Validacin Mtodos Analticos

Cuantitativos, Cualitativos y
SemiCuantitativos en el Lab. Clnico
 Norma NCh2547.Of2008
(ISO 15189)

5.5 Procedimientos Analticos.

5.5.2 El laboratorio debe usar slo
procedimientos validados.

VALIDAR VERIFICAR
 Validacin

Confirmacin mediante el examen y la

obtencin de evidencias objetivas que
aseguran el cumplimiento de una serie de
requerimientos particularmente definidos
para aplicaciones concretas

(ISO 8402-1994 o NCh2000 ISO 8402).

 Validacin de Mtodos
Cuantitativos
Parmetros de calidad (desempeo analtico):
- LINEALIDAD
- EXACTITUD:
-PRECISIN: *Repetibilidad
*Reproducibilidad
-VERACIDAD, Trazabilidad
- INCERTIDUMBRE
- SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD/INTERFERENCIAS
- SENSIBILIDAD
- LMITE DE DETECCIN
- LMITE CUANTIFICACIN
- ROBUSTEZ
Respuesta del instrumento Anlisis Cuantitativo

LL

LL = L. de linealidad
LC LC = L. de Cuantificacin
LD = L. de Deteccin
LD
Intervalo
lineal

Concentracin
 Anlisis Cuantitativo

- LINEALIDAD
Capacidad del mtodo analtico de obtener resultados
linealmente proporcionales entre la concentracin del analito
y su respuesta.

Anlisis estadstico:
*Curva regresin y = a + b x
*Coeficiente de determinacin r2
*Anlisis de varianza (regresin) con
Si p>0,05 es
significativo y por Estimacin falta de ajuste
ende los datos Error residual puro.
tienden a ser lineales.
 Etapas De La Regresin
1 Seleccin del modelo: Normalmente una lnea recta
y=a +bx
(donde a es la pendiente de la recta y b la ordenada al origen)

2 Establecimiento del diseo experimental:

dominio experimental: rango de concentraciones
distribucin de las medidas
nmero de medidas

3 Estimacin de los parmetros del modelo.

Regresin por mnimos cuadrados.

4 Validacin del modelo: ANOVA

 Linealidad: Curva de Calibracin IgG
INMUNONEFELOMETRA

Concentracin (mg/dL) Medicin 1 Medicin 2

X log(X) Y log(Y) Y log(Y)
11,675 1,067 1263 3,101 948 2,977
5,8375 0,766 935 2,971 672 2,827
2,9188 0,465 665 2,823 408 2,611
1,4594 0,164 408 2,611 215 2,332
0,7297 -0,137 207 2,316 103 2,013
0,3648 -0,438 120 2,079 35 1,544

Medicin instrumental (seal):

Intensidad de la luz dispersada por los complejo
antgenos-anticuerpos.
 Curva Calibracin IgG

1200

1000

800
LECTURA

600

400

200

0
0 2 4 6 8 10 12

CONCENTRACION mg/dL
 Curva Calibracin IgG

INMUNONEFELOMETRA
3.4
3.2
log lectura

3
2.8
2.6
2.4
2.2
2
-0.5 -0.1 0.3 0.7 1.1
log conc.
Precisin
v/s
Exactitud
Precisin v/s Exactitud
 Exactitud
Grado de concordancia entre el resultado de
una medicin y el valor de referencia aceptado
o verdadero.
* Nota: El trmino exactitud cuando se
aplica a un conjunto de resultados de
mediciones implica la combinacin de
los componentes aleatorios y de un
error sistemtico comn o de un
componente de sesgo (Norma ISO
5725-1 e ISO 3534-1)
 Exactitud
(Norma ISO 3534-1)

- Precisin: grado de concordancia entre

resultados de mediciones obtenidas
independientes bajo condiciones establecidas
(repetibilidad y reproducibilidad).
- Veracidad: grado de concordancia entre el
valor medio obtenido a partir de una serie de
resultados y un valor de referencia aceptado.

