Visoka zdravstveno sanitarna kola strukovnih studija

Visan, Beograd
Predmet: Hemija

Kolorimetrijska i spektrofotometrijska metoda

Seminarski rad

Mentor: Student:
Prof. dr Tatjana Marinkovi Dajana Budimir, 2-VI/2016

U Beogradu,
Novembar, 2016.
 SADRAJ

1.UVOD ................................................................................................................................................... 1
2. KOLORIMETRIJSKA METODA ............................................................................................................... 2
3. SPEKTROFOTOMETRIJSKA METODA ................................................................................................... 5
4. EMA SPEKTROFOTOMETRA............................................................................................................... 6
5. DERIVATIVNA SPEKTROFOTOMETRIJA................................................................................................ 7
5.1. OPTIKA METODA ........................................................................................................................ 8
5.2. ELEKTRONSKA METODA ............................................................................................................... 8
5.3. MATEMATIKE METODE .............................................................................................................. 9
6. PRECIZNOST ODREIVANJA max....................................................................................................... 12
6.1. Poveanje rezolutivnosti ............................................................................................................ 12
7. SPEKTROFOTOMETRIJA U SUSPENZIJAMA I MUTNIM RASTVORIMA ............................................... 13
8. KVANTITATIVNA ANALIZA ................................................................................................................. 14
9. ZAKLJUAK ........................................................................................................................................ 15
10. LITERATURA .................................................................................................................................... 16
 1.UVOD

Apsorpcione metode se zasnivaju na merenju smanjenja intenziteta elektromagnetnog

zraenja usled apsorpcije pri prolasku kroz ispitivanu supstancu . Apsorbovano zraenje
dovodi do energetskih promena u atomima, molekulima i jonima ispitivane supstance.
Apsorpcija vidljivog i ultraljubiastog zraenja dovodi do elektronskih prelaza, koji su u
molekulima i njihovim jonima kombinovani sa nizom vibracionih i rotacionih prelaza.
Infracrveno zraenje zbog svoje male energije, dovodi samo do promena vibracione i
rotacione energije molekula. Apsorpcijom zraenja molekul moe prei iz osnovnog stanja na
neki od mnogobrojnih vibracionih i rotacionih nivoa odreenog pobuenog stanja. Energije
fotona koji se tom prilikom apsorbuju vrlo se malo razlikuju tako da se apsorpcioni spektar
molekula sastoji iz stotine pa i hiljade linija, koje su tako blizu jedna drugoj, da se javljaju
kao kontinualne apsorpcione trake.
Merenje apsorbancije se izvodi radi:
- odreivanja koncentracije supstance,
- prouavanja hemijskih reakcija,
- identifikacije supstance,
- ispitivanje strukture molekula i
- odreivanja razliitih supstanci.
Apsorpcione optike metode moemo podeliti u tri grupe:
-Kolorimetriju
- Apsorpcionu spektrofotometriju
-Atomsku apsorpcionu spektrofotometriju .

1
 2. KOLORIMETRIJSKA METODA

* Kolorimetrija je nastala od latinske rei color to znai boja i metria to znai

merenje.
* Kolorimetrija je vizuelna metoda kojom se na osnovu intenziteta boje rastvora moe
odrediti njegova koncentracija. U tu svrhu koriste se instrumenti kolorimetri.
Pomou kolorimetara se vri poreenje intenziteta boje ispitivanog rastvora i rastvora
standarda.
* Kao indikator se koristi ljudsko oko, iz tog razloga se ova metoda ne moe smatrati
dovoljno tanom. Danas su ovi instrumenti potisnuti iz laboratorija savremenim fotometrima
i spektrofotometrima.
* Boja je vizuelni utisak koji se stvara u oku, a javlja se kao posledica selektivne apsorpcije
svetlosti odgovarajuih talasnih duina upadne svetlosti.
Ako predmet, osvetljen belom svetlou (vidljivi deo spektra), ostavlja utisak ute boje znai
da je propustio uti deo, odnosno apsorbovao je plavi deo vidljivog spektra. Ako predmet
izgleda beo, znai da je upadna svetlost svih talasnih duina podjednako proputena ili
reflektovana. Naprotiv, ako je predmet crn, znai da je apsorbovao upadnu svetlost svih
talasnih duina.
* Kolorimetrijskim metodama se odreuju koncentracije obojenih rastvora, koji se apsorbuju
vidljivom ili bliskom UV delu spektra.
Boja koju ima rastvor neke supstance komplementarna je boji koju ta supstanca apsorbuje.
(slika 1).

