MTODOS DE PRESERVAO PARA FUNGOS FITOPATOGNICOS HABITANTES DO

SOLO

Csar Jnior Bueno

PqC do Plo Regional do Extremo Oeste/APTA
cjbueno@apta.sp.gov.br

As culturas exploradas economicamente so infectadas por fitopatgenos causadores de

doena, ocasionando perdas e prejuzos financeiros para os produtores. Dentre os
fitopatgenos h os fungos que habitam o solo, tais como Fusarium sp., Macrophomina
phaseolina, Sclerotium sp., Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium dahliae,Rhizoctonia sp. e
outros. Estes patgenos produzem estruturas de resistncia na ausncia de plantas
hospedeiras e/ou condies climticas desfavorveis. Telisporos, ascocarpos, osporos,
esclerdios e clamidsporos so exemplos de estruturas de resistncia (Figura 1). Alm do
fato de algumas estruturas de resistncia sobreviverem por muito tempo no solo na
ausncia de planta hospedeira, a presena destas estruturas pode inviabilizar muitas vezes
medidas de controle para o patgeno.
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Figura 1. Estruturas de resistncia formadas por alguns fungos fitopatognicos

habitantes do solo. Por exemplo, clamidsporoa muito comum de ser formado pelo
fungo Fusarium sp., esclerdiob por Sclerotium rolfsii e
b
microesclerdio por Macrophomina phaseolina.

Fontea:http://www.botany.hawaii.edu/faculty/gardner/diseases/Koa%20dieback/koa_wi
lt.htm

Fonteb: Bueno, C.J. Produo e preservao de estruturas de resistncia de fungos

fitopatognicos habitantes do solo. Botucatu, 2004. 101f. Tese em
Agronomia/Proteo de Plantas Faculdade de Cincias Agronmicas, Universidade
Estadual Paulista.

A preservao de fungos fitopatognicos por longos perodos de tempo importante para

que pesquisas possam ser realizadas com estes patgenos a qualquer momento com o
intuito de se buscar mtodos alternativos para o seu controle. O mtodo de preservao
deve manter as caractersticas originais dos fitopatgenos, tais como capacidade de
esporular e patogenicidade (1). Essas caractersticas tm importncia para fins industriais,
de ensino ou de pesquisa (5). Os principais mtodos de preservao utilizados so
temperaturas baixas ou congelamento, nitrognio lquido, slica-gel, solo ou areia, tecido
seco de hospedeiro infectado, repicagens peridicas, gua destilada ou mtodo de
Castellani, liofilizao e leo mineral (1, 4). Dhingra & Sinclair (3) relatam que no existe
nenhum mtodo universal para armazenar patgenos de plantas, pois a seleo do mtodo
deve ser baseada na natureza do patgeno e nas suas vantagens e desvantagens.

A preservao de fungos fitopatognicos por longos perodos de tempo importante para

que pesquisas possam ser realizadas com estes patgenos a qualquer momento com o
intuito de se buscar mtodos alternativos para o seu controle. O mtodo de preservao

ISSN 2316-5146 Pesquisa & Tecnologia, vol. 3, n.2, Jul-Dez 2006

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deve manter as caractersticas originais dos fitopatgenos, tais como capacidade de

esporular e patogenicidade (1). Essas caractersticas tm importncia para fins industriais,
de ensino ou de pesquisa (5). Os principais mtodos de preservao utilizados so
temperaturas baixas ou congelamento, nitrognio lquido, slica-gel, solo ou areia, tecido
seco de hospedeiro infectado, repicagens peridicas, gua destilada ou mtodo de
Castellani, liofilizao e leo mineral (1, 4). Dhingra & Sinclair (3) relatam que no existe
nenhum mtodo universal para armazenar patgenos de plantas, pois a seleo do mtodo
deve ser baseada na natureza do patgeno e nas suas vantagens e desvantagens.

Dhingra & Sinclair (3) relatam que alm do fato do mtodo de repicagem peridica implicar
em consumo de tempo e pessoal, muitos fungos podem adaptar-se ao crescimento
saproftico induzido pelo mtodo, levando os organismos a perderem a capacidade de
esporular e a patogenicidade. Este mtodo consiste em transferir, periodicamente, colnias
jovens de fitopatgenos, que crescem em meio de cultura, para novos meios. O fungo de
solo Sclerotinia sclerotiorum pode ser preservado neste mtodo por um curto perodo de
tempo (6).