Exactitud = Precisin + Veracidad

 Precisin
La precisin depende slo de la distribucin de errores
aleatorios y no tiene ninguna relacin con el valor
verdadero o el valor especificado.
-Repetibilidad
-Precisin intermedia o reproducibilidad
intralaboratorio
-Reproducibilidad

(Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)

 Anlisis Cuantitativo
Validacin
PRECISIN:
Grado de concordancia entre resultados de mediciones
obtenidas de una serie repetida de anlisis, sobre una
muestra homognea, bajo condiciones establecidas
(Norma ISO 3534).
REPETIBILIDAD:
Es la medida de la precisin de un mtodo efectuado
en las mismas condiciones, sobre el mismo analito, con
el mismo mtodo, con el mismo operador, utilizando el
mismo instrumento de medida y durante un corto
intervalo de tiempo.
 Anlisis Estadstico De La
Precisin

Media
Desviacin estndar
Coeficiente de variacin
Anlisis de varianza F (comparacin de la desviacin
estndar)

Estudio homogeneidad muestra:

Anlisis de varianza (F)
Prueba de tde Student.
 REPETIBILIDAD INMUNONEFELOMETRA
PARA LA DETERMINACIN IgG
(Homogeneidad Muestra)

Muestra Contramuestra
n 6 6
Media 1557.50 1554.67
s 52.129 82.199
CV 3.347 % 5.287 %

t calculado = 0.0713 < t tabla 5;0.025 = 2.571

No existe diferencia estadstica significativa y por lo tanto las
muestras son iguales y homogneas.
 Anlisis Cuantitativo
Validacin

PRECISIN
REPRODUCIBILIDAD:
Es la medida de la precisin de los resultados de un
mtodo analtico efectuado sobre el mismo analito, pero
en condiciones diferentes (diferentes equipos utilizados,
el operador, el perodo de tiempo, etc.)
 Reproducibilidad
Inmunonefelometra para
Determinacin de IgG

IgG mg/dL

DA 1 DA 2 DA 3

1556 1568 1564

1568 1543 1606
1624 1556 1585
1481 1598 1556
1598 1602 1535
1518 1413 1568
 REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRA
PARA DETERMINACIN DE IgG

n 18 (en tres das diferentes)

media 1557.72
Si F < P no existe
DE 12.27 diferencia
estadstica
CV 0.8 % significativa en
Precisin 99.2 % las mediciones
de los grupos.

Anlisis de Varianza
--------------------------------------------------------------------------------------
Fuente var. SC gl CM F P
--------------------------------------------------------------------------------------
Entre grupos 1496,78 2 748,389 0,28 0,7626
Intra grupos 40682,8 15 2712,19
--------------------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 42179,6 17
 ANLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIN

VERACIDAD:
Grado de concordancia entre el valor medio
obtenido de una serie de resultados y el valor de
referencia aceptado (certificado). Norma ISO 3534

Anlisis estadstico
Media experimental
Desviacin estndar experimental
Prueba de t de Student
 VERACIDAD INMUNONEFELOMETRIA
PARA DETERMINACIN DE IgG

MRC DB Lote 084705

IgG mg/dL
n = 10 931,8
942,3
951.8
924,8
918,6
927.1 Media experimental 930.9
920,5 Media certificada 925.0
938,4
935,2
918,8
 VERACIDAD INMUNONEFELOMETRIA
PARA DETERMINACIN DE IgG

Valor exp. MRC

media 930,9 925
s (DE) 11,0545

t calculado = 1,6963 <t (tabla) 9;0.025 = 2,262

p = 0,124
n
t
n - 1, /2 s
Se acepta la hiptesis de nulidad Ho. Existe trazabilidad
Incertidumbre
Magnitud asociada con el
resultado de medicin que
caracteriza la dispersin de
los valores que
razonablemente podran ser
asignados al mesurando.
 Incertidumbre
-Incertidumbre estndar:
Incertidumbre de un resultado de medicin expresada
como desviacin estndar.
-Incertidumbre estndar combinada:
Incertidumbre estndar como resultado de una
estimacin mediante la propagacin de errores con
base en las incertidumbres individuales.
-Incertidumbre expandida
Incertidumbre estndar que se expresa como un
intervalo de confianza.
Clculo de Incertidumbre
Expandida
s
U x t /2; n - 1

n
gl = n - 1 (grado libertad)
nivel = 0,05
U MRC IgG exp. = 7,9 mg/dL
 Anlisis Cuantitativo
Validacin

SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD

Capacidad del mtodo analtico para medir en

forma exacta un analito particular dentro de una
mezcla compleja, sin interferencia de otras
sustancias o analitos.
Magnitud influyente, magnitud que no es el mesurando
pero afecta al resultado de la medicin (interferencia).
 Interferencia de la
Seal
Algunos compuestos presentes en la muestra
por un artefacto aumentan o disminuyen la
magnitud del mecanismo de deteccin.

Ejemplos:
Fluorescena, EDTA , Azida de
Sodio, Lpidos, Complemento,
Fibringeno, Albmina
 Deteccin y Control de
Interferencias

Son difciles de detectar pues se desconoce el resultado

verdadero. Se obtienen de los datos del fabricante o de
literatura. El laboratorio debe establecer requisitos de
ausencia de interferencia para valores definidos de las
magnitudes.

Verificar resultados de pacientes con condiciones clnicas

asociadas con interferencias (enfermedades hepticas,
fallas renales, embarazo, incongruencias con cuadro
clnico).

Inspeccionar las muestras visualmente buscando hemlisis,

ictericia, lipemia o evaluarlas usando indicadores sricos.
 Estudio de Interferencias

1 Prueba de dilucin lineal (las interferencias no se

comportan linealmente con la dilucin).

2 Analizar la muestra por otro mtodo

(comparacin de mtodos).

3 Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir

sustancias potencialmente interferentes.

4 Anlisis de muestras enriquecidas con el

interferente.
Respuesta del instrumento Anlisis Cuantitativo

LL

LC
LL = L. de linealidad
LD LC = L. de Cuantificacin
LD = L. de Deteccin
Intervalo
lineal

Concentracin
 Anlisis Cuantitativo
Validacin
SENSIBILIDAD
Es la capacidad de un mtodo analtico de
registrar ligeras variaciones de la concentracin.

b
Sensibilidad
b = Pendiente obtenida desde la regresin lineal.

sm Sm = desviacin estndar de la muestra.

 Anlisis Cuantitativo
Validacin
LMITE DE DETECCIN (LD)

Menor concentracin o cantidad de analito

detectable con razonable certeza por un
procedimiento analtico dado. Concentracin que
proporciona una seal en el instrumento
significativamente diferente de una muestra blanco.

Ybl = seal promedio del blanco.

ybl 3 * s bl Sbl = desviacin estndar del blanco.
LD b = pendiente obtenida desde la regresin lineal del
b analito.
 Anlisis Cuantitativo
Validacin
LMITE DE CUANTIFICACIN (LC)

Es la menor concentracin de analito que puede

determinarse con precisin y exactitud razonables
en las condiciones establecidas y se expresa en
unidades de concentracin.
Ybl = seal promedio del blanco.
ybl 10 * s bl Sbl = desviacin estndar del blanco.
LC
b b = pendiente obtenida desde la regresin lineal del
analito.
 Anlisis Cuantitativo
Validacin

ROBUSTEZ:

Grado de concordancia de los resultados al efectuar

cambios en las condiciones operativas y
ambientales normalizadas del mtodo.
 Robustez
Capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado
por pequeas pero deliberadas variaciones en los
parmetros del mtodo y provee informacin de su
comportamiento en la rutina.
Parmetros estudiar:
- Efectos del congelado-descongelado
- Tiempos de incubacin
- Cambio pH tampones
- Temperaturas de incubacin
- Longevidad de los reactivos
- Preparacin de la muestra
- Conservacin de la muestra.
NORMA NCh 2446.Of1999
Gua para la validacin de mtodos de ensayo
Principios y conceptos generales