(slika 1) - Boja koju ima rastvor neke supstance komplementarna je boji koju ta supstanca apsorbuje.

U kolorimetriji se uvek radi sa polihromatskim zraenjem, to iskljuuje mogunost

kvalitativne analize.
Da bi se supstanca mogla odrediti kolorimetrijski mora ispunjavati sledee uslove:
Intenzitet boje mora biti stabilan u duem vremenskom intervalu.
Boja mora biti intenzivna.
Apsorpcija zraenja mora da se pokorava Lambert Beerovom zakonu.

2
 * Male promene temperature, ph i drugih faktora ne smeju bitno da utiu na intenzitet
boje. Ukoliko je intenzitet neke boje nedovoljan onda se dodatkom pogodnog reagensa moe
prevesti u intenzivnije obojeno jedinjenje.

* Reagens u kolorimetriji mora da poseduje sledee osobine:

Reagens treba da reaguje stehiometrijski sa ispitivanom supstancom i uvek treba
dodati dovoljnu i istu koliinu reagensa u ispitivane rastvore i standarde.
Reagens ne sme da apsorbuje u vidljivom delu spektra.
Reagens mora biti selektivan u odnosu na ispitivanu supstancu.
Boja nastalog proizvoda mora se brzo razvijati.
Reagens ili ispitivana supstanca ne smeju da stupaju u reakcije sa drugim sastojcima u
rastvoru koji ih mogu prevesti u neaktivne oblike ili kompleksno jedinjenje zbog ega
bi izostalo razvijanje boje.

* U kolorimetriji se obino intenzitet boje nepoznatog rastvora uporeuje sa jednim ili

vie standardnih rastvora poznate koncentracije.
* Prema tehnici rada kolorimetrijske metode delimo na:
Metode standardne serije;
Metode balansiranja;
Metode kolorimetrijske titracije.

* Aparati koji se koriste u kolorimetriji su jednostavne konstrukcije i kao izvor svetlosti

koriste belu svetlost.
* Tipini kolorimetrijski aparati su:
1. Helligeov komparator (slika 2).
2. Duboscquov kolorimetar (slika 3).

Slika 2. Helligeov komparator Slika 3. Duboscquov kolorimetar

3
 * Optika ema fotoelektrinog kolorimetra - (slika 4).

(slika 4)

Kolorimetrijske metode pripadaju grupi instrumentalnih metoda, a zasnivaju se na

optikim sojstvima rastvora bojenih supstanci. Obinim posmatranjem moe se zapaziti da
obojene supstance pri rastvaranju, sa poveanjem koncentracije, daju sve intenzivnije obojen
rastvor.
Ovakvo zapaanje predstavlja individualni vizuelni doivljaj, to zapravo boja i jeste.
Meutim, uz primenu zakona apsorpcije svetlosnog zraenja u takvim rastvorima koja je u
vezi sa koncentracijom rastvorene supstance, moe se uspostaviti matematika zavisnost na
osnovu koje dolazi do koncentracije rastvorene supstance.

* Kolorimetrijske metode ne spadaju u visoko tane analitike metode, ali su

veoma lake i jeftine za izvoenje to je veoma est uslov primene u brzim industrijskim
analizama kojima se prati proces u pojedinim fazama. Ove metode, prema opte
prihvaenoj podeli, svrstavaju se u metode apsorpcione spektroskopije.

4
 3. SPEKTROFOTOMETRIJSKA METODA

* Spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja se zasniva na praenju zavisnosti

apsorbance ili apsortiviteta od talasne duine zraenja koje je prolo kroz analiziranu
supstancu.

* Apsorpcija se moe pratiti u UV, Vis, IC, mikrotalasnoj i radiofrekventnoj oblasti.

* U analitikoj hemiji su od interesa oblasti od 200-1000 nm, a u organskoj analizi jo i IC

oblast, EPR i NMR spektroskopija.

* Spektrofotometrija je kvalitativna i kvantitativna analiza.