Os patgenos podem ser preservados por longos perodos de tempo no mtodo chamado
de leo mineral (3). No entanto, neste mtodo, os fitopatgenos continuam a crescer e,
conseqentemente, variaes na sua morfologia, fisiologia e capacidade de esporular
podem ocorrer. O mtodo de preservao em leo mineral consiste primeiramente em
multiplicar o patgeno em meio de cultura dentro de um frasco (por exemplo, tubo de
ensaio) e, em seguida, cobrir essa colnia com leo mineral esterilizado. Posteriormente,
esse frasco pode ser mantido em temperatura ambiente ou de refrigerador. Segundo
Dhingra & Sinclair (3), o mtodo de leo mineral no muito indicado para preservar o
fungo de solo Fusarium sp. Neste mtodo, o fungo de solo Rhizoctonia solani pode ser
preservado por at 5 anos. Culturas de R. solani no podem ser preservadas em
temperatura de refrigerador (0-7C) e em temperatura de freezer (-20C), devido perda de
viabilidade (6). Culturas de Sclerotium rolfsii so armazenadas por longos perodos de
tempo (acima de 5 anos), utilizando o mtodo de preservao em leo mineral, sendo as
culturas mantidas neste mtodo em temperatura ambiente (6). Neste mtodo, ainda h o
relato de presevao de um ano ou mais dos fungos de soloPhytophthora sp. e Pythium sp.
Para o fungo Pythium sp., a preservao em leo mineral deve ser feita em ambiente escuro
e na temperatura de 15 a 23C (6).

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Muitos isolados de R. solani podem ser preservados por 10 anos ou mais em gros (6). Os
gros, como por exemplo de arroz, so desinfestados e assim que o fungo coloniz-los,
estes so colocados em placas de Petri estril, seladas e armazenadas em temperatura de
freezer.

Alguns patgenos de plantas podem ser preservados por longos perodos quando utiliza-se
o mtodo de armazenagem de tecidos secos de hospedeiro infectado. Posteriormente, estes
tecidos so mantidos em ambientes com baixa umidade e em temperatura de refrigerador
(3). O fungo de solo Thielaviopsis sp. pode ser preservado neste mtodo por 3 anos ou mais
(6). Para este fungo, as razes infectadas de suas plantas hospedeiras que so
armazenadas.

O mtodo Castellani muito utilizado para preservar fungos fitopatognicos, onde colnias
puras do fungo so colocadas em um pequeno frasco contendo gua destilada esterilizada
ou soluo salina, sendo posteriormente selado e armazenado em temperatura ambiente ou
de refrigerador (3). H relatos de preservao de muitos fungos neste mtodo, inclusive dos
que habitam o solo tais como Fusarium sp., R. solani, V. dahliae e Phytiumsp. (3, 6).
Especificamente para o fungo Pythium sp., h uma variao nesta tcnica, que consiste em
introduzir sementes de linho mais gua deionizada ao invs de utilizar somente gua
destilada ou soluo salina. Aps a repicagem de discos de miclio contendo o fungo para
os frascos, estes so mantidos em ambiente escuro e em temperatura de 15 a 25C. O
fungo Pythium sp. permanece preservado neste mtodo por 5 anos ou mais (6).

Recomenda-se o uso do mtodo de preservao em slica-gel quando os mtodos de

liofilizao ou nitrognio lquido no forem adequados. Este mtodo consiste em espalhar
uma suspenso de esporos de fitopatgenos sobre a slica-gel e, em seguida, armazen-la
em temperatura ambiente ou em baixa temperatura. Neste mtodo, h relato de
preservao de vrias espcies de Fusarium com durao de 5 anos, desde que a cultura
seja armazenada em temperatura de 5C (3).

