PRCTICA 01

DETERMINACIN DE BIOMASA: RECUENTRO MICROSCPICO EN CMARA DE

NEUBAUER

I. INTRODUCCIN:

En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el nmero de microorganismos

presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en estudio de curvas de crecimiento,
anlisis de alimentos, preparaciones de inculos para fermentacin, etc.
Un parmetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de plantas de agroindustriales
dedicadas a procesos de fermentacin, panificacin entre otros en donde se utilicen inculo es la
concentracin de biomasa. Biomasa es un trmino general que se refiere a los microorganismos
presentes en un sistema. Existen muchas maneras de medir la concentracin de biomasa, como por
ejemplo masa, volumen, extensin linear de filamentos, dispersin de luz, conteo de clulas u
organelos.
Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos o peso (biomasa) de
clulas microbianas en un cultivo; los mtodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos se
puede mencionar a la determinacin de peso seco y el recuento de clulas en cmara de Neubauer. El
mtodo de cuenta directa en cmara tiene la ventaja de ser muy rpido y econmico, aunque no se
pueden distinguirlas clulas viables y no viables. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la
observacin y cuantificacin se dificultan en clulas muy pequeas (1 5 m) o en poblaciones de
baja densidad debido al pequeo volumen de muestra que se utiliza (0.1 0.2 mm3).
A pesar del enorme desarrollo tecnolgico que ha tenido lugar en los laboratorios cientficos, el conteo
visual con hematocitmetro o cmara de Neubauer sigue siendo el mtodo de conteo ms extendido
desde el siglo XIX.

II. OBJETIVOS:
Determinacin de la biomasa celular, utilizando la biomasa de una poblacin de
Saccharomyces Cerevisiae MIT-L51, siguiendo los procedimientos de recuento
microscpico en la cmara de Neubauer.
Conocer los diferentes mtodos de determinacin de biomasa entre ellos el mtodo por
conteo en la cmara de Neubauer.

III. FUNDAMENTO TERICO:

Biotecnologa de los PAI IX Ciclo Ing. Agroindustrial

La biomasa es la cantidad de materia viva producida en un rea determinada de la superficie terrestre,

o por organismos de un tipo especfico, en este caso los microorganismos, siendo una variable
ecolgica importante porque representa la cantidad de energa almacenada en un segmento partculas
de una comunidad biolgica.

La determinacin de la biomasa es una de las variables ms importantes en un bioproceso, porque su

determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia del mismo. Muy til para establecer las
tazas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los balances dems de cualquier proceso
biolgico.

3.1. MTODOS PARA LA DETERMINACIN DE BIOMASA

Los mtodos que cuantifican la cantidad de clulas son tiles principalmente para enumerar
organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden
utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difcil
cuantificar las clulas individuales.

3.1.1. MTODOS INDIRECTOS DE DETERMINACIN DE LA BIOMASA

Estos mtodos se basan fundamental mente en la determinacin de algn componente celular
especfico, en la cuantificacin de alguna actividad enzimtica (mtodos bioqumicos) o en la medida
de consumo de sustrato o de la formacin de algn producto (mtodos cinticos). Tambin se incluyen
los mtodos fisicoqumicos (Arnaiz et al, 2000)

A. ATP
La medida de ATP puede usarse para calcular la biomasa microbiana, sin embargo existen
dificultades para el clculo exacto pues en algunos casos la concentracin de ATP cambia segn sus
condiciones alteradas como las nutricionales y fisiolgicas.
La mejor medida sera la cantidad total de compuestos adenilados: A: ATP+ ADP + AMP
Esto se calcula con el fin de calcular la carga energtica; EC: (ATP + ADP)/ (ATP + ADP + AMP)
Esta carga energtica es una medida del estado fisiolgico de los microorganismos presentes en la
muestra.

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B. CIDOS NUCLEICOS
El ADN y el ARN son dos componentes de las bacterias cuya sntesis es proporcional a la tasa de
crecimiento. Mientras que las concentraciones de ARN varan considerablemente con el estado
fisiolgico celular, la cantidad de ADN es relativamente ms constante. La cantidad de ADN se
determina mediante espectrofotometra, tras su extraccin y purificacin. Existen diversas tcnicas,
si bien presentan la desventaja de que los procedimientos de purificacin son complejos, con diversas
interferencias y bastante costosos

C. COMPONENTES DE LA PARED CELULAR

La mayora de las bacterias poseen cido murmico en su pared celular, y esta es la herramienta til
para la determinacin de la biomasa microbiana. Este mtodo se basa en la liberacin de lactato por
parte del cido murmico y posteriormente el anlisis qumico para determinar la concentracin de
dicho lactato. La conversin de la medida de cido murmico (MA) en biomasa indica que las
bacterias Gram positivas presentan una proporcin de 44g MA/mg C y las Gram negativas 1244g
MA/mg C.

D. LPIDOS
Los lpidos son un componente fundamental de las membranas celulares. Su determinacin para la
estimacin de la biomasa de una poblacin bacteriana ofrece muchas ventajas sobre otros mtodos.
La principal ventaja es su alto contenido especfico y que se encuentran en cantidades relativamente
constantes, no forman parte de las reservas celulares y se degradan rpidamente durante la lisis
bacteriana. Aproximadamente, entre un 90-98 % de los lpidos de las membranas celulares est en
forma de fosfolpidos.
Las tcnicas de anlisis se basan, fundamentalmente, en la extraccin celular de los fosfolpidos con
un disolvente orgnico, su posterior hidrlisis cida para liberar el fosfato y, por ltimo, 1a
determinacin colorimtrica de ste. Son tcnicas relativamente sencillas, reproducibles y sensibles
(de 0,1 a 1 nmol de fosfato)

E. CLOROFILA

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La biomasa de los microorganismos fotosintticos se determina a partir de la determinacin de

la clorofila. Esta se puede extraer con disolvente como la acetona o el metanol, y cuantificarse
midiendo su absorbancia en un espectrofotmetro a una longitud de onda de 665nm.
F. PROTEINA
Las protenas son fcilmente cuantificables, y estas con grupos hemo pueden ser detectadas
especficamente mediante quimioluminiscencia. Esta determinacin es apropiada solamente cuando
se encuentra solamente una poblacin.

3.1.2. MTODOS DIRECTOS DE DETERMINACIN DE LA BIOMASA

Los mtodos clsicos de determinacin de biomasa son mtodos directos que se basan en el nmero
de clulas o en el peso celular. Los mtodos de enumeracin celular, son mtodo de
observacin, basados en propiedades fsicas o en la actividad biolgica:

A. MTODOS GRAVIMTRICOS
La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en trminos de peso seco por
unidad de volumen, ya sea como slidos en suspensin totales (SST) o slidos en suspensin
voltiles (SSV). Las clulas se separan del lquido bien por centrifugacin bien por filtracin. La
principal desventaja de estas tcnicas es que su determinacin incluye no slo microorganismos
activos sino microorganismos muertos, material inerte, polmeros extracelulares y materia orgnica
adsorbida. Adems, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los mtodos
gravimtricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles.

B. MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS
Se basan en la existencia de una relacin directa entre el nmero total de microorganismos presentes
en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinacin de la turbidez de la suspensin celular
mediante espectrofotometra, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes
de utilizar la turbidez como mtodo de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione
medidas directas (microscpicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez.
Esta recta contiene datos sobre el nmero de clulas, permitiendo la estimacin de tal parmetro a
partir de una sola medida de la turbidez. Se trata de mtodos rpidos, pero de baja sensibilidad y que

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presentan problemas de calibracin (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con

partculas.

