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ChemInform Resumen: El Enzimas central de la familia aspartato de

la Sntesis de Aminocidos

Artculo en Accounts of Chemical Research Julio 2010

DOI: 10.1002 / chin.200129280 Fuente: PubMed

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1 author:

Universidad de Toledo

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 Acc. Chem. Res. 2001, 34, 339-349

combatir la creciente amenaza de microorganismos resistentes a los

The Enzymes central de la familia antibiticos. Mi laboratorio se ha centrado en mejorar nuestro conocimiento

aspartato de la Sntesis de Aminocidos de las estructuras y mecanismos de las enzimas centrales en esta va, el
conocimiento que proporcionar la base para el logro de cada uno de estos
objetivos.

RONALD E. VIOLA *
Departamento de Qumica de la Universidad de Toledo, Toledo,
Ohio 43606
Recibido el 23 de octubre de, el ao 2000
ABSTRACTO
La va de aspartato es responsable de la biosntesis de lisina, treonina, isoleucina y metionina en
la mayora de plantas y microorganismos. La ausencia de esta va en seres humanos y animales
hace que las enzimas centrales objetivos potenciales para la inhibicin, con el objetivo de
desarrollar nuevos herbicidas y biocidas, y tambin para la mejora, para mejorar el valor
nutricional de los cultivos. Nuestro estado actual del conocimiento de estas enzimas se revisa,
incluyendo informacin estructural determinado recientemente y las enzimas de fusin
bifuncional de nueva construccin.
Visin de conjunto
Los organismos que utilizan esta va contienen varios aspartokinases
isofunctional que catalizan la etapa de compromiso inicial en la va, la
fosforilacin de
L- cido asprtico. En muchos de estos organismos al menos una de estas
enzimas es bifuncional, que cataliza tanto la primera y, sorprendentemente,
la tercera reaccin en esta secuencia metablica. Muchas bacterias
contienen varias isoformas de aspartokinases, algunos de los cuales son
bifuncionales. 2 Estas enzimas isofunctional estn sujetos a regulacin
diferencial, tanto por inhibicin de la retroalimentacin y por la represin a
nivel gentico, de los aminocidos del producto final. En

Escherichia coli hay tres aspartokinases. Isoforma I es bifuncional y es

tanto inhibida y reprimidos por treonina. Isoforma II tambin es bifuncional y
Introduccin
se reprime por la metionina, mientras que la isoforma III es una enzima
La va aspartato (Figura 1) usa L- cido asprtico como el precursor para la monofuncional inhibida por la lisina. 3 En Bacilo hay dos aspartokinases, uno
biosntesis de los aminocidos lisina, metionina, isoleucina y treonina. 1 Esta
que est regulada por los niveles de diaminopimelato, y uno que se inhibe
es una va esencial en plantas andmicroorganisms que implica, como lo
por tanto treonina y lisina. 4 Como es tpico en las vas metablicas
hace, una cuarta parte de los aminocidos de bloques de construccin que
altamente ramificados, existe una regulacin adicional, ms all de este
se requieren para la sntesis de protenas. Adems, hay varios productos
primer paso, en cada uno de los puntos de ramificacin (Figura 2). Este
intermedios importantes metablicos y productos de esta va, incluyendo el
sistema de regulacin permite el control exquisito sobre no slo el flujo total
cido diaminopimlico, un componente clave requerida para la reticulacin
a travs de esta va, sino tambin las velocidades relativas de la produccin
en la biosntesis de la pared celular bacteriana, y el cido dipicolnico,
de cada uno de estos aminocidos. Todas las enzimas centrales en la
importantes para la esporulacin en las bacterias Gram-positivas. Durante
familia aspartato se han purificado, y sus propiedades catalticas se han
miembros evolucin del reino animal han perdido las enzimas que catalizan
elucidado en cierta medida. Estos estudios han incluido un examen de la
las reacciones en esta va, y por lo tanto los aminocidos que se derivan del
especificidad de sustrato y tambin la identificacin de algunos sustratos
cido asprtico son componentes esenciales de la dieta. Como
alternativos e inhibidores. grupos de unin al sustrato y los grupos
consecuencia de esta especializacin evolutiva, esta va se ha convertido
catalticos sitio activo han sido identificados por los estudios de
en el foco de dos objetivos divergentes. Mejora del flujo a travs de esta va,
modificacin clsicos y por mutagnesis dirigida al sitio. estudios
ya sea por el aumento de la expresin de estas enzimas centrales o
estructurales de alta resolucin han proporcionado una imagen detallada
mediante la alteracin de su regulacin, mejora el valor nutricional de las
del sitio activo para dos de estas enzimas, y estas estructuras de soporte
plantas de cultivo importantes mediante el aumento de los niveles de estos
hiptesis razonables para los mecanismos catalticos. Los estudios
aminocidos esenciales, en particular el aminocido lisina. Por el contrario,
estructurales similares estn llevando a cabo para las otras enzimas
el diseo de inhibidores especficos de las enzimas centrales de esta va
centrales. Por ltimo, la separacin y caracterizacin de los dominios
proporcionar compuestos de plomo para el desarrollo de nuevos,
catalticos individuales de la enzima bifuncional, y fusin de genes para
herbicidas seguras, y tambin nuevos biocidas a
crear nuevas enzimas bifuncionales, ha permitido un examen de los
mecanismos de regulacin de las enzimas centrales de la va de aspartato.

Ronald E. Viola naci y se cri en Brooklyn, Nueva York, y recibi una licenciatura de la Universidad de
Fordham en el Bronx. Despus de una pausa de dos aos en Alemania, cortesa del Ejrcito de Estados
Unidos, complet su formacin de posgrado en la Universidad Estatal de Pensilvania, obteniendo una
maestra en qumica y un Ph.D. en bioqumica. Fue presentado en el maravilloso mundo de las enzimas con el Aspartokinases
una beca postdoctoral en el laboratorio del Dr. Mo Cleland de la Universidad de Wisconsin. Despus de una
En E coli, las enzimas bifuncionales aspartokinasehomoserine
cita inicial en la facultad de la Universidad del Sur de Illinois en Edwardsville, se traslad a la Universidad de
Akron en 1984. Se ha incorporado recientemente a la facultad de la Universidad de Toledo como un profesor deshidrogenasa I y II (AK-HDH I y
de Qumica. Sus lneas de investigacin abarcan la aplicacin de una amplia gama de tcnicas para elucidar
la estructura y los mecanismos de enzimas. * Direccin postal del autor en el Departamento de Qumica de la Universidad de Toledo,
2801 W. Bancroft St., Toledo, OH 43606-3390. Telfono: 419-530-1582. Fax: 419-530-1583.
E-mail: ron.viola@utoledo.edu.