H duas tcnicas de preservao de culturas de fungo no mtodo em solo. A primeira

consiste em utilizar solo estril infestado com inculo do patgeno. Este solo deve ser
imediatamente seco aps a infestao e armazenado em temperatura de refrigerador. Na
segunda tcnica, o solo previamente infestado com o microrganismo incubado, permitindo
assim, o crescimento do fungo. Para R. solani e Fusarium sp., h relato do uso deste
mtodo com preservao por longos perodos de tempo, mas com modificaes no mtodo
(3). Culturas de V. dahliae podem ser preservadas por vrios anos em um mistura de solo

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autoclavado (solo, perlita e turfa) quando mantida em temperatura de 5C (6). O mtodo de

armazenagem em solo tem sido trocado pelos mtodos de liofilizao ou nitrognio lquido
(3). Para o fungo de solo Thielaviopsis sp., o mtodo consiste em infestar solo estril com
baixa umidade ou substrato pobre em nutrientes (areia) com uma suspenso de
clamidsporos. Neste mtodo, o solo (ou a areia) infestado deve ser mantido em
temperatura ambiente ou em baixas temperaturas para que haja preservao do fungo por
longos perodos. Isolados deste patgeno podem apresentar variaes na cor da hifa,
tamanho e nmero de esporos e, tambm, na sua virulncia se mantidos em solo estril
com alta umidade (6).

O mtodo de congelamento utilizado somente para microrganismos que suportam

temperaturas abaixo de freezer e que no sofram interferncias em suas caractersticas ao
retornarem temperatura ambiente (3). H relatos da preservao do fungo de
solo M. phaseolina neste mtodo por longos perodos de tempo (6).

O mtodo de conservao em nitrognio lquido muito utilizado para fungos

fitopatognicos. Neste mtodo, a atividade metablica dos microrganismos muito baixa. O
nitrognio lquido no mutagnico e no influncia as caractersticas morfolgicas e
patognicas dos fungos (3). Isolados de R. solani, de Phytophthora sp. e dePythium sp. so
preservados neste mtodo por 5-6 anos (6). Recomenda-se a preservao de espcies
deFusarium neste mtodo (6). Nesta tcnica muito comum a adio de substncias
crioprotetoras (por exemplo, o glicerol) em suspenso de miclio ou de esporos de fungos
antes de colocar tais suspenses no nitrognio lquido. No entanto, no h relatos da
colocao de substncias crioprotetoras em suspenso de estruturas de resistncia de
fungos de solo, o que poderia implicar em aumento no tempo de preservao e garantir
ainda mais a no ocorrncia de modificaes genticas.

O mtodo de liofilizao tambm tem sido muito utilizado para armazenar microrganismos
por longos perodos. Neste mtodo, os patgenos ou suas estruturas perdem gua e so
armazenados na ausncia de oxignio e vapor de gua (3). Este mtodo utilizado para
preservar vrias espcies de Fusarium e de Pythium (6). Desde 1978, o centro de pesquisa
de Fusarium, na Universidade do Estado de Pensilvnia, vem empregando esta tcnica,
sendo que das cerca de 16.000 culturas, todas ainda esto viveis (6). H relato de
preservao do fungo Pythium sp. por 5 anos ou mais (6) quando se utilizada esta tcnica
em suas estruturas de resistncia (osporos).

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Isolados de Macrophomina so preservados na forma de microesclerdios formados sobre

palitos de madeira. Estes palitos so colocados em placa de Petri estril, selada e
armazenada em temperatura ambiente. H relato de preservao de isolados deste fungo
neste mtodo por at cinco anos (6). Microesclerdios de V. dahliaeso formados em
colnias do fungo, desenvolvidas em meio de BDA, por 15 dias, e seca com sulfato de clcio
por 72 horas a 22-25C. O p, contendo as estruturas de resistncia do fungo, colocado
em envelopes e, em seguida, estes envelopes so armazenados em ambiente seco. Nesta
condio, o fungo fica preservado por dois anos ou mais (6).

Figueiredo & Pimentel (4) relatam que quanto menor for a atividade biolgica dos
microrganismos menor a possibilidade de ocorrerem modificaes genticas. Isto ajuda a
preservar as caractersticas de esporulao e patogenicidade dos fitopatgenos. Portanto, a
preservao de estruturas de resistncia de fungos fitopatognicos habitantes do solo deve
ser almejada, pois na natureza, essas estruturas permanecem latentes no solo por longos
perodos de tempo na espera de plantas hospedeiras. Alm disto, outro ponto a ser
almejado descobrir a temperatura adequada para armazenar essas estruturas.

Bueno et al. (2), enfocando a idia de se preservar as estruturas de resistncia dos fungos
fitopatognicos habitantes do solo e de se buscar a melhor temperatura para armazen-las,
desenvolveram novas metodologias de preservao para os fungos Fusarium
oