PREPARACIN PASO 1: 3-7 DAS ANTES DE LA TRANSFORMACIN

1. Preparamos el agar
Las placas las preparamos 3 das antes. Almacenamos 2 das a temperatura
ambiental y luego bajo refrigeracin hasta el momento de su uso. Los dos das
a temperatura ambiente secamos el agar para favorecer la captacin de la
solucin de transformacin. Para preparar el agar, aadimos 500 ml de agua
destilada a un matraz Erlenmeyer de 1 litro. Aadimos el contenido del paquete
de agar LB. Agitamos el matraz para disolver el agar, y calentamos hasta
ebullicin en el microondas. Volvimos a agitar y calentar unas tres veces ms
hasta que el agar se disolvi, teniendo cuidado de dejar enfriar el matraz antes
de agitarlo, para evitar que el medio caliente saltara a la mano. Cuando el agar
se disolvi, dejamos enfriar hasta que el matraz se puedo tocar sin quemarse
(50 C). Mientras se enfriaba el agar, etiquetamos las placas y preparamos la
arabinosa y la ampicilina como se indic a continuacin. Tuvimos cuidado de
que el agar no se enfriara tanto para que no se solidificara.

2. Preparar la arabinosa y la ampicilina

La arabinosa se encuentraba deshidratada en un pequeo vial. Con una pipeta
estril, aadimos 3 ml de la solucin de transformacin en el vial para rehidratar el
azcar. Agitamos el vial, mejor con la ayuda de un vrtex. (Se utiliz la solucin de
transformacin porque est estril. En su lugar se pued utilizar agua destilada
estril). La ampicilina tambin estaba envasada en un pequeo vial y deshidratada.
Con otra pipeta estril, aadimos 3 ml de la solucin de transformacin al vial para
rehidratar el antibitico (Se utiliz la solucin de transformacin porque estaba
estril. En su lugar se puede utilizar agua destilada estril).
 3. Rotular las placas
Las 40 placas de agar las rotulamos con un rotulador de tinta indeleble en la
base, cerca del borde de la placa. Rotulamos 2 placas como LB, 2 como LB/amp
y 2 como LB/amp/ara.

4. Aadir el agar LB en las placas

Primero, aadimos el agar LB en las placas marcadas como LB. Con una mano
abrimos la tapa de la placa, mientras que con la otra mano se aadimos el agar
LB. Rellenamos la placa entre un tercio y la mitad de su capacidad (12 ml).
Tapamos esa placa, y continuamos con otra placa. Cuando se rellenaros todas
las placas dejamos enfriar en esa posicin.

A continuacin, aadimos la ampicilina ya hidratada al agar LB sobrante en el

matraz. Agitamos el matraz brevemente para mezclarlo. Rellenamos las 3 placas
rotuladas como LB/amp segn la tcnica descrita antes.
Por ltimo, aadimos la arabinosa hidratada al agar LB con ampicilina sobrante en
el matraz. Agitamos el matraz brevemente, mezclamos y rellenamos las 3 placas
marcadas como LB/amp/ara utilizando la tcnica ya descrita.

5. Almacenar las placas

Despus de dejar las placas dos das a temperatura ambiente las pudimos
utilizar. Guardamos las placas en la nevera de forma invertida y dentro de las
bolsas hasta su uso.

PREPARACIN PASO 2: 24-36 HORAS ANTES DE LA TRANSFORMACIN

REHIDRATAR LAS BACTERIAS
Con una pipeta estril, rehidratamos el liofilizado de E. coli HB101 aadiendo 250
ml de la solucin de transformacin en el vial. Tapamos el vial y dejamos la
suspensin 5 minutos a temperatura ambiente. Agitamos el vial antes de aadirlo a
las placas de LB. (Se utiliz la solucin de transformacin porque est estril. En su
lugar se puede utilizar agua destilada estril). Guardamos la bacteria rehidratada en
la nevera hasta el momento de su uso (en 24 horas a ser posible, y no ms de 3
das).
 2. SEMBRAR LAS PLACAS PARA OBTENER COLONIAS BACTERIANAS
AISLADAS
Cada grupo necesitar su propio cultivo de clulas a transformar. Las placas de LB
se sembraron para obtener colonias aisladas de la bacteria y se incubaron a 37 C
durante 24-36 horas antes de la transformacin.
El propsito del aislamiento fue formar colonias aisladas a partir de una suspensin
con una alta concentracin bacteriana. En condiciones favorables, una clula se
multiplica para dar millones de clulas genticamente idnticas en 24 horas. Hay
millones de bacterias en una nica colonia de 1 mm.
a. Introducimos un asa de siembra estril en la suspensin bacteriana. Introducimos
el asa sin inclinar el vial. Sacamos el asa y extendimos en la placa como aparece
en la figura inferior. La extensin se realiz en cuatro cuadrantes. La primera
extensin fue para dispersar un poco las clulas. Deslizamos el asa de izquierda a
derecha una docena de veces en cada uno de los cuadrantes. En cada cuadrante
consecutivo las clulas estaban cada vez ms diluidas, aumentando la posibilidad
de obtener colonias aisladas.
b. Fue importante utilizar la mayor superficie posible de placa para realizar la
extensin. Giramos la placa 45 grados aproximadamente (de manera que se facilite
el movimiento de la mano) y comenzamos con el segundo cuadrante. Tocamos el
cuadrante anterior un par de veces y luego continuamos deslizando el asa de
izquierda a derecha unas 10 veces.
c. Giramos la placa de nuevo y repetimos la accin.
d. Giramod la placa por ltima vez y sembramos el ltimo cuadrante. Repetimos los
pasos a-d en el resto de las placas de LB. Usamos el mismo asa de siembra para
todas las placas. Al terminar con cada placa, tapamos inmediatamente para evitar
su contaminacin.
Dejamos las placas todo un da en posicin invertida en la estufa a temperatura
ambiente

