localizacin y el tamao de la espora varia con la
especie bacteriana y generalmente estas caractersticas son de valor para su
identificacin. Conforme el desarrollo de la espora se completa, la clula vegetativa
se desintegra y libera la espora.

Las endosporas bacterianas son muy resistentes a los procedimientos de tincin

usuales. La aplicacin de un solo colorante a una clula bacteriana que contiene una
endospora, solo tie la clula, pero la espora se mantiene incolora, para lograr
introducir el colorante dentro de la espora es necesario aplicar calor. La tincin de
Schaeffer y Fulton emplea verde malaquita como colorante primario, el cual es
eliminado posteriormente del resto de la clula bacteriana, pero no de la espora,
mediante un enjuague con agua. Como contra-tincin se emplea safranina, la cual
tie la clula vegetativa.

Tincin de Sheaffer Fulton

Es usada para colorear biometra hemtica, para esporas esta tambin es conocida
como la de Wright. La tincin de Sheaffer Fulton observa.

Esporas
Cuerpos fructferos
Conidias
Clulas gemantes

Tie endosporas de color verde (verde de malaquita) y cuerpo de bacterias en color

rojo (safranina o fucsina), sirve para diferenciar endosporas y bacterias.

Las endosporas son clulas especializadas, no reproductivas, producidas por unas

pocas bacterias de la divisin Firmicute. Su funcin primaria es ofrecer resistencia en
contra de la radiacin (ultravioleta, X y gamma), a la desecacin, a la lisozima o
tambin llamada muramidasa (enzima), al calor, a los desinfectantes qumicos y a la
trituracin mecnica. Las endosporas se encuentran comnmente en el suelo y el
agua donde sobreviven durante largos periodos de tiempo. En resumen, son
estructuras de resistencia compuesta de mltiples protenas.)

Tincin con tinta china

Identificacin de bacterias con capsula.

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Tincin de Ziehl - Neelsen

El fundamento de esta tcnica diferencial se basa en la propiedad de la pared celular

de algunas bacterias del orden. Actinomycetales. Tratndose de la capacidad de
resistir a la decoloracin con un alcohol y un acido fuerte cuando han sido
previamente teidas, lo cual se debe a la presencia de cidos micolicos en su pared
celular. El resto de las estructuras de estas bacterias son similares a los de las bacterias
Gram positivas. Existen dos variantes de esta tcnica; una llamada en caliente y la
otra en frio (o de Kinyoun). Cualquiera de las dos tcnicas citadas consiguen, ya sea
por el calor o aumentando el tiempo de contacto, que la fucsina penetre
profundamente y pueda resistir la accin decolorante de una solucin de acido
alcohol, apareciendo los bacilos de color rosa sobre un fondo azul..

Las bacterias acido alcohol resistentes (BAAR), tras la unin de la fucsina, resisten la
decoloracin orgnica posterior y se vern teidas de rosa. El resto de las bacterias se
decoloran y se tien con azul de metileno.
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