10.1021 / ar000057q CCC: US $ 20,00 2001 American Chemical Society VOL. 34, NO. 5, 2001 / Accounts of Chemical Research 339
Publicado el 03/01/2001 Web
 Las enzimas central de la familia aspartato Viola

FIGURA 1. va Aspartato de la biosntesis de aminocidos. Cada flecha representa una conversin catalizada por la enzima, y se enumeran las enzimas centrales que catalizan las
reacciones fundamentales de la va. AK, aspartoquinasa isoenzimas; ASADH, aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa; HDH, isoenzimas homoserina deshidrogenasa; HSK, homoserina
quinasa.

Tabla 1. Los sustratos alternativos para la aspartoquinasa

isoenzimas un

aspartoquinasa I aspartoquinasa III

sustrato k gato (%) K m ( mM) k gato (%) K m ( mM)

L- cido asprtico 100 1 100 0.6

15 50 53 184
L- aspartato R- amida
L- aspartato R- ster benclico 17 4 84 5.3
57 41
NORTE- formil- L- aspartato
NORTE- acetilo- L- aspartato 30 68
15 4 45 diecisis
L- asparagina segundo
L- aspartato un- ster benclico segundo 11 3 86 2.5
L- aspartato un- ster metlico segundo sesenta y cinco 20 88 4.9

un Las condiciones de reaccin: La actividad se determin con un ensayo de piruvato

deshidrogenasa quinasa acoplado / lactato contena HEPES 100 mM (pH 8,0), KCl 100 mM,
MgATP mM 2, PEP 0,7 mM, NADH 0,1 mM, concentraciones variables de los sustratos
alternativos, y 8- 15 g de AK. segundo La fosforilacin en el R- grupo carboxilo.
FIGURA 2. Regulacin de la va en aspartato Escherichia coli.
El flujo a travs de las ramas de esta va est regulada en dos niveles, por la inhibicin de
la retroalimentacin de los aminocidos del producto final ( ,,,,) y por la represin de la
purificacin, con cromatografa hidrfoba como el paso final, condujo a la
sntesis de enzimas reguladoras clave (- - -).
produccin de puro AK III. 9

La especificidad de sustrato. Aspartoquinasa I tiene una especificidad algo

AK-HDH II) catalizan una fosforilacin y, a continuacin, despus de una
reduccin de intervenir catalizada por una enzima separada, una segunda
reduccin para producir el homoserina intermedio. Una tercera enzima
monofuncional, aspartoquinasa III, tambin cataliza la fosforilacin de cido
asprtico que es el paso compromiso en esta va biosinttica. AKHDH I (EC
2.7.2.4) en esta bacteria es un tetrmero compuesto por subunidades
idnticas de peso molecular 86 000, con una secuencia de aminocidos
conocida. 5,6 Cada cadena de polipptido contiene ambas actividades
catalticas; Sin embargo, estas actividades residen en dominios estructurales
distintos. El resto amino-terminal lleva la actividad de la quinasa y la regin
carboxi-terminal contiene la actividad de la deshidrogenasa, con el dominio
de interfaz central informado de que el sitio de regulacin alostrica. 7 Un
esquema de purificacin mejorado, utilizando elucin ternario de una
columna de colorante-ligando, 8 ha llevado a la produccin de altamente
purificado AKHDH I con un excelente rendimiento global. A similares
mejorada
relajada hacia su sustrato de aminocidos (Tabla
1). Mientras L- cido asprtico es el sustrato de aminocidos de eleccin, una
libre R- grupo carboxilo no es esencial para el reconocimiento del sustrato.
los R- amida y varios diferentes
R- steres de aspartato se encontr que eran sustratos alternativos
competentes. 10 Sin embargo, los anlogos de aspartato en la que el R- grupo
amino es o derivado o reemplazados son ni sustratos ni inhibidores de AK I, lo
que indica la importancia de la R- grupo amino como un determinante de unin.
A diferencia de, NORTE- anlogos de aspartato derivatizados tales como NORTE-
formilo y NORTE- acetil aspartato son sustratos para AK III con slo ligeramente
reducida k gato valores (Tabla 1), pero con significativamente elevados K metro valores.
9 Estas diferencias de especificidad puede ser explotado para desarrollar
inhibicin diferencial de estas enzimas altamente homlogas y para diseccionar
los elementos de reconocimiento de sustrato en el sitio activo. Los requisitos
para un donante de fosforilo tambin se investigaron mediante anlogos
estructurales de ATP. Con la excepcin