C. MTODOS MICROSCPICOS DE RECUENTO CELULAR EN CMARAS

El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrcula central de la cmara y se multiplica por
la profundidad, obtenindose el nmero de microorganismos por unidad de volumen (nmero de
clulas. ml-1, generalmente).
El recuento de microorganismos en cmaras no es un mtodo muy exacto debido a las irregularidades
en la distribucin de la muestra. Adems. Pueden confundirse las clulas con otras formas orgnicas
e inorgnicas existentes en el medio y no permite distinguir clulas vivas de clulas muertas.
Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas microscpicas dispersas
en un fluido. Habitualmente ser necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la
suspensin como el porcentaje de estas que son viables. Para determinar la densidad de las clulas
se emplean diferentes tcnicas, desde la relativamente simple cmara de contaje celular de la que
existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cmara de Neubauer), hasta equipos
automticos de contaje celular como el Cell Coulter.

Contador celular: El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la
resistencia elctrica que se producen cuando una partcula no conductora en suspensin en un
electrolito atraviesa un pequeo orificio, una pequea abertura en los electrodos es la zona sensible
a travs de la que pasan las partculas que se encuentran en suspensin. Cuando una partcula
atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medio
como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partcula.
Controlando la cantidad de la suspensin que circula a travs del orificio es posible contar y medir
el tamao de las partculas. Es posible contar y medir varios miles de partculas por segundo,
independientemente de su forma, color y densidad.

Cmara de Neubauer: Es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al

de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la
cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadricula como la que se ve en la imagen.
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Es un cuadro de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues
el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del
cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre el
cubreobjetos este dista de la superficie marcada 0.1 mm, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 mm3, es decir 0.1 microlitro.

Si contamos las cuatro reas sombreadas (L) observando un total de x clulas entre las cuatro reas,
la concentracin en la suspensin celular ser:
x
Consentracion de la (celulas/ml) = 10000 ( )
4

En la imagen se puede observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el
microscopio se ven como un cuadricula de 16 pequeos cuadrados de 0.25 milmetros de lado.

Para determinar la variabilidad celular se emplean diferentes mtodos. El ms comn es el de tincin

con azul de tripn. El azul de tripn es un coloide que se introduce en el interior de las clulas que
presentan roturas en la membrana. As pues las clulas que aparecen en la imagen, claramente de color
azul, son consideradas no viables. Asimilar clulas blancas, por exclusin, a clulas viables es un error
pues por este mtodo se sobrevalora la viabilidad de las clulas en la suspensin, determinando como
inviables solo aquellas con la membrana rota.

D. MTODOS MICROSCPICOS MEDIANTE EPIFLUORESCENCIA

La epifluorescencia es debida a un agente fluorocromo, a la adicin de algn anticuerpo marcado
con fluorescencia (inmunofluorescencia) o a una autofluorescencia natural debida a la existencia de
algn componente celular autofluorescente, el procedimiento consiste en la tincin de las bacterias
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con dicho agente y posterior recuento mediante microscopa ptica con iluminacin de
epifluorescencia. Los sustratos fluorescentes o fluorocromos que se han empleado para la
observacin directa de bacterias se clasifican en dos grupos. En el primero de ellos quedaran
englobados aquellos fluorocromos que tras ser adsorbidos actan especficamente sobre cidos
nucleicos u otros componentes celulares. El segundo incluira a todos aquellos que tras ser sustratos
de una determinada actividad metablica, son convertidos en molculas fluorescentes.
3.1.3. MTODOS BIOQUMICOS
Los ensayos enzimticos son simples de realizar y sus resultados se obtienen rpidamente, el
equipamiento no es costoso ni complejo. La mayora de las medidas de actividad enzimtica se realiza
mediante la conversin de sustratos especficos a productos coloreados que son cuantificados
fotomtricamente. La principal desventaja de los mtodos bioqumicos es la variacin de las
actividades enzimticas celulares con los cambios fisiolgicos y que, una vez que los
microorganismos mueren, las enzimas liberadas pueden seguir activas. Entre las distintas medidas de
la actividad enzimtica cabe destacar: actividad esterasa y actividad deshidrogenasa.

3.1.4. MTODOS CNTICOS

La base de estos mtodos es la medida del consumo de sustrato o de la formacin de producto en
ensayos en discontinuo. El ejemplo ms tpico en microorganismos aerobios es la determinacin de
la DBO, que indica la biodegradabilidad de un sustrato en disolucin a travs del consumo de oxgeno
del medio.