5 Procedimiento de validacin
5.1 Los laboratorios de ensayo y los organismos de acreditacin
deben contar con procedimientos y directrices para planificar y
controlar el proceso de validacin de mtodos de ensayo. Sin
embargo, la discusin anterior ha indicado claramente que no
puede desarrollarse un procedimiento nico. En consecuencia,
tiene que desarrollarse una gama de diferentes alternativas de
tcnicas de validacin. Cun detallada deba ser la validacin,
depende de las circunstancias (necesidades, costos, posibilidades,
riesgos, etc.).
DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Espaola de
Bioq. Cln. y Patologa Molecular

SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIN DE EVIDENCIA

OBJETIVA DE LA VALIDACIN DE MTODOS NORMALIZADOS:
El Laboratorio Clnico debera establecer requisitos y verificar, al menos
las siguientes caractersticas metrolgicas:
1.-Error sistemtico (sesgo). El fabricante del calibrador deber
proporcionar la trazabilidad y la incertidumbre del valor asignado.
Deber proporcionar datos sobre la veracidad de los resultados. Sin
embargo, el Laboratorio debera obtener sus evidencias que el proceso
proporciona resultados satisfactorios.
2.-Interferencias (magnitudes influyentes). El fabricante deber
proporcionar la informacin de las interferencias.
DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Espaola de
Bioq. Cln. y Patologa Molecular

SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIN DE EVIDENCIA

OBJETIVA DE LA VALIDACIN DE MTODOS NORMALIZADOS:
3.-Imprecisin interdiaria (reproducibilidad). Responsabilidad
Laboratorio.
4.-Lmite de deteccin. El fabricante deber propocionar
especificaciones de imprecisin, sensibilidad y lmite de deteccin. El
Laboratorio debera estudiar el lmite de deteccin cuando observa
diferencia.
5.-Contaminacin
6.-Verificar dilucin
 Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos

(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,

College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)

Recomendacin de validacin de mtodos de acuerdo a la

complejidad de la prueba o determinacin:
Pruebas de mnima complejidad (waived tests).
No hay recomendacin para la validacin de mtodo.
Seguir directrices del fabricante.
 Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos

(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,

College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)

Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados por el

FDA los estudios de validacin de mtodos deberian seguir las siguientes
recomendaciones:
- Verificar los parmetros de calidad o especificaciones de desempeo
(demostrar resultados comparables a los establecidos por el fabricante):
- Exactitud
- Precisin
- Rango de los resultados analticos reportado por el mtodo
- Verificar que los intervalos de referencia del fabricante son apropiados para
la poblacin de pacientes del laboratorio.
 Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos

(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,

College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)

Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados por el

FDA
Actividades a realizar por el laboratorio:
- Comparacin de mtodos para estimar la inexactitud o sesgo.
- Replicar muestra o control para estimar la imprecisin
- Hacer estudio de linealidad para estimar el rango de la determinacin
reportado por el fabricante
- Obtener valores de referencia para verificar intervalo de referencia indicado
por el fabricante
 Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos

(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,

College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)

Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o

desarrollados en el laboratorio, la validacin de los mtodos requiere:
- Exactitud
- Precisin
- Sensibilidad analtica
- Especificidad analtica, incluyendo el estudio de sustancias
interferentes
- Rango de los resultados analticos reportado por el mtodo
- Intervalo de referencia (valores normales)
- Cualquier otro parmetro requerido para el desempeo del mtodo
 Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos

(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP,

College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory
Accreditation)

Pruebas moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o

desarrollados en el laboratorio
Actividades a realizar por el laboratorio:
- Comparacin de mtodos para estimar la inexactitud o sesgo.
- Replicar muestra o control para estimar la imprecisin
- Hacer estudio de linealidad para estimar el rango a reportar
- Lmite de deteccin para estimar interferencias permanentes
- Experimentos de recuperacin para estimar proporcin de interferencias
- Obtener valores de referencia para estimar el intervalo de referencia
 Mtodos Cualitativos y/o
Semicuantitativos

En los laboratorios de anlisis se generan

cada vez ms mediciones que dan
respuesta rpidas de tipo cualitativo.
Respuesta de tipo binario: Si / No .
Presencia o ausencia de determinado analito.
Presencia o ausencia de un determinado nivel del analito.

Se denominan sistemas de screening.