340 Accounts of Chemical Research / VOL. 34, NO. 5, 2001

 Las enzimas central de la familia aspartato Viola
FIGURA 3. 31 espectro P RMN para la reaccin de L- aspartato un-
ster de metilo con aspartoquinasa I. (A) Reaccin de ejecucin en diecisis agua O. El pico a -2,3
ppm es el producto de fosfato de acilo de la enzima catalizada de reaccin. (B) ejecucin de la
reaccin en 50% 18 agua O. Esta reaccin se llev a cabo hasta que el PEP se haba agotado. El
recuadro ampliado muestra el marcado y el mono 18 picos de fosfato de O-etiquetados.
cin de 2 '- desoxi ATP, 11 todos los trifosfatos probados, incluyendo CTP,
GTP, UTP, y varios derivados de ATP, resultaron ser no reactivo hacia AK
I.
Reversin de regioespecificidad. Aspartato anlogos con
derivatizado un- grupos carboxilo se examinaron como potenciales
inhibidores competitivos de las aspartokinases. Inesperadamente, estos
inversin de esta inactivacin por hidroxilamina, es compatible con la
anlogos, incluyendo compuestos tales como asparagina, aspartato un- hidroxamato,
y tanto el un- metilo y un- steres de bencilo de aspartato, parecen ser identificacin de este aminocido esencial como un residuo histidilo. Esta
sustratos alternativos y no inhibidores. 10 Esto es sorprendente debido a que
el un- grupo carboxilo de aspartato es el sitio aceptor para la fosforilacin, y
el bloqueo de este grupo por derivatizacin debe evitar la transferencia de
fosforilo. Es posible ya sea que la enzima podra hidrolizar estos derivados
antes de la fosforilacin, o que la unin de estos anlogos de sustrato a la
enzima permite que el agua acta como el nuclefilo atacante para
hidrolizar ATP (una reaccin trifosfatasa de adenosina inducida). Para
determinar si la fosforilacin de estas un- aspartatos derivatizados en
realidad se haban producido, los productos de fosfato de acilo putativos
que se obtendran a partir de estos sustratos alternativos se buscaron y
luego caracterizan por ensayos de enzimas acopladas y tambin por
espectroscopa de RMN. Estos estudios confirmaron la produccin de un
producto fosforilado de cada una de las un- aspartatos derivatizados,
productos que pueden ser observados directamente por 31 P RMN (Figura
3A). En adicin, 18 O estudios de marcaje han verificado no slo la
produccin de estos productos de fosfato de acilo, sino tambin su
mecanismo de hidrlisis no enzimtica despus de que los productos se
liberan de la enzima. A pH neutro esta hidrlisis implica el ataque del agua
sobre el fosfato de
el producto con la escisin del enlace ster. Cuando la produccin
enzimtica de estos productos fosforilados se lleva a cabo en 50% 18 O
agua, una sola oxgeno marcado se encuentra en medio del fosfato que se
libera tras la hidrlisis (Figura 3B). 10 A mayores hidrxido de pH se
convierte en las especies que atacan y el mecanismo cambia a atacar en el
carbono carbonilo. Esto conduce a la incorporacin del oxgeno marcado
en el anlogo de cido asprtico y la liberacin de fosfato no marcado
(datos no mostrados).
Claramente, la nica explicacin viable para los productos obtenidos a partir
de estas reacciones catalizadas por enzimas es que
un- anlogos derivatizados de aspartato son capaces de unin productiva a
aspartoquinasa a travs de una inversin de regioespecificidad para hacer la R-
grupo carboxilo disponible como un aceptor de fosforilo. En apoyo de esta
hiptesis es la observacin de que los anlogos en los que tanto el R- y el un- grupos
carboxilo han sido derivatizados hay sustratos ms largos para AK I. Muchos,
pero no todos, de estos R- fosfatos de acilo tambin se han demostrado,
mediante ensayos de enzimas acopladas, a ser sustratos viables para los
dos pasos siguientes enzymecatalyzed en esta va metablica. 10 Este
escenario plantea la posibilidad de producir sustratos alternativos generados
por enzimas que pueden servir potencialmente como antimetabolitos para las
reacciones de aguas abajo en esta ruta biosinttica.
Identificacin de funcionalmente importantes Amino Acids.
Los estudios de modificacin qumica anteriores 12,13 de AK haba indicado la
posible participacin de grupos sulfhidrilo; Sin embargo, esas cistenas
parecan jugar ms de un estructural y no una funcin cataltica. Un examen
de los perfiles de pH de la actividad quinasa de AK-HDH I muestra una
prdida de actividad cerca de pH neutro a la protonacin de un nico grupo
de cido catinico. 14 Nos dirigimos a estudios de modificacin qumica con
reactivos especficos para el grupo para ayudar en la identificacin de este
grupo funcional. La inactivacin de la enzima con dietilpirocarbonato, y la
enzima tambin pierde actividad a pH alto como consecuencia de la
ionizacin de grupos de cido neutros con p K
Los valores cercanos a 10. Estudios modificacin qumica con NORTE-
acetilimidazol (NAI) y con tetranitrometano (TNM) apoyaron la asignacin
de estos grupos como tirosilo residuos, aunque la modificacin observada
de mltiples grupos por este reactivo tambin sugiere una estructural en
lugar de un papel cataltico para estos grupos funcionales en AKHDH I. 14
estudios de inactivacin con AK III, y estudios posteriores de proteccin
de sustrato, tambin confirmaron la presencia de una histidina reactivo
esencial en este aspartoquinasa. Sin embargo, un anlisis cuidadoso de la
inactivacin de AK III por los reactivos-tirosina especficos proported NAI y
TNM expuesto la posibilidad de cierta reactividad cruzada con grupos
sulfhidrilo enzimticas. 9 estudios de proteccin en presencia de MgATP
sugieren que esta cistena puede estar situada en o cerca del sitio de unin
de nucletidos. La conclusin de estos estudios de modificacin es una
leccin que se ha aprendido antes. reactivos especficos para el grupo
pueden proporcionar apoyo para la identificacin de un elemento esencial
VOL. 34, NO. 5, 2001 / Accounts of Chemical Research 341
 Las enzimas central de la familia aspartato Viola

grupo funcional aminocido en una enzima. Sin embargo, incluso con muchos de Tabla 2. Cintica de mutado aspartato semialdehdo
los reactivos de modificacin ms nuevos y ms selectivos, es importante para deshidrogenasas un

ejecutar los controles para comprobar la naturaleza de la modificacin y no confiar L- COMO UN segundo fosfato

en estudios de modificacin qumica como el nico criterio para la identificacin k gato k gato K metro k gato/ K metro

de grupo funcional. enzima (s- 1) (%) (MM) (METRO- 1 s- 1) K metro (MM) k gato/ K
(METRO-
metro 1 s- 1)

de tipo salvaje 610 100 0,17 3,6 10 6 4.8 1.3 10 5

C135A < 0,005 <0,001
C135S 2.0 0.3 0,15 1,3 10 4 1,2 1,5 10 3
aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa Q162N 47 8 0,15 3,1 10 5 4,6 1,0 10 4
Q162H 177 29 0,25 7,1 10 5 4,7 3,8 10 4
L- aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa (ASADH, EC Q39D 290 48 0,13 2,3 10 4,7 6,2 10 4
1.2.1.11), la segunda enzima de la va central, es un dmero compuesto de R267L 58 10 5.3 1.1 10 4 19 3.0 10 3

subunidades idnticas. La secuencia de ADN codifica para una subunidad un La reaccin se control siguiendo la fosforilacin oxidativa de L- COMO UN. Condiciones
de reaccin: tampn 200 mM Ches (pH 8,6), 25 C, saturando (1 mM) NADP, variando la
compuesta de 367 aminocidos con un peso molecular total de 39 950. 15 En
concentracin de ASA y fosfato, y 0,055 a 3,8 enzima g / mL. segundo L- ASA, L-aspartato un- semialdehdo.
la direccin de biosntesis ASADH cataliza la formacin de L- aspartato