IV. MATERIALES Y MTODOS:

4.1. MATERIALES:
4.1.1. Material Biolgico:
Saccharomyces Cerevisiae MIT-L51
4.1.2. Material de vidrio:
Pipetas Pasteur 1 y 10 ml
Fiola de 25 ml
Tubos de ensayo
Goteros
4.1.3. Equipos e Instrumentos:

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Cmara de Neubauer con porta objetos

Microscopio
Balanza analtica y digital.
4.1.4. Reactivos:
Azul de metileno
4.2. METODOLOGA:

4.2.1. Preparacin de la muestra:

Se pes 0.5 g del material biolgico: Saccharomyces Cerevisiae MIT-L51
Se prepar la suspensin madre con los 0.5 gramos de levadura en 10 ml de agua destilada
Se hicieron las diluciones a 10 -1 y 10-2 (1 ml de la muestra en 9 ml de agua destilada)

Se coloreo las muestras con azul de metileno, se carga la pipeta y se agrega una gota.

4.2.2. Conteo en Cmara de Neubauer

Se limpi la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
Se revis la laminilla de cuarzo que no est desbordada o quebrada.
Se coloc la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, esta debe quedar
centrada.
Se procedi a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribucin
de las clulas.
Conteo: se llev la cmara al microscopio y se enfoc el cuadro de conteo con el ocular de
4X y luego de 10 X , se observ lo siguiente:

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Muestra: 4X Muestra: 10 X
En esta cuadricula se observ 25 cuadros, de los cuales se cuentan las clulas presentes en
5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza
un conteo aleatorio.
Para realizar el conteo se pas al ocular de 40X, donde se observ cada uno de los campos
y con ayuda del carro del microscopio se desplaz la cuadricula hasta contar en todos los
cuadros. El conteo en estos campos de la cmara se conoce como AP (alto poder). Con el
lente de 40X cada cuadro se vio de la siguiente manera:

Las clulas se contaron cuadro por cuadro y se hizo un total (promedio de cada cuadrado).
Despus de contar las clulas se procedi a calcular el nmero de clulas por unidad de
volumen. Para esto se utiliza el rea de cada cuadro, el espacio ocupado por el lquido en
el que estn las clulas que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cmara y
la laminilla de cuarzo, tambin se calcul se calcul la desviacin estndar y el coeficiente
de variacin.

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V. RESULTADOS:
5.1. Lectura de la biomasa de 5 muestras en el Retculo de Thoma en la cmara de
Neubauer.

5.2. Resultado del conteo de la biomasa de 5 muestras del Retculo de Thoma en la cmara
de Neubauer.

16 21 21 27 35 22 12 8 20 18 20 27 23 25 22 28 25 21 26 27
17 23 21 26 35 21 16 27 16 17 18 16 26 19 23 22 27 29 20 26
22 18 32 28 26 20 22 19 15 28 27 23 22 23 20 15 20 30 20 23
19 23 25 16 21 15 23 17 16 14 13 23 21 20 22 20 22 28 25 19

Tabla 01. Resultado del conteo de 5 muestra de las 25 celdas de la cmara de Neubauer
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Desviacin
Xi (Xi X)2 Concentracin de Clulas CV
Estndar ()
22.1875 0.150156
X =21.79 Clulas
21.1875 0.375156
21.8 clulas 1 1.74
19.4375 5.581406 X= = 100 = 7.99 %
(0.2)(0.2)(0.1)mm3 101 21.79
21.9375 0.018906 = 1.74
X = 5,45 107 /

24.25 6.0025

VI. DISCUSIONES:

En la prctica se desarroll la medicin de la biomasa microbiana de la levadura de la levadura