*Kvalitativna analiza se zasniva na injenici da apsorpcioni spektar supstance zavisi od

njenog sastava i strukture.

*Na osnovu zavisnosti apsortiviteta od talasne duine i vrednosti apsortiviteta na odreenoj

talasnoj duini mogue je identifikovati apsorbujuu supstancu.

* Kvantitativna analiza sa zasniva na Beerovom zakonu:

A = a b c
* Kod spektrofotometra b je jednako debljini kivete i konstantno je i onda apsorbanca zavisi
samo od koncentracije i apsortiviteta.

*Da bi se postigla mogua tanost i osetljivost apsorbance bitan je izbor talasne duine
merenja.

* Ona mora da ispuni sledee uslove:

-Da se merenjem postie maksimalna osetljivost;

-Da male promene talasne duine ne utiu na reproduktivnost :
-Da vai Beerov zakon.
Na osnovu ovih zahteva merenje apsorbance se izvodi na:
-na talasnoj duini gde je apsorbanca maksimalna max
-na talasnoj duini optimalne apsorbance, opt i
-na talasnoj duini izobestike take, izob

izob kada dva oblika imaju istu apsorbancu (kiseli i bazni indikator).

5
4. EMA SPEKTROFOTOMETRA
(slika 5)

Slika 5 ema spektrofotometra

6
 5. DERIVATIVNA SPEKTROFOTOMETRIJA

* Derivativna spektrofotometrija je relativno nova metoda ija je primena u poslednje

vreme jako porasla pre svega zahvaljujui razvoju raunarske tehnike.
* Primena derivativne spektrofotometrije:
-Pogodna je pri analizi viekomponentnih sistema.
-Kvantitativno odreivanje tragova u viekomponentnim sistemima.
-Karakterizaciju istih supstanci.
-Eliminie ili smanjuje apsorbancu pozadine ime omoguava odreivanja u
suspenzijama, mutnim rastvorima.
-Derivatizacijom osnovnog spektra mogue je tanije odrediti talasne duine
maksimuma irokih apsorpcionih traka.

* Dobijanje derivativnih spektara:

-Optiki
-Elektronski
-Matematiki

* Optiki:
Najmanje se smanjuje odnos signala i uma
* Elektronski:
Lo odnos signala i uma, moe se koristiti samo do etvrtog izvoda
* Matematiki:
Koristi se polinomska interpolacija, Furijeva transformacija.

7
5.1. OPTIKA METODA

Optika metoda dobijanja derivativnih spektara se sastoji u modulaciji

elektromagnetnog zraenja u nekoj oblasti talasnih duina, koja se naziva interval modulacije

Ispred monohromatora se postavi kvarcna ploica koja vibrira napred - nazad za

nekoliko stepeni i samim tim izvodi modulaciju talasne duine upadnog zraenja po
sinusoidalnom zakonu.

d sin 2t

* Rezultujui signal se detektuje elektronski, detektorom koji je podeen na

frekvenciju vibracije ploice v .

* Amplituda rezultujueg modulisanog snopa bie proporcionalna nagibu apsorpcione

trake unutar modulacionog intervla, a samim tim i prvom izvodu spektra, pod uslovom da je
modulacioni interval dovoljno mali u odnosu na irinu trake.

5.2. ELEKTRONSKA METODA

Elektronska metoda derivacije sastoji se od povezivanja elektrinog kola sa
otpornikom i kondenzatorom (RC) na analogni izlaz detektora pomou operacionog
amplifikatora.

Ovde se dobija izvod u funkciji vremena, dA/dt, ali se na osnovu poznate brzine
skeniranja moe izraunati izvod apsorbance po talasnoj duini.

dA dA d

d dt dt

Kod ovakvog naina dobijanja derivativnih spektara veliki uticaj imaju instrumentalni
parametri kao to su brzina skeniranja spektra, irina razreza, veliina pojaanja. Pored toga
svaki RC ureaj smanjuje odnos signala prema umu za 2 to ograniava metodu do etvrtog
izvoda.

8
5.3. MATEMATIKE METODE

Matematike metode derivacije se danas najvie koriste.

Diferenciranje osnovnog spektra se izvodi bilo snimanjem spektra taku po taku

(neregistrujuim ureajem ili ureajem sa jednim zrakom) i primenom formula za numeriko
diferenciranje tako dobijenih vrednosti A=f() ili digitalizacijom spektra snimanjem
registrujuim spektrofotometrima i primenom interpolacije i diferenciranja.