un- semialdehdo (ASA) por la desfosforilacin reductiva de L- un- aspartil

direccin no fisiolgica, la fosforilacin oxidativa de ASA, tanto para la
fosfato (BAP), utilizando el poder reductor del NADPH. La reaccin ASADH
enzima y mutantes nativa en la que Cys-135 se sustituye con o bien una
est relacionada con la reaccin catalizada por la gliceraldehdo-3-fosfato
alanina o una serina. Una prdida completa de la actividad enzimtica se
deshidrogenasa, y se han propuesto mecanismos qumicos similares para
observa en la sustitucin de alanina en esta posicin en ASADH (Tabla
cada enzima. 16-18 Este mecanismo implica la formacin de un producto
intermedio resultante tioster de ataque de un tiolato de cistena del sitio
2). Mientras que el mutante de alanina est inactivo, el mutante de serina
activo en el grupo carbonilo de BAP, seguido por la expulsin de fosfato.
correspondiente (C135S) hace mostrar alguna actividad enzimtica, con la
La transferencia de hidruro a partir de NADPH y el colapso de los
velocidad mxima reducida en aproximadamente 500 veces en comparacin con
conductores intermedios tetradricos resultantes para la liberacin del
la de la enzima de tipo salvaje. 20 En este mutante la K metro para ASA no ha
producto ASA.
cambiado desde que en la enzima nativa, mientras que la K metro para el fosfato es
en realidad 4 veces menor en el mutante Ser-135. Estos resultados sugieren que
no hay grandes cambios conformacionales que resultan de la sustitucin de serina
Identificacin de funcionalmente importantes Amino Acids.
que afectara negativamente a la capacidad de la enzima para unirse a sus
estudios de modificacin qumica con 2,2 '- ditiobis (5-nitrobenzoato) (DTNB) diecisis
sustratos. Tomados en conjunto con los estudios de modificacin anteriores, estos
y NORTE- etilmaleimida (NEM) 18
resultados presentan un caso convincente para la funcin cataltica esencial de la
han indicado un papel esencial para un tiolato de cistena en la reaccin
Cys-135.
ASADH. estudios de proteccin contra Substrato NEM inactivacin, llevada a
cabo en presencia de ASA, han sugerido que esta cistena esencial se
encuentra en o cerca del sitio activo de la enzima. Adems, estudios de perfil
Una bsqueda de homologa de secuencia entre las ASADHs que han
de pH han indicado un papel para un grupo de cido neutral, con ap K valor
sido aislados de otras especies, y las comparaciones con las estructuras de
similar a la observada durante la modificacin NEM, que debe ser ionizado
funcionalmente similar RE- deshidrogenasas gliceraldehdo-3-fosfato (GAPDH)
para la actividad enzimtica. 18 L- 2-Amino-4-oxo5-cloropentanoico cido, un
que han sido resueltos de varias especies, se han utilizado para seleccionar
anlogo de sustrato de alquilacin de ASA, inactiva irreversiblemente ASADH.
los objetivos apropiados para la mutagnesis (Figura 4). Un histidina del sitio
Un pptido aislado que contiene el cido amino modificado, tentativamente
activo altamente conservada en la familia GAPDH (Su-176) ha sugerido para
identificado como una histidina, se inform de que la secuencia de
mejorar la catlisis por desprotonacin de la cistena del sitio activo (Cys-149)
aminocidos Phe-Val-Gly-Gly-Asp- Su- Thr-Val-Ser. 19 Haziza et al.
para generar el tiolato nuclefilo. 21,22 Sin embargo, una glutamina totalmente
posteriormente determinado la secuencia de nucletidos de la totalidad asd gen
conservada se encuentra en la familia ASADH en la posicin correspondiente
de E coli que codifica para ASADH 15
a esta histidina. Mientras que no es qumicamente factible para una amida
para sustituir el cido-base papel cataltico de la histidina, glutamina este debe
ser jugar algn papel esencial. Una sustitucin conservadora de una
y se encontr una correspondiente secuencia que codifica para los residuos de asparagina para la glutamina en esta posicin (Q162N) resulta en una
aminocidos 130-138 de su secuencia deducida. Sin embargo, encontraron una disminucin de la k gato a menos del 10% de la de la actividad nativa. 23 La
sustitucin de asparagina para el cido asprtico y cistena para histidina en los sustitucin de una histidina en esta posicin en ASADH, para imitar el
residuos 134 y 135, respectivamente. Estos resultados son consistentes con la aminocido que se encuentra en esta posicin en GAPDH, da una mejora de
cistena localizado en la posicin 135 de la secuencia de aminocidos como el la actividad de 4 veces sobre el Q162Nmutant (Tabla 2). sin embargo, el k gato de
candidato ms probable para el nuclefilo de cistena del sitio activo. este mutante es todava menos de 30% de la de la actividad nativa, apoyando
un esencial, pero en este papel no determinado punto para este residuo de
glutaminilo.
Estudios de mutagnesis. Los mutantes de ASADH se construyeron
mediante mutagnesis dirigida por oligonucletidos para examinar el papel de
este putativo cistena del sitio activo, y para identificar aminocidos adicionales
grupos funcionales que pueden desempear un papel en el mecanismo de la
reaccin catalizada por la enzima. Los parmetros cinticos se determinaron de la A arginina conservada (Arg-267) se ha encontrado para alinearse con
la Arg-231 en GAPDH (Figura 4) que ha sido