Lo que observamos fue que f. E. coli produjo colonias de color crema, redondas y
de bordes lisos.

3. PREPARAMOS EL PLSMIDO PGLO

Con una nueva pipeta estril aadimos 250 ml de la solucin de transformacin en
el vial que contena el plsmido pGLO liofilizado.
PREPARACIN PASO 3: ANTES DE LA TRANSFORMACIN
1. Preparamos alicuotas
Aadimos 1 ml de la solucin de transformacin (CaCl2) y 1 ml en el caldo LB en
los tubos eppendorf de 2 ml del kit. . Etiquetamos los tubos. Y Guardamos bajo
refrigeracin
2. Preparar los puestos de trabajo
1. Etiquetamos los tubos eppendorf cerrados, uno como +pGLO y otro como
pGLO. Indicando tambin el nombre del grupo. Pusimos los tubos en una gradilla
de corcho.
2. Abrimos los tubos y con una pipeta estril y aadimos 250 ml de la solucin de
transformacin (CaCl2).

3.
Pusimos los tubos en hielo.

4. Con un asa de siembra estril cogimos una colonia de la placa. Abrimos el tubo
+pGLO e introducimos el asa en la solucin de transformacin. Giramos el asa
entre los dedos ndice y pulgar hasta que la colonia se disperso totalmente en la
solucin de transformacin (sin que quedara fragmentos flotantes).

Dejamos el tubo en la gradilla en

hielo. Con otro asa estril repetimos la
operacin con el tubo pGLO.

5. Situamos la solucin con el plsmido pGLO a la luz UV. Introducimos un nuevo

asa estril en el vial que contiene el
plsmido y pusimos la solucin
plasmdica (como si cogiramos
jabn para hacer pompas de jabn).
Llevarlo al tubo +pGLO, cerrarlo y
dejamos el tubo en la gradilla en el
hielo. Cerramos tambin el tubo
pGLO, pero sin aadir el plsmido.
 6. dejamos incubar los tubos en hielo 10
minutos. Asegurndonos de que el fondo de
los tubos est en contacto con el hielo.

7. Mientras que los tubos permanecan en el hielo, etiquetamos las placas de agar
en la base de la forma: una placa LB/amp y una LB/amp/ara como +pGLO, y otra
LB/amp y otra LB/amp/ara como pGLO.

8. creamos un Choque trmico. Llevamos los tubos en la gradilla al bao mara ya

preparado a 42 oC, e introducimos all durante 50 segundos exactos.
Asegurndonos de colocar bien la gradilla para que el fondo de los tubos est en
contacto con el agua. Pasados los 50 segundos, llevamos de nuevo los tubos al
hielo. El cambio de hielo al bao mara y viceversa lo hicimos con rapidez. Dejamos
los tubos en el hielo 2 minutos.
9. Sacamos la gradilla del hielo y dejarla en la mesa. Abrimos uno de los tubos, y
con una nueva pipeta estril, aadimos 250 ml de caldo LB al tubo y lo cerramos.
Repetimos la operacin con otra pipeta estril en el otro tubo. Dejamos incubar los
tubos 10 minutos a temperatura ambiente.

10. Agitamos los tubos golpendolos con el dedo. Con una pipeta estril para cada
tubo, pasamos 100 ml de cada tubo a las placas correspondientes.

11. Despus sembramos Usando un asa de siembra estril para cada tubo,
extender el lquido por toda la superficie de la placa, haciendo estras en el agar en
todos las direcciones.
12. por ltimo hicimos una columna con las placas sujetndolas con cinta adhesiva.
Las etiquetamos por la placa inferior, y metimos en la incubadora a temperatura
ambiente en posicin invertida hasta el da siguiente.

13.- para finalizar al da siguiente revisamos los resultados, esperando un da mas

para que se observaran mejor.