Najee se koristi polinomska interpolacija, Furierova transformacija i interpolacija

pomou splajnova.
Nakon toga se, pomou odgovarajuih numerikih algoritama ovako dobijene interpolacione
formule diferenciraju potreban broj puta.

Razlika absorbanci za dve bekonano bliske talasne duine 1 i 2 u osnovnom

spektru,

A= f(), podeljena veliinom spektralnog intervala =2-1, predstavlja prvi izvod tog
spektra.

A A
lim f ( )

Daljim diferenciranjem dobijamo:

dnA
f n ( )
dn

Ako ovo primenimo na apsorpcionu traku gausovog oblika onda dobijam derivativne
spektre.
Derivativni spektri neparnog rada imaju malo slinosti sa originalnim spektrom i sloeniji su
od njega.
Ono to je bitno za ove izvode je da prolaze kroz nulu (seku osu talasne duine) apsorptivnog
maksimuma to daje osnovu za kvalitativnu analizu.
U praksi se od neparnih spektara koriste samo spektri prvog reda. (slika 6)

Slika 6 Spektar prvog reda.

9
 Derivativni spektri parnog reda imaju centralnu traku (pik) promenjivog znaka (u
drugom izvodu negativan, u etvrtom pozitivan), praenu sa dve satelitske trake suprotnog
znaka i znatno manjeg intanziteta od centralne trake. (slika 7)

Slika 7 Derivatni spektar parnog reda.

* Maksimumi apsorpcije u osnovnom spektru odgovara maksimumu centralne trake

parnog reda. Poluirina te trake znatno je manja nego na osnovnom spektru i traka je ua
ukoliko je red spektra vei pa parni izvodi imaju veu primenu od neparnih. Osnovna osobina
izvoda je da su amplitude uih traka relativno vee od amplituda irokih traka.
* Za n-ti izvod bilo gausovske ili lorencovske irine trake amplituda pika je povezana sa
n-tim stepenom reciprone vrednosti irine trake, u osnovnom spektru, D (1 / w n )
n

Zbog toga za trake istih apsorbanci a razliitih irina u osnovnom spektru, amplituda
ue trake u derivativnom spektru je vea od amplitude ire trake za faktor koji raste sa
porastom reda izvoda . (slika 8).

n
D (1)
w2
( 2)

D w1

10
 Slika 8 Derivativna tehnika

Nedostatak derivativne tehnike da odnos signala prema umu postaje loiji

progresivno sa poveavanjem izvoda. Zbog toga se javlja potreba da se izvede ravnanje
spektra kako bi se ovaj odnos poboljao i um sveo na najmanju meru . U tu svrhu se koriste
razliiti numeriki algoritmi od kojih su najpoznatiji metode - A. Savitzkog i E. Golaya,
metoda Furijerove transformacije i metoda splajn aproksimacije.
Nedostatak derivativne tehnike da odnos signala prema umu postaje loiji progresivno sa
poveavanjem izvoda.
Zbog toga se javlja potreba da se izvede ravnanje spektra kako bi se ovaj odnos poboljao i
um sveo na najmanju meru.
U tu svrhu se koriste razliiti numeriki algoritmi od kojih su najpoznatiji metoda A.
Savitzkog i E. Golaya, metoda Furijerove transformacije i metoda splajn aproksimacije.

Visok odnos signala prema umu mora se postii pri nekom dozvoljenom nivou deformacije
spektra s obzirom da se pri velikoj filtraciji uma poveavaju sistematske greke. (slika 9).

Slika 9 - Drugi izvod spektra metil-digoksima snimljen na spektrofotometru Cary 3 Varian.

11
 6. PRECIZNOST ODREIVANJA max

Kada se apsorpcioni spektar sastoji od irokih traka taan poloaj maksimuma

apsorpcije moe se odrediti samo aproksimativno.

Na max prvi izvod prolazi kroz nulu tako da se talasna duina maksimuma apsorpcije moe
odrediti veoma precizno.

6.1. Poveanje rezolutivnosti

Primenom derivativnih spektara mogu se razdvojiti trake koje se preklapaju i ne mogu
se razdvojiti niti razlikovati u osnovnom spektru. (slika 10).