Sacharomyces Cerevisae por conteo directo en cmara Neubauer tomando una muestra de
dilucin de 10-1 pro lo que los resultados que obtuvimos se muestran en la tabla 01 de las 5
muestra analizadas al azar, no arrojaron una concentracin de clulas de 5.454 x107 clulas
de levadura/ml, es decir que la dilucin indica que la muestra original (muestra madre) cumpli
con los aspectos necesarios para un buen conteo de biomasa.
Segn Rodrguez at al 2005, los mtodos para estimar el nmero de microorganismos medir
la cantidad de clulas. Los mtodo que cuantifican la cantidad de clulas son tiles
principalmente para aumentar organismos como bacterias o levadura, mientras los que miden
la masa o actividad celular pueden utilizarse para todo los microorganismos, incluidos los
hongos filamentosos, en los que es difcil cuantificar las clulas individuales. Segn lo
expuesto por el autor en nuestra prctica hicimos el conteo de Levaduras Sacharomyces
Cerevisae por mililitro, para la determinacin de biomasa utilizando el mtodo directo por
recuento microscpico en la cmara de Neubauer.
Segn Valencia (2001), la desviacin estndar es el promedio con respecto a la media
aritmtica, el autor expresa que cuanto tienden a alejarse de los valores puntuales del promedio
es una distribucin. El coeficiente de variacin indica un mtodo de comparacin de datos que
tienen medidas de media diferentes o unidades diferentes como vemos en la tabla 01, en el
clculo de la cmara de Neubauer se obtuvo una desviacin estndar es de 1.74 con un

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coeficiente de variacin de 7.99 % siendo este valor menor a 30 % por lo tanto se dice que los
valores son homogneos y la muestra es representativa.
Segn Unam, 1986, en la tcnica de conteo de clulas hay que tener en cuenta que en esta
tcnica uno de los factores que afecta la observacin de las clulas de levadura es la correcta
dilucin de la muestra empleadas, se puede decir que si durante el conteo se observa
aproximadamente 69 clulas la muestra se encuentra muy concentrada, mientras que si se
observa menos de 20 clulas la muestra se encuentra muy diluida. En nuestra practica la
muestra nos arrojaron valores de un total de clulas 21 clulas/ml en las cinco muestra contadas
a azar, por lo que podemos decir que la dilucin de 10-1 que se hizo en la prctica estuvo bien
diluida ya que es menor de 69 y mayor a 20 clulas dichas por el autor.
Segn Aquiahuati M. (2004), la cmara de Neubauer permite hacer un recuento superficial de
las clulas de levadura, sin embargo no permite distinguir las clulas viables de las no viables,
por lo tanto podemos decir que este sera una desventaja de este mtodo si queremos tener
resultados con mayor precisin o si deseamos obtener un nmero de clulas viables o no
viables, en este caso se usara otro mtodo.
Segn la literatura el mtodo de conteo directo en la cmara de Neubauer se deben utilizar
frmulas que expresen la concentracin de clulas, mostrando diferencia a la utilizada para el
recuento de levaduras en laboratorio; como se puede observar en la tabla 01, los resultados de
la concentracin de clulas de levadura por ml, la desviacin estndar y el coeficiente de
variacin de las 5 lecturas, se hicieron al azar y se calcularon usando frmulas que expresaron
una diferencia a otros mtodos de conteo que se usan en laboratorio, como en el caso de
recuento microscpico en placa.

VII. CONCLUSIONES:
Se logr determinar de la concentracin de clulas de levadura, utilizando la biomasa de una
poblacin de Saccharomyces Cerevisiae MIT-L51, siguiendo los procedimientos de recuento
microscpico en la cmara de Neubauer, dndonos un valor de 5,45 107 clulas /ml.

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 Biotecnologa de los PAI IX Ciclo Ing. Agroindustrial

Se logr conocer los diferentes mtodos de determinacin de biomasa entre ellos el mtodo
por conteo en la cmara de Neubauer y recuento en placa.