342 Accounts of Chemical Research / VOL. 34, NO. 5, 2001

 Las enzimas central de la familia aspartato Viola
FIGURA 4. La homologa de secuencia entre el aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa (asadh) de la familia y la alineacin con secuencias de gliceraldehdo-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH representante). Las secuencias se muestran en todo el nuclefilo del sitio activo (Cys-135), el residuo de orientacin putativo (Gln-162), y la unin del
sustrato grupo propuesto (Arg-267).
asignado el papel de unir el grupo fosfato del sustrato. 21 La sustitucin de este
residuo de arginina en ASADH conduce a una disminucin en la renovacin
cataltica, y es la nica mutacin examinado que tambin se traduce en una
disminucin de la afinidad tanto para ASA y fosfato (Tabla 2). Por tanto, este
residuo se le asigna un papel en la unin de la aspartato sustrato un- semialdehdo.
23 Secuencia de la alineacin de ASADH con otra NADP y las enzimas
dependientes de NAD tambin ha conducido a la identificacin de una regin
de unin putativo piridina nucletido. La sustitucin de dos aminocidos en
esta regin, ya sea con cadenas laterales neutras o cargadas positivamente se
ha traducido en un cambio en la especificidad de coenzima. NADP est
fuertemente favorecida por mayor que 9000 veces sobre NAD como la
coenzima para de tipo salvaje ASADH, mientras que en esta enzima mutada la
selectividad se ha reducido por un factor de 60, y esta enzima tiene afinidades
comparables, ya sea para la piridina nucletido. 23
Los estudios estructurales. La estructura de ASADH de E coli
recientemente se ha resuelto por difraccin de rayos X a 2,5 UN
resolucin utilizando tomo pesado sustitucin isomorfa y la simetra no
cristalogrficos. Cada monmero en este dmero funcionalmente activo tiene
una NORTE- terminal de dominio de unin de nucletidos y un dominio de
unin a sustrato, que tambin proporciona la mayora de la superficie de
contacto entre las subunidades (Figura 5). La presencia de la Cys135 esencial
localiza el sitio activo, y esto nuclefilo se encuentra en la interfaz entre los
dos dominios, en consonancia con su papel en la catlisis. 24 Dos otros residuos
que fueron identificados por mutagnesis dirigida al sitio como jugando un
papel en la catlisis 23
tambin se encuentran en el sitio de hendidura activa (Figura 6). Arg-267 est
haciendo una interaccin electrosttica con el grupo carboxilo de la inactivador
activo dirigido de sitio S- sulfxido metilcistena que es consistente con su papel
propuesto en la unin del sustrato. La glutamina (Gln-162) que se identific
por homologa de secuencia y se sond por mutagnesis sitedirected se
encuentra para estar en estrecha proximidad a Cys-135, con el oxgeno del
carbonilo de menos de 6 UN desde el
tiolato. Sin embargo, el contacto ms directo a Cys-135 es de otro residuo,
Su-274, con el nitrgeno- del anillo de imidazol solamente 3,8 UN desde el
tiolato Cys-135 (Figura
6). La posicin de este histidina es consistente con un papel en la
desprotonacin del tiol. 18 Aunque este histidina est completamente
conservada en la familia ASADH, su posicin en el sitio activo de la enzima
no se anticip a la luz de los alineamientos de secuencia entre estas familias
homlogas. Como se mencion anteriormente, la histidina del sitio activo en
GAPDH es una glutamina conservado en esa posicin en ASADH, y la
histidina del sitio activo en ASADH es una serina conservadas en esa
posicin en la familia GAPDH. Sin embargo, el papel esencial de su-274 se
confirm en un mutante donde esta histidina es reemplazada por una
glutamina en ASADH, y la actividad se reduce en un 10 3 en comparacin con
la de la enzima nativa. 25
En el enzima libre los tres residuos, Su-274, Gln-162 y Arg-267, estn
implicados en enlaces de hidrgeno a una sola molcula de agua que
aparece para aproximar el sitio de unin del sustrato. En esta estructura
Gln-162 est justo fuera de la distancia normal de enlaces de hidrgeno del
nitrgeno de Su-274. Este grupo funcional amida puede desempear un
papel en la orientacin de la histidina, y la prdida de actividad que se
observa cuando este glutamina est sustituido con el asparagina homloga
apoya esta hiptesis. Los actores clave en el sitio activo (Cys-135, His-274,
Gln-162) son una reminiscencia de la trada cataltica observada en
cistena proteasas. La cistena y la histidina se colocan adecuadamente
para jugar los mismos papeles en ASADH. El papel del tercer residuo,
Mecanismo de enzima. El mecanismo cintico de ASADH,
determinado a partir de la velocidad inicial, el producto y los estudios de
inhibicin de remate, es un mecanismo secuencial orden preferido
aleatorio. 18 Para la reaccin examinado en la direccin fisiolgica, fosfato
aspartil une preferible
VOL. 34, NO. 5, 2001 / Accounts of Chemical Research 343
 Las enzimas central de la familia aspartato Viola
FIGURA 5. dibujo de la cinta de la estructura de aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa de Escherichia coli. 24 Se muestra el dmero catalticamente activo, con una de las subunidades
de sombra en rojo. La posicin de encuadernado NADP se muestra (en azul) en la subunidad no sombreada, as como el sitio activo cistena-135 modificado con S- sulfxido metilcistena
(en verde).
FIGURA 6. la estructura del sitio activo de aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa
que muestra el nuclefilo (Cys-135) covalentemente inac- activa con S- sulfxido
metilcistena (mostrado en verde), la base cataltica (Su-274), el grupo de orientacin
para la base cataltica (Gln-162), y los grupos de unin a sustrato (Glu-241 y Arg-267). 40
entially al complejo E-NADPH, y no se ordena la liberacin de productos de
ASA y NADP. El mecanismo qumico propuesto para de tipo salvaje
ASADH sigue una secuencia fourstep (Esquema 1). El nuclefilo sitio
activo es generado por desprotonacin de Cys-135 por la adyacente de
His-274. Su-274 est posicionada para este papel por un enlace de
hidrgeno a Gln-162. La unin de fosfato aspartil es asistido por una
interaccin electrosttica del grupo carboxilo de sustrato con el grupo
guanido de Arg-267. Ataque de la tiolato sitio activo en el carbono carbonilo
de fosfato de aspartilo, seguido por el colapso del intermedio tetradrico
con expulsin de fosfato, conduce a la transferencia de hidruro a este
intermedio. La expulsin de tiol (asistido
344 Accounts of Chemical Research / VOL. 34, NO. 5, 2001
por protonacin de Su-274) genera ASA. La desprotonacin de Cys-135 se
requiere para iniciar otro ciclo cataltico.
Especificidad oxianin. La estructura de un anlogo de
enzymeNADP-sustrato ( S- sulfxido) complejo metilcistena se ha
determinado; sin embargo, una estructura an ms informativo sera que
del intermedio de acil-enzima. Esta forma de acil-enzima es
razonablemente estable, hasta el punto en que puede ser aislado por
cromatografa de filtracin en gel en ausencia de fosfato. diecisis Adems la
estabilizacin de este intermedio puede permitir la cristalizacin de este
complejo. Para este fin una variedad de oxianiones han sido probados
como posibles sustratos alternativos o inhibidores competitivos frente a
fosfato para la reaccin inversa (oxidativo). Arseniato y vanadato se
encontr que eran buenos sustratos alternativos (Tabla 3), con V mx valores
que son 50-70% que con fosfato y una K metro para vanadato que es 20
veces menor que la de fosfato. 26
Peryodato, telurato, fosfonato, tungstato y perrenato se encontr que todos
los inhibidores competitivos de ASADH, con K yo valores que van de 0,2 mM
para peryodato a 140 mM para perrenato. Estos resultados han sido
analizados para determinar la geometra, el tamao de aniones, y densidad
de carga molecular contribuyen a la capacidad de la enzima para
discriminar entre los posibles sustratos o inhibidores. Se requiere geometra
tetradrica, y una alta densidad de carga negativa en los oxgenos
perifricos es un componente importante para el reconocimiento del
sustrato por ASADH. 26
La unin de inhibidores competitivos en el sitio de unin de fosfato se
encontr para estabilizar el producto intermedio de acil-enzima. La
hidrlisis lenta de este intermedio se reduce adicionalmente por al menos
20 veces al cambiar de pH 8 a pH 7 en presencia de niveles saturantes de
peryodato. La cristalizacin de esta voluntad complejo intermedio
 Las enzimas central de la familia aspartato Viola

Esquema 1. Mecanismo qumico de aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa

Tabla 3. Cintica para oxianiones Interactuar con La estructura de este HDH levadura se ha resuelto recientemente. 32 La
Aspartato semialdehdo deshidrogenasa un enzima es un dmero, con cada monmero compuesta de una regin de unin
oxianin V max ( min- 1) K m ( mM) V max / K m ( METRO- 1 s- 1) a nucletidos, una regin cataltica, y una regin de interfaz de subunidad. La
fosfato 710 2.9 4.1 10 3 estructura del sitio activo de HDH identifica dos grupos de unin, Asp-214 y
arseniato 510 1.6 5.3 10 3 Glu-208, que ayuda a orientar el ASA sustrato. El mecanismo propuesto,
vanadato 330 0.14 3.9 10 4
basado en ambos estudios estructurales y mutagnicos, es inusual para una
un Condiciones de reaccin: tampn 200 mM Ches (pH 8,6), 25 DO,
deshidrogenasa piridina-vinculado. En lugar de los donantes de protones
saturando (1 mM) NADP, saturando (0,5 mM) ASA, y concentraciones variables de los
tpicas que se encuentran en estas enzimas, una lisina del sitio activo
oxianiones.
(Lys-223), colocado a travs de una interaccin electrosttica con Asp-219, se
propone para donar un protn al alcxido de ASA que se forma durante la
proporcionar una instantnea de un paso importante en el ciclo cataltico de
transferencia de hidruro a partir de NADPH. Este papel es apoyado por una
ASADH.
mutacin de este lisina que se traduce en una enzima completamente inactivo. 32