Slika 10 - Prvi i drugi izvod dve preklapajue Gaussovske trake

12
 7. SPEKTROFOTOMETRIJA U SUSPENZIJAMA I MUTNIM
RASTVORIMA

* Mutni rastvori i suspenzije ili emulzije jako oteavaju spektrofotometrijsku analizu

* Zbog rasipanja zraenja koje raste sa smanjenjem talasne duine na spektar uzorka se
superponira manji ili vei intenzitet pozadine, a pored toga se gubi i intenzitet samog spektra
* Zbog rasipanja zraenja na nehomogenostima sredine primena derivativnih spektara
eliminie uticaj fona na spektar analiziranog uzorka.( slika 11).

Slika 11 - Apsorpciona traka u rasipajuoj sredini i njen prvi izvod (a) Gaussovska traka (b)
prvi izvod.

Spektar uzorka traka (A), Spektar pozadine traka(B), traka uzorka + pozadina (C) i
odgovarajui prvi izvodi.

13
 8. KVANTITATIVNA ANALIZA

Kod kvantitativne derivativne spektrofotometrije meri se samo amplituda trake u

derivativnom spektru u zavisnosti od koncentracijie jer je koncentracija linearno povezana sa
amplitudom n-tog izvoda.
d n A d na
c b
dn dn
Merenja amplitude mogu biti rezultat raunarskog izraunavanja, ali moe da se izvede i
gafiki, a vaenje Lamber-Beerovog zakona kao i aditivnost apsorbance se podrazumeva.
* Za odreivanje amplitude koriste se sledee metode:

-piki-pik metoda, kod koje se meri rastojanje izmeu maksimuma i njemu

odgovarajueg minimuma.
-metoda tangente, kada se povlai tangenta izmeu dva susedna maksimuma (ili
minimuma) i meri rastojanje izmeu tangente do maksimuma (ili minimuma) izmeu tih
maksimuma paralelno sa ordinatom.
-pik - nula metoda, gde se meri rastojanje od maksimuma ili minimuma do apscise
paralelno sa ordinatom.
Ova metoda se koristi kod spektara vieg rada koji imaju simetrine pikove u odnosu na
apscisu (spektri prvog reda).(slika 12).

Slika 12 - Obrada derivativnog spektra. Metoda tangente (t), pik-pik metoda (p) i pik-nula
metoda (z).

14
 9. ZAKLJUAK

Kolorimetrija je vizuelna metoda kojom se na osnovu intenziteta boje rastvora moe

odrediti njegova koncentracija. U tu svrhu koriste se instrumenti kolorimetri, pomou kojih
se vri poreenje intenziteta boje ispitivanog rastvora i rastvora standarda.
Spektrofotometrijska metoda izuava apsorpciju tano definisanog monohromatskog zraenja
dobijenog specijalnim prizmama i reetkama.
Za merenje apsorpcionih spektara koriste se optiki instrumenti spektrofotometri.
Kolorimetrijske i spektrofotometrijske metode pripadaju grupi instrumentalnih metoda, a
zasnivaju se na optikim sojstvima rastvora bojenih supstanci. Obinim posmatranjem moe
se zapaziti da obojene supstance pri rastvaranju, sa poveanjem koncentracije, daju sve
intenzivnije obojen rastvor.
Ovakvo zapaanje predstavlja individualni vizuelni doivljaj, to zapravo boja i jeste.
Meutim, uz primenu zakona apsorpcije svetlosnog zraenja u takvim rastvorima koja je u
vezi sa koncentracijom rastvorene supstance, moe se uspostaviti matematika zavisnost na
osnovu koje dolazi do koncentracije rastvorene supstance.

15
 10. LITERATURA

1. Medenica, M., Maleev D. (2002). Eksperimentalna fizika hemija. Beograd:

Farmaceutski fakultet.

2. https://www.chem.bg.ac.rs/.../TEMA%209f- KOLORIMETRIJA%20I%20SPEKTROFOTOMETRIJA.ppt

3. file:///C:/Users/PC/Downloads/Predavanje+3a%20(6).pdf

4. http://www.vtssa.edu.rs/download/Kolorimetrija_i_fotometrija.pdf

5. supa.pharmacy.bg.ac.rs/courses/175/posts

16