VIII. RECOMENDACIONES:
Se recomienda calibrar el microscopio antes de empezar la cuantificacin de las clulas de
levadura, con el fin de facilitar el conteo.
Se debe agitar la dilucin a emplear (10-1), para as tener una muestra homognea antes de
llevarla a la lmina porta-objetos.
Es recomendable llenar la cmara con micro pipeta pequea o con una jeringa ya que la
cmara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.
La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado
se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cmara es de lquido
abundante en las terminaciones del recuadro.
Si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras, bacterias, etc., se
recomienda ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X.
Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las clulas
dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres lneas
que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen
cuales clulas son contables o cuales estn fuera del campo de conteo. Las clulas que no tocan
la segunda lnea son contables, si la tocan o estn encima de ella no se incluyen. Grficamente
se puede apreciar la forma correcta de conteo.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

1. Arniz,C., Isac,L. y Lebrato, J. 2000.Determinacin de la biomasa en procesos biolgicos.

Sevilla- Espaa.
2. AQUIAHUATI M. (2004). Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa Celular,
Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Departamento de Biotecnologa,
Primera Edicin, Pginas. 63.68.

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Biotecnologa de los PAI IX Ciclo Ing. Agroindustrial

3. Diego Libkind et al. Curso Terico-Prctico sobre Microscopia y Recuento de Levaduras para
Productores de Cerveza. Laboratorio de Microbiologa Aplicada y Biotecnologa Instituto de
Investigaciones en Biodiversidad y Medioambiente (INIBIOMA), CONICETUN Comahue,
Bariloche, Argentina.
4. RODRIGUEZ E. ET AL (2005). Bacteriologa general y prcticas de laboratorio. Editorial
Universidad de Costa Rica.
5. Rentera Vanessa (2011). Universidad Central del Ecuador Facultad de Ciencias Qumicas
Escuela de Bioqumica y Farmacia Carrera Qumica de Alimentos

X. ANEXOS:
ANEXO 01
Clculos en la cmara de Neubauer
Si se cuenta en el retculo de toma en 5 cuadraditos, se obtiene el nmero promedio de clulas y se
procede al clculo:
Promedio de clulas encontradas = 21.8 clulas de levadura.
D = dilucin = 10 -1
21.8 clulas (0.2)(0.2)(0.1)3
X 1000 3

21.8 clulas
X=
(0.2)(0.2)(0.1)mm3 ()
21.8 clulas 1
X= 1
0.004 10
X = 54500000 /
X = 5,45 107 /

NOTA: 1/5 mm x 1/5 mm, es el rea de un cuadrado pequeo dentro del retculo de toma y 0.1 mm
es la profundidad de la cmara de Neubauer.
Se puede deducir una frmula para facilitas el clculo:

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(. )(1000) 1
=
4 103
1
= (. )(1000/4)(104 )

1
= (. )(25)(104 )

1
= (21.8)(25)(104 )
101
= 54500000 /
= 5,45 107 /

Expresin de resultados de recuento en placa:

Despus de la incubacin se cuenta en nmero de UFC, eliminando aquellas placas que tengan
menos de 30 UFC y ms de 300UFE. Se debe expresar el resultado del recuento total de UFC por
ml.

.
Imagen 01. Mtodo de conteo y el porcentaje de error segn la cantidad de clulas contadas

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CUESTIONARIO:

1. Cules son las causas ms comunes de los errores para la cuantificacin de la biomasa
utilizando la cmara de Neubauer?

Errores de hasta 20% y 30% son comunes con este mtodo de recuento debido al pipeteo, a los
errores estadsticos por ser la muestra poco representativa, errores del volumen de muestra
realmente introducido en la cmara, etc.

La cmara de recuento no est limpia.

Armar o cargar incorrectamente la cmara. El cubre-objeto no est correctamente puesto (no
hay anillos de interferencia) hay burbujas de aire en la cmara. Laminillas para la
microscopa estndar son demasiado delgadas y tuercen debido a las fuerzas capilares.
Tomar mal la muestra, la cmara est demasiado llena, Distribucin heterognea.
El tiempo de sedimentacin es demasiado corto.
Tamao de muestra inadecuado (nunca menos de 100 clulas).
Errores humanos (contar mal o perder la cuenta, hacer mal los clculos, mala visualizacin,
no usar criterios homogneos, subjetividades, errores de dilucin).

2. Cules son las causas ms comunes de los errores para la cuantificacin de la biomasa
utilizando el mtodo de recuento en placa?