 Sistemas de Screening
Muchas veces se utilizan como una etapa previa
para luego realizar un anlisis cuantitativo y
confirmatorio.
Evita anlisis cuantitativos a muestras que dan
negativo.
A nivel microbiolgico generalmente en
identificacin bacteriana son diagnsticos y no
presuntivos.
 Anlisis Cualitativo
Mtodo Confirmatorio

Sistema de Anlisis
tamizaje cuantitativo
SI
(screening)
Presencia del analito

> 2 ng/mL Ausencia del analito

< 2 ng/mL
Menor experimentacin.
NO
Decisin rpida.
De fcil manejo, porttiles, etc.
Sin necesidad de equipos.
Ahorro.
No se
analiza
 Sistemas de Medida Cualitativos

Anlisis cualitativo clsico o sensorial:

Color: cambio, aparicin.
Olor.
Turbidez.
ELISA.
Crecimiento bacteriano.
Deteccin instrumental:
UV: fluorescencia, potenciometra.
Sensores: qumicos, bioqumicos, etc.
ELISA.
 Anlisis Cualitativo Clsico o
Sensorial

La respuesta binaria SI/NO se obtiene

directamente.
En general la presencia del analito se determina
por comparacin con un blanco.
Pruebas bateras bioqumicas

Se encuentran tambin las pruebas de Kits.

Son dispositivos comerciales para pruebas concretas.
Contienen todos los reactivos necesarios.
Pueden contener algn instrumento sencillo.
 Anlisis Cualitativo Clsico o
Sensorial
Pruebas de kits:
Ltex para serotipificar Streptococcus.
Tiras de orina.
Pruebas rpidas para meningitis bacterianas.
API.
Mtodo de CIM por microdilucin
en microplacas.
Coaglutinacin.
Mtodo ELISA rpido para deteccin
C. difficile
 Anlisis Cualitativo Sensorial

La determinacin se hace mediante una

medida instrumental:
Colorimetra.
Fluorescencia.

La presencia o no de un determinado analito

puede ser el nivel lmite de deteccin o a un
nivel superior.
 Anlisis Cualitativo Sensorial

La respuesta instrumental que se obtiene se

transforma en respuesta binaria SI/NO e implica
un tratamiento de datos.
Primero hay que establecer la respuesta
instrumental:
Valor de absorbancia para la concentracin
correspondiente.
Si el valor es superior la respuesta es Si.
Ej. Mtodos automatizados para Hemocultivos.
Ej. Mtodos automatizados para CIM.
Ej. Estandarizacin automatizada a 0,5 MF.
 Mtodo de ELISA

Mtodo Semicuantitativo.
Se basan en una reaccin inmunolgica.
La deteccin puede ser sensorial o
instrumental.
Ej. Bacterias: C. difficile, E. coli .
Ej. Virus: Hepatitis, SIDA, Sarampin, etc.
Ej. Parsitos: Chagas
Autoinmunidad: ENA, AAN, DNA, etc.
 Validacin Mtodos Cualitativos

Mtodos cualitativos tambin deben validarse.

Validar consiste en verificar y documentar su
validez a requisitos especficos.
La validacin implica como etapa previa la definicin
de los requisitos analticos o de calidad.
Luego entonces la determinacin de estos
requisitos.
Los resultados se expresan diferente a los mtodos
cuantitativos.
 Expresin de Resultados

Mtodos Cualitativos
Anlisis Cualitativo / screening

SI / NO
Con probabilidad
de error
Tambin tiene dos valores el primero binario y el
segundo es la probabilidad de error asociada a la
decisin tomada.
Se expresan en trminos probabilsticos.
 Requisitos de Calidad
Mtodo Cuantitativo
Linealidad.
- Homogeneidad.
Precisin:
- Repetibilidad.
- Reproducibilidad.
- Robustez.
Veracidad (exactitud).
Incertidumbre.
Limite de deteccin.
Lmite de cuantificacin.
Rango de cuantificacin
Selectividad e Interferentes.
Mtodo Cualitativo
Especificidad.
Sensibilidad.
Valor predictivo positivo (VPP).
Valor predictivo negativo (VPN).
Exactitud diagnstica.
Lmite de corte (cut-off).
Incertidumbre o regin de error.
Lmite de deteccin.
Robustez.
 Especificidad