homoserina deshidrogenasa
Homoserina deshidrogenasa (HDH) cataliza la reduccin
NADPHdependent de ASA para producir homoserina. Esta reaccin se
produce en un punto de ramificacin clave en la va, con el sustrato que
sirve como precursor para la biosntesis de la lisina y el producto que
conduce a la metionina, treonina, isoleucina y (Figura 1). Regulacin de la
reaccin catalizada por HDH es crucial para controlar el flujo a travs de
esta va ramificado. En las bacterias Gram-negativas tales como E coli, HDH
se encuentra como un dominio cataltico en una enzima bifuncional con
aspartoquinasa, y la regulacin alostrica de ambas actividades est
mediada a travs del dominio aspartoquinasa. 27 En contraste, HDH en
bacterias Gram positivos es una enzima independiente y un mecanismo
diferente de la regulacin ha evolucionado. La regulacin por treonina de la
homoserina deshidrogenasa de Corynebacterium glutamicum es abolida por
mutaciones cerca de la C-terminal. 28,29 El HDH monofuncional de Bacillus
subtilis es altamente homloga a la de C. glutamicum.
Un examen de las secuencias de estas enzimas muestra que contienen un
dominio C-terminal adicional de aproximadamente 100 aminocidos que no
se encuentra en el E coli
enzima. 30 Sobre la base de alineamientos de secuencias, la hibridacin y
estudios de delecin, este dominio parece ser el sitio de regulacin
alostrica por treonina. La enzima que se ha aislado de la levadura es la
ms pequea homoserina deshidrogenasa conocida. Esta enzima
monofuncional no se encuentra la extensin C-terminal que se encuentra en
las bacterias Gram positivos y por consiguiente no est regulada por
treonina. 31
En este punto de la homoserina va puede ser dirigida, por
condensacin con succinil-coenzima A, para la produccin de metionina.
Alternativamente, homoserina puede ser fosforilado por la quinasa
homoserina, que conduce a la treonina y posteriormente a isoleucina
(Figura 1).
homoserina quinasa
homoserina quinasa (HSK, EC 2.7.1.39), la cuarta enzima en la va
aspartato de la biosntesis de aminocidos, cataliza la fosforilacin de L- homoserina
a L-
fosfato homoserina. Este intermedio activado es el precursor para la
sntesis de treonina, catalizada por la sintasa treonina.
La especificidad de sustrato. Como es cierto para todas las quinasas, un
ion de metal divalente, normalmente de magnesio, es esencial para la actividad
cataltica. Pero, adems, tambin se han informado de iones metlicos divalentes
para aumentar la afinidad de la enzima por L- homoserina. 33 Una amplia gama de
anlogos estructurales de L- homoserina han sido examinadas como posibles
sustratos alternativos para la reaccin catalizada por HSK. Tanto cintica y 31 estudios
P RMN han demostrado que la enzima es capaz de fosforilar un grupo hidroxilo
en cualquiera de carbono 4 o 5 de L- anlogos homoserina, pero tampoco L- treonina
ni L- serina es un sustrato de la enzima. Para cuatro carbonos
L- anlogos de homoserina, el grupo carboxilo en el R- posicin puede ser un
carboxilo, o podra ser sustituido con un ster o incluso un grupo
hidroximetilo. La enzima puede

VOL. 34, NO. 5, 2001 / Accounts of Chemical Research 345

 Las enzimas central de la familia aspartato Viola
Tabla 4. Cintica de la homoserina quinasa mutantes un
k gato ( s- 1)
enzima quinasa ATPasa quinasa relacin / ATPasa
tipo salvaje 18.3 0,016 1140
R234L 0.20 0,049
R234C 0.02 segundo 0.28
R234H 0,073 0.37
H202L 9.06 0,071 128
H139L 0.5 segundo 2.51
H205Q 0,005 segundo 0,036
un Condiciones de reaccin: la actividad se monitoriz mediante un ensayo de piruvato
deshidrogenasa quinasa acoplado / lactato que contiene 100 mM de Hepes / Tris (pH 8,0), KCl
100 mM, MgATP 2 mM, PEP 0,7 mM, y 0,1 mMNADH. segundo Estimado a partir de la relacin de
particin de quinasa a la actividad ATPasa determinado por el fsforo-31 RMN espectroscopia
copia
tambin acomodar a grupos grandes, hidrfobos en el extremo carboxilo
del sustrato. L- steres homoserina con grupos ster de hasta cuatro
carbonos larga estn procesados sin un sacrificio sustancial de la eficiencia
cataltica, aunque la selectividad ( k gato/ K metro) para homoserina es de 20 a 80
veces mayor que para estos steres homoserina. 34 Estos resultados
sugieren la presencia de un bolsillo hidrofbico adyacente al sitio de unin
del grupo carboxilo del sustrato en el sitio activo, con interacciones
hidrofbicas entre los grupos alquilo y los alrededores de la bolsa, al
menos parcialmente compensar la prdida de una interaccin inica para
ayudar en la orientacin productiva de estos sustratos alternativos.
Identificacin de funcionalmente importantes Amino Acids.
Un examen del perfil de pH muestra que esta enzima pierde actividad tras la
protonacin de un nico grupo funcional y sobre desprotonacin de un
segundo grupo funcional, con ambos grupos que aparecen a ser del tipo de
cido catinico. 35 La incubacin de la enzima con DEP conduce a la prdida
completa de la actividad enzimtica. Caracterizacin espectral y qumica de
la enzima derivatizada ha demostrado que esta prdida de actividad es
causada por la modificacin de un residuo histidilo, y la presencia de
sustratos protege una sola histidina de la modificacin. El tratamiento de la
enzima con piridoxal-5 '- fosfato tambin resulta en la inactivacin de la
enzima. La evidencia espectral para la formacin de una base de Schiff es
compatible con la presencia de una lisina reactiva. La proteccin completa
contra la modificacin proporcionada por sustratos e inhibidores tambin
indica que la quinasa de homoserina contiene una lisina que es esencial
para la actividad cataltica. 35
Estudios de mutagnesis. La eleccin de los objetivos de aminocidos
apropiadas para el sitio-directedmutagenesis se basa en los estudios de pH y de
modificacin qumica anteriores, y tambin en las comparaciones de secuencias
entre enzimas relacionadas. Arg-234, la nica arginina conservada, se sustituy
en primer lugar con el aminocido leucina neutral. los K metro de R234L de
L- homoserina aumenta en casi 300 veces y la k gato
disminuye en 90 veces en comparacin con las de la enzima de tipo salvaje
(Tabla 4). Sin embargo, hay menos de un cambio de 2 veces en el K metro para
ATP, y la actividad de ATPasa inherente de HSK (<0,1% de la actividad
quinasa en la enzima nativa) en realidad aumenta por 3 veces en el mutante
R234L. 34 Arg 234 tambin fue reemplazado por cistena e histidina.
346 Accounts of Chemical Research / VOL. 34, NO. 5, 2001
El mutante R234C no tiene actividad homoserina quinasa observable, medida
usando un ensayo de enzima acoplada; Sin embargo, ahora tiene una actividad
de ATPasa que es casi 20 veces mayor que la de la enzima de tipo salvaje. El
mutante R234H tambin tiene actividad disminuida quinasa (0,4% de tipo
4.1 salvaje) y una actividad ATPasa mejorada.
0.08
0,19
Hay tres histidinas que se conservan parcialmente en HSK. La
0.21 mutacin de la histidina ms conservada (His-
0.14 139) para leucina conduce a una enzima con actividad de ATPasa mejorada de
manera espectacular, sobre 150 veces mayor que la de la enzima de tipo salvaje, y
con la actividad de quinasa disminuida (Tabla 4). Cuando se calcula a partir de la
relacin de quinasa a los productos ATPasa utilizando 31 espectroscopa de RMN P,
la actividad quinasa de H139L es de menos de 3% de la de la enzima de tipo
salvaje. Sustitucin de histidina-202 con leucina conduce a slo una disminucin del
50% en k gato, mientras que la sustitucin de la histidina-205 con glutamina conduce a
una enzima con un inalterada K metro para ATP y una actividad de ATPasa que est
dentro de un factor de 2 de la enzima de tipo salvaje. 34 Sin embargo, la actividad
quinasa de H205Q, como se determina a partir de 31 P RMN, es de menos de 0,03%
de la del enzima de tipo salvaje (Tabla 4).
Estos estudios de mutagnesis dirigida han confirmado un papel para
la arginina-234 en la unin del grupo carboxilo de L- homoserina, y la
participacin de dos histidinas (HIS-139 y Su-205) en el sitio homoserina.
Las mutaciones en estos sitios han dado lugar a la disociacin de la
actividad quinasa de una actividad ATPasa inherente a la enzima. Estos
resultados sugieren la presencia de dominios independientes para la unin
de ATP y homoserina en HSK. Las alteraciones que interfieren con la unin
de homoserina en realidad aumentar la capacidad de homoserina quinasa
para hidrolizar ATP.
Creacin de nuevas enzimas bifuncionales
Las enzimas bifuncionales existente. Hay muchos ejemplos de enzimas
bifuncionales bien caracterizados, en particular en el metabolismo de
aminocidos. Por ejemplo, en amino aromtico biosntesis de los cidos de
la R- subunidad de triptfano sintasa cataliza la produccin de indol, que a
continuacin se canaliza a la un- subunidad se condense con serina para la
sntesis de triptfano. 36 Dos enzimas bifuncionales diferentes catalizan la
conversin de corismato, dirigiendo el prefenato intermedio para la sntesis
de cualquiera de tirosina, en el caso de corismato mutasa
deshidrogenasa-prefenato, 37 o fenilalanina cuando catalizada por corismato
mutasa deshidratasa-prefenato. 38 En estos, y en prcticamente todos los
otros ejemplos, las enzimas bifuncionales catalizan reacciones
consecutivas ya sea para canalizar un intermedio metablico al siguiente
sitio cataltico, o para dirigir el flujo metablico hacia abajo una rama de
una va. Una notable excepcin a la utilidad de la catlisis de reaccin
consecutivos es las isoenzimas deshidrogenasa
aspartoquinasa-homoserina que catalizan reacciones no consecutivos.
Para examinar los mecanismos de regulacin en esta va, y para tratar
potencialmente la cuestin de la canalizacin metabolito, hemos escindido
el gen que codifica para la bifuncional AK-HDH I y han expresado por
separado cada uno de los dominios catalticos. Para estudiar
 Las enzimas central de la familia aspartato Viola

Tabla 5. Cintica de las monofuncionales Aspartokinases y homoserina deshidrogenasas

actividad aspartoquinasa un homoserina deshidrogenasa actividad un

parmetros cinticos AK-HDH I segundo me AK segundo AK III segundo AK-HDH I segundo HDH I ' segundo HDH I segundo

k gato ( s- 1) 0.39 6.3 98 0.24 3.30 0.51

K m ( aspartato o homoserina) (mM) 0.63 0.47 0.51 1.2 0.68 17.2
k gato/ K m ( METRO- 1 s- 1) 6.3 10 2 1.4 10 4 1.9 10 5 2.1 10 2 4.9 10 3 3.0 10 1

un actividad aspartoquinasa se control mediante un ensayo de piruvato deshidrogenasa quinasa acoplado / lactato mientras homoserina deshidrogenasa actividad se control directamente por la
reduccin del NADP. segundo AK-HDH I, I nativo deshidrogenasa bifuncional aspartoquinasa-homoserina; AK I, aspartoquinasa I dominio cataltico; AK III, aspartoquinasa nativa III; HDH I ', homoserina
deshidrogenasa dominio cataltico con regin de interfaz adjunto; HDH I, homoserina deshidrogenasa dominio cataltico.

Tabla 6. Cintica de las enzimas Nueva bifuncionales

actividad aspartoquinasa un homoserina deshidrogenasa actividad un

parmetros cinticos DH AK I-ASA segundo AK III-HDH I ' segundo AK-HDH I segundo AK III-HDH I ' segundo

k gato ( s- 1) 1.35 0.16 0.24 24

K m ( aspartato o homoserina) (mM) 0.59 0.51 1.2 0.41
k gato/ K m ( METRO- 1 s- 1) 2.3 10 3 3.1 10 2 2.1 10 2 5.9

un actividad aspartoquinasa se control mediante un ensayo de piruvato deshidrogenasa quinasa acoplado / lactato mientras homoserina deshidrogenasa actividad se control directamente por la
reduccin del NADP. segundo AK I-ASA DH, la fusin de aspartoquinasa I dominio cataltico con el aspartato semialdehdo deshidrogenasa; AK III-HDH I ', fusin hbrida de aspartoquinasa nativo III con la
regin de dominio y la interfaz cataltica de I homoserina deshidrogenasa; AK-HDH I, nativa aspartoquinasa homoserina-deshidrogenasa I.

el flujo y la regulacin de metabolitos a travs de esta va que se han se elimina el dominio cataltico AK. Estos resultados estn en contraste con los
combinado diferentes dominios catalticos para crear varias nuevas informes previos de que la regulacin de HDH por treonina est mediada por el
enzimas bifuncionales artificiales. dominio aspartoquinasa. 27 Sin embargo, adems de truncamiento, de la

La expresin de nuevas enzimas monofuncionales. El gen
bifuncional AK-HDH I, thrA, de E coli ha sido dividida en sus dominios
catalticos separados y completamente funcional. 39 El dominio
aspartoquinasa I abarca aproximadamente los primeros 250 aminocidos
en el NORTE- terminal de la bifuncional AK-HDH I enzima. El fragmento de
gen que codifica este dominio, llamado thr UN 1, se escindi del
thr Un gen y se expres por separado. Este dominio monofuncional purificada
AK I tiene una alta actividad cataltica, con una mejorada k gato en comparacin
con la de la enzima bifuncional intacto (Tabla 5). La porcin restante de la thr Un
gen, llamado thr UN 2 ', consiste en la regin de interfaz y la homoserina
deshidrogenasa dominio cataltico. La expresin de este fragmento de gen
produce una monofuncional HDH I ' que tambin es altamente activo, con
ms de un aumento de 10 veces en
k gato y una disminucin de 2 veces en K metro en comparacin con esta actividad en la
enzima bifuncional nativa (Tabla 5).
eliminacin de la regin de la interfaz, causa una disminucin mayor que 400
veces en la sensibilidad de HDH a la inhibicin por retroalimentacin por
treonina. 39
Para la fusin FormBifunctional enzimas. Ahora que cada dominio
cataltico se ha demostrado que es completamente activa cuando se expresa
por separado, la siguiente pregunta que abordar es si estos genes pueden
fusionarse para formar nuevas enzimas bifuncionales que pueden catalizar
reacciones consecutivas. La separados thrA 1 fragmento del gen que codifica
para AK I se uni en marco a la asd gen que codifica para ASADH para crear
una nueva enzima bifuncional que podra ahora potencialmente catalizar la
conversin acoplado de aspartato a aspartato un- semialdehdo. Junto a AK I a
ASADH resultado en una disminucin de 5 a 6 veces tanto en k gato y en k gato/ K metro
para AK I en comparacin con los valores para la enzima
isolatedmonofunctional (Tabla 6). Sin embargo, estos valores son todava 4
veces mayores que las observadas en la enzima bifuncional nativo.

Para examinar el efecto que la presencia de la regin de interfaz podra

tener sobre la actividad cataltica del dominio HDH, esta regin fue retirado
de la HDH monofuncional. Este fragmento de gen, llamado thr UN 2, codifica
para slo el dominio 41 kDa HDH. El dominio cataltico separado tiene una
menor k gato sin la regin de interfaz presente, y una K metro para homoserina
que se ha incrementado en 40 veces. Sin embargo, esta disminucin de la
catlisis es solamente 7 veces menor que el medido para la enzima
bifuncional nativa (Tabla 5).
La regulacin de las enzimas monofuncionales. Nativo AK-HDH I es
sujeto a inhibicin por retroalimentacin por el cido amino producto final L- treonina,la lisina. 39 Por lo tanto, la fusin de estos dos dominios catalticos ha
con una constante de inhibicin de aproximadamente 0,3 mM. El dominio
AK I separados ha perdido esta capacidad de regulacin alostrica, y ya no
es inhibida por treonina en concentraciones de hasta 200 mM. El dominio
HDH I separada todava est regulado, y se hace an ms sensibles a la
inhibicin treonina cuando
Para examinar el mecanismo de la inhibicin del producto final, una
enzima bifuncional hbrido se prepar uniendo el
lysC gen que codifica para la monofuncional AK III con el thrA 2 ' gen que
codifica para HDH I ' con el dominio de interfaz. Nativo AK III est sujeto a
inhibicin por retroalimentacin por el producto final aminocido lisina. Esta
inhibicin se retiene en la enzima bifuncional hbrido con HDH I, mientras
que la actividad HDH en esta enzima sigue siendo sensible a la inhibicin
treonina. Sin embargo, adems de la inhibicin por treonina, la actividad
deshidrogenasa ha ahora llegar a ser bastante sensibles a la inhibicin por
permitido la unin de un inhibidor alostrico (lisina), cerca de un dominio
cataltico (AK III) para ser comunicado a travs de la interfaz de fusin para
influir en la actividad del otro dominio cataltico (HDH).

VOL. 34, NO. 5, 2001 / Accounts of Chemical Research 347

 Las enzimas central de la familia aspartato Viola
Conclusiones y direcciones futuras
Enzimas, con pocas excepciones, son notables por su capacidad para
catalizar transformaciones estereoselectivas y regioselectivas. Estas
especificidades son ciertamente presente en la fosforilacin de cido
asprtico que es catalizada por la aspartokinases. Solo el L- ismero de
cido asprtico es un sustrato y slo el un- grupo carboxilo del sustrato es
fosforilado. Sin embargo, se han encontrado estas enzimas para unir un- anlogos
derivatizados de cido asprtico, los compuestos que normalmente no se
encuentran in vivo. Al hacerlo, la regioselectividad se invierte y el
R- grupo carboxilo se convierte en el aceptor fosforilo. Varios de estos R- fosfatos
de acilo tambin se han demostrado ser sustratos alternativos para los
pasos enzymecatalyzed subsiguientes en esta va metablica. Al permitir
que estas enzimas para llevar a cabo la sntesis, los productos de estas
reacciones alternativas se convierten en candidatos potenciales para
inhibidores o inactivadores de las enzimas aguas abajo en la va
dirigidas-sitio activo.
La estructura de alta resolucin de la aspartato semialdehdo
deshidrogenasa confirm las asignaciones estructurales del sitio activo que
se hicieron sobre la base de estudios de modificacin y mutagnesis
qumica. A histidina no reconocido previamente fue descubierto en esta
estructura que desempea el papel de una base de sitio activo para
desprotonar la cistena cataltica y generar el nuclefilo de tiolato. Los
ASADHs de una gama de microorganismos infecciosos tienen el mismo
conjunto de los aminocidos funcionalmente importantes que han sido
identificados en el E coli enzima; sin embargo, su identidad de secuencia
global vara de ms del 80% a menos del 25%. La purificacin, mecanismos
y estructuras de estas enzimas estn siendo investigados con el objetivo de
identificar las diferencias entre estas enzimas que pueden usarse para la
inhibicin especfica.
No est claro por qu la naturaleza opt por fusionar los genes que
codifican para aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa y hacer una
enzima bifuncional que cataliza reacciones no consecutivos. La separacin
de estos genes conduce a dos enzimas totalmente funcionales
independientes. Unindose a la monofuncional recin producido
aspartoquinasa I aspartato semialdehdo deshidrogenasa crea una enzima
bifuncional artificial que ahora pueden catalizar reacciones consecutivas.
Los experimentos preliminares han demostrado una canalizacin directa
del fosfato de acilo inestable intermedia entre los sitios activos en esta
enzima de fusin de nueva construccin. Los estudios futuros se centrarn
en la produccin de construcciones bifuncionales adicionales, una enzima
trifuncional que puede catalizar la conversin directa de cido asprtico a
homoserina, y un examen de canalizacin intermedia y la regulacin en
esta va. La finalizacin de estos estudios ser la base para el desarrollo
de inhibidores y activadores de esta va esencial.
Doy las gracias a los muchos y excelentes compaeros de trabajo que han
contribuido a nuestra comprensin mejorada de esta va, incluyendo Jim Hunsley,
Thelma ngeles, Yen-fang Keng y Julio Blanco sobre los aspartokinases, Bill
Karsten, Jun Ouyang, Cindy James, y Michelle Kish el aspartato un- semialdehdo
deshidrogenasa, y Xuewen Huo en homoserina quinasa. Un agradecimiento especial
a
348 Accounts of Chemical Research / VOL. 34, NO. 5, 2001
Andrea Hadfield (Universidad de Bristol) por su solucin de la aspartato un- semialdehdo
deshidrogenasa estructura. Este trabajo ha sido financiado por una subvencin de
rea de los Institutos Nacionales de Salud (GM57626) y ms recientemente por una
beca de la Fundacin Nacional de Ciencia (MCB9816745).
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