Necesidad de tratamiento previo: Si colocas un cultivo bacteriano directamente en una placa

el nmero de clulas que crecen en la misma es demasiado grande para permitir su conteo. Por
lo tanto es importante usar un proceso de dilucin serial para asegurar que el nmero de
colonias en la placa sea de entre 300 y 500 aproximadamente. En algunos casos, como en
muestras de agua altamente purificada, es posible que haya muy pocos organismos. Estas
muestras necesitan concentrarse antes de poder colocarse en la placa para su conteo.
Condiciones de crecimiento insuficientes: La placa proporciona un medio nutriente para el
crecimiento de microorganismos en bandas sobre ella. Por lo tanto todos los organismos
reciben los mismos nutrientes. Aunque esto est bien para los cultivos que consisten en un
nico organismo, representa un problema en caso de cultivos mixtos. Los diferentes
organismos presentes dentro de un cultivo mixto pueden diferir cuantitativamente y
cualitativamente en sus requerimientos nutricionales. Cuando un cultivo as crece, las clulas

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que no reciben la nutricin suficiente no crecen ni se multiplican. Por lo tanto, aunque los
organismos estn presentes en el cultivo, sus nmeros no se ven reflejados en el conteo en
placa.
Error de muestreo: La precisin del conteo en placa depende de una distribucin uniforme
de organismos en la superficie de la placa de agar. Si estas celdas se distribuyen de forma
desigual en la superficie esto causa errores en el conteo obtenido. Por ejemplo, en algunas
especies los organismos pueden no ocurrir como clulas nicas sino como conglomerados,
pares o paquetes. Por lo tanto la hiptesis del conteo en placa que dice que cada colonia ha
surgido a partir de una clula nica es errnea y la poblacin estimada de organismos es mucho
menor a la de los niveles verdaderos.
Errores del mtodo: Antes de colocar el cultivo en la placa, este debe diluirse lo suficiente
como para permitir el aislamiento de clulas separadas en la placa. Un error en este proceso
de dilucin tiene un gran impacto en el conteo viable final. La temperatura de incubacin y el
tiempo tambin son factores crticos debido a que los organismos difieren en su temperatura y
periodo ptimos de incubacin. En el caso de cultivos mixtos, en los que existe una amplia
diferencia de estos valores entre los organismos, es posible que haya un crecimiento
insuficiente de una especie particular, lo que da lugar a un error.
Alto consumo de tiempo: Despus de colocar el cultivo, las placas de agar son incubadas para
permitir que las colonias se desarrollen. Este periodo de incubacin puede tardar desde das
hasta semanas dependiendo de la naturaleza de los organismos. En ciertos casos los resultados
obtenidos al final de este periodo pueden no tener valor prctico. Por ejemplo, usar conteos en
placa para monitorear el medio ambiente en una unidad de fabricacin de parenterales estriles
no tiene beneficios en tiempo real aunque es importante para monitorear tendencias en la carga
microbiana del rea.

3. Cules son los las ventajas y desventajas de los dos mtodos mencionados?

Cmara de Neubauer
Las ventajas de este tipo de recuentos son el equipo sencillo y escaso que se requiere, la rapidez
para obtener los resultados y la facilidad para observar la morfologa de los microorganismos
presentes.

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Biotecnologa de los PAI IX Ciclo Ing. Agroindustrial

Sus desventajas se dan porque no se diferencian los microorganismos vivos de los muertos, es
tedioso y no es til para recuento de poblaciones con baja concentracin de microorganismo.
No se usan en hifas y hongos.

Mtodo de Recuento en Placa

Las ventajas de este mtodo es que mide el nmero de clulas viables y los microorganismos
sensibles al calor pueden resultar daados por el agar fundido
Las desventajas es que Requiere bastante tiempo (24 horas o ms), Las bacterias crecen
unidad, en cadenas o como grumos, En medios diferenciales las colonias que se forman debajo
de la superficie no son adecuadas (solo las de la superficie)

4. Si se realizara el clculo en los cuadrados extremos Cmo se presentara la formula?

=
(0.25)(0.25)(0.1)()

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