Se define como la capacidad o habilidad del

sistema de detectar en forma exacta un analito
en una matriz.
Proporcin de muestras negativas (no reactivas)
que son correctamente identificadas.
Generalmente se expresa como probabilidad.
 Especificidad (E)

Analito Analito
presente ausente

Mtodo Verdaderos Falsos

positivo positivos (VP) positivos (FP)

Mtodo Falsos Verdaderos

negativo negativos (FN) negativos (VN)

Proporcin de muestras sin el analito, cuyo mtodo es

negativo:
E = VN / (VN + FP)
 Sensibilidad

Es la capacidad o habilidad del sistema de

detectar muestras positivas cuando realmente lo
son.
Proporcin de muestras positivas o reactivas
correctamente identificadas por la prueba.
Generalmente se expresa como probabilidad.
Concentracin de un analito necesaria para
producir una unidad de cambio de lectura
instrumental.
 Sensibilidad (S)

Analito Analito
presente ausente

Mtodo Verdaderos Falsos

positivo positivos (VP) positivos (FP)

Mtodo Falsos Verdaderos

negativo negativos (FN) negativos (VN)

Proporcin de muestras que contiene el analito cuyo

mtodo es positivo:
S = VP / (VP+FN).
 Falsos Negativos (FN)

Desviacin negativa.
El mtodo a validar da un resultado negativo y el
mtodo de referencia da positivo.
Probabilidad de que la muestra conocida como
positiva, d como negativa por el mtodo.
Corresponden a muestras que contienen uno o ms
analitos por encima del valor lmite permitido y que en
prueba de screening dan respuesta negativa.
Se concluye con este resultado previo que la muestra
no contiene el analito en los niveles fijados cuando si
lo contiene.
 Falsos Positivos (FP)

Desviacin positiva.
Probabilidad de que la muestra clasificada como
negativa, d como positiva por el mtodo.
Corresponden a aquellas muestras que realmente no
contienen el analito en el nivel definido y que por Ej. la
prueba de screening lo detecta.
Se produce cuando el mtodo a validar proporciona
un resultado positivo sin confirmacin y el mtodo de
referencia da un resultado negativo.
 Exactitud Diagnstica

Proporcin de resultados correctos

(verdaderos positivos + verdaderos negativos).
Capacidad para detectar correctamente los
positivos y los negativos.
Es el grado de concordancia entre el resultado
obtenido en un ensayo y el valor de referencia
que debiera obtenerse.
 Exactitud Diagnstica (ED)

Analito Analito
presente ausente

Mtodo Verdaderos Falsos

positivo positivos (VP) positivos(FP)

Mtodo Falsos Verdaderos

negativo negativos(FN) negativos (VN)

Proporcin de resultados correctos :

ED = (VP+VN) / (VP+FP+VN+FN)
 Criterio de Exactitud Diagnstica

El mejor criterio actual para establecer la

presencia o ausencia de la condicin
(enfermedad), evento o caracterstica de
inters usando un mtodo simple o una
combinacin de mtodos de laboratorios que
incluyan, pruebas de imagen, patolgicos,
informacin clnica, ensayos o paneles de
referencia.
 Lmite de Corte o Cut-off

Limite de cuantificacin??
Nmero mnimo de microorganismos dentro de una
variabilidad definida que pueden determinarse bajo
las condiciones experimentales del mtodo
evaluado.
Aplicado a anlisis microbiolgicos cuantitativos.
Relacionado a la sensibilidad, corresponde al nivel
de concentracin donde la sensibilidad es un 95% y
la probabilidad de error tipo es de un 5%.
 Lmite de Corte (cut-off)

Pacientes negativos Pacientes positivos

Resultados mtodos
 Definiciones de Requisitos de
Calidad
Valor del Lmite de Corte (cut-off). Valor de corte del mtodo, dado
principalmente por el fabricante, sobre el cut-off resultados positivos y
bajo cut-off, resultados negativos. Se basa en una dicotoma
(presencia/ausencia, si/no, etc.).

C= 2ng/mL
 Definiciones de Requisitos de
Calidad
Regin de Incertidumbre. Corresponde a la imprecisin del
mtodo, es un rango donde encontramos error Tipo I o (Falsos
positivos) y Tipo II o (falsos negativos) del mtodo.

C= 2ng/mL
 Definiciones de Requisitos de
Calidad
Regin de Incertidumbre (*CLSI: EP12-A2):
C50: Concentracin del analito donde se produce un 50% de resultados
positivos y un 50% de resultados negativos.
Intervalo C5 C95: Rango de concentraciones requeridas del analito
donde a concentraciones < de C5, son resultados concretamente
negativos y > C95 son concretos positivos.

Verdaderamente Negativas. C50 Verdaderamente Positivas.

 Lmite de Deteccin

Cantidad mnima de analito que puede ser

detectado en una muestra pero que no puede
ser estimado con precisin o sea que no
necesariamente es cuantificado en las
condiciones del ensayo.
Aplicado a anlisis microbiolgicos cualitativos.
Los resultados se expresan como detectado / no
detectado.
 Robustez
Efecto Matriz:
Capacidad de un procedimiento de permanecer
inalterado por pequeas pero deliberadas variaciones
en los parmetros del mtodo y provee informacin
de su comportamiento en la rutina.
Identificar variables que pueden tener efectos
significativos en la respuesta del mtodo.
Analizar cada set en condiciones experimentadas
dadas y determinar el efecto de cada cambio.
Efectos congelado/descongelado, tiempos y
temperaturas de incubacin, cambios pH, preparacin
y conservacin de la muestra y reactivos.
 Resumen: Definiciones Requisitos
de Calidad
Especificidad. Proporcin de muestras negativas (no reactivas)
que son correctamente identificadas.
Sensibilidad. Proporcin de muestras positivas o reactivas
correctamente identificadas por la prueba.
Falso Positivo. Probabilidad de que la muestra clasificada como
negativa, d positiva por el mtodo.
Falso Negativo. Probabilidad de que la muestra conocida como
positiva, d negativa por el mtodo.
Valor Predictivo Positivo. Probabilidad que tiene una muestra
de ser realmente positiva, cuando el resultado de la prueba
resulta reactivo.
Valor Predictivo Negativo. Probabilidad que tiene una muestra
de ser negativo, cuando el resultado de la prueba es no reactivo.
Exactitud diagnstica analtica. Capacidad del mtodo para
detectar correctamente los positivos y los negativos.
 Observaciones

Hay pruebas en las que tiene un impacto a nivel

de Salud Pblica adems de individual al dar un
resultado Falso (+) o Falso (-)
Ej. VIH, HEP. B
En resistencia antibitica es de mayor impacto
los falsos negativos, o sea informar como
sensible cuando es resistente.
De mayor trascendencia tambin en Falsos (-):
Hemocultivos, meningitis, resistencia antibitica,
VIH, etc.
 Mtodo ideal

Normal Enfermo
Nr de individuos

No falsos positivos o negativos

Valores
mtodo
 Realidad Mtodos

Normal, sin el analito Enfermo, con el analito

Nr de individuos

+2SD

Valores
Falsos Falsos Mtodo
Negativos Positivos
 Definiciones del ejemplo

Pacientes negativos Pacientes positivos

Verdaderos Positivos

Sin enfermedad
Resultados mtodos
Con enfermedad
 Definiciones del ejemplo

Pacientes negativos Patientes positivos

Resultados mtodo Falsos

Sin enfermedad Positivos
Con enfermedad
 Definiciones del ejemplo

Pacientes negativos Pacientes positivos

Verdaderos
negativos

Resultados mtodos
Sin enfermedad
Con enfermedad
 Definiciones del ejemplo

Pacientes negativos Pacientes positivos

Falsos
negativos

Resultados mtodo
Sin enfermedad
Con enfermedad
 Evaluador de los requisitos de
Calidad
Tablas de Contingencia. Diferencian las muestras en dos
categoras, (+)/(-) segn el mtodo, y establecen una tabla de
comparacin respecto del resultado obtenido mediante el
criterio de exactitud diagnstica analtica.

Criterio de exactitud diagnstica

Prueba a Evaluar POSITIVOS NEGATIVOS Total

POSITIVOS VP FP VP + FP

NEGATIVOS FN VN FN + VN

Total VP + FN FP + VN VP + FP +FN +VN

*CLSI: EP12-A2
 Tablas de Contingencia

Las mas simples son las que diferencian las

muestras en dos categoras : positivo o
negativo.
Luego se establece una tabla de comparacin
respecto al resultado obtenido con resultado de
mtodo de referencia .
A partir de la tabla se calculan los cuatro
parmetros bsicos, adems de otros: falsos(+),
falsos(-), sensibilidad y especificidad.
 Tablas de Contingencia
Ventajas:
o Son de fcil aplicacin en la mayora de los
bioensayos.
Desventajas:
o Dan una medida global de la capacidad del mtodo.
o Se estima que la muestra se comportar
estadsticamente de forma similar a las ya analizadas.
o No se calcula una probabilidad de error en cada
muestra en particular.
o La capacidad de la tabla depende del nmero de
muestras analizadas.
 Evaluador de los requisitos de
Calidad
Teorema de Bayes. Calcula la probabilidad de dar verdadero
(positivo o negativo) un resultado cuando en realidad lo es, vale
decir, probabilidad que ocurra el evento A dado el evento B.

P(VPP) = P(p/a)* P(a) /P(p/a)*P(a)+P(p/b)*P(b)

P(VPN) = P(n/a)*P(a)/P(n/a)*P(a)+P(n/b)+P(b)

P(a): prob. de obtener un resultado positivo

P(b): prob. de obtener un resultado negativo
P(p/a): prob. de obtener un resultado (+)
cuando esta presente la enfermedad.
P(p/b): prob. de obtener un resultado (+)
cuando no esta presente la enfermedad.
 Evaluador de los requisitos de
Calidad
Curvas ROC (Receiver Operating Characteristic o Curvas de
Operatividad Relativa). Se generan al evaluar las modificaciones en
la sensibilidad y especificidad que son resultantes de la modificacin
que se haga en los niveles de corte, de acuerdo al proceso de
decisin clnica para un analito determinado.

* A. Pulido, I. Ruisnchez, R.
Boqu , F.X. Rius
 Sensibilidad vs. Especificidad.

(Fraccin verdaderos positivos)

100
(Fraccin verdaderos positivos)

100
80

SENSIBILIDAD
80
SENSIBILIDAD

60
60
40
40
20
20
0
0 0 20 40 60 80 100
0 20 40 60 80 100
ESPECIFICIDAD (Fraccin verdaderos 1-ESPECIFICIDAD (Fraccin falsos
negativos) positivos, FFP)

Sensibilidad vs. 1- Especificidad.

 Lectura de las Curvas ROC

* http://ludwig-sun2.unil.ch/~darlene/module4/
 PROTOCOLO DE VALIDACIN DE UN
- Identificacin MTODO ANALTICO
- Titulo
- Protocolo redactado por
- Protocolo aprobado por
- Objetivo
- Alcance
- Factores crticos
- Seleccin y tratamiento muestra y MRC
- Identificacin equipo: certificado calibracin
- Mtodo analtico:
- Variables a determinar : anlisis estadstico
- Personal que desarrollar la validacin
- Criterio de aceptacin para cada parmetro de desempeo
- Conclusiones
- Registros
- Referencias
 INFORME DE VALIDACIN DE UN
- Identificacin MTODO ANALTICO
- Titulo
- Informe redactado por
- Informe aprobado por
- Objetivo
- Alcance
- Responsabilidad
- Equipo, materiales, documentos
- Procedimiento
- Clculos y anlisis estadsticos
- Criterio de aceptacin vs Resultados
- Informe de desviaciones
- Informe resultados y conclusiones de validacin del
mtodo
 Cundo Verificar y
cundo Validar ???

VALIDAR VERIFICAR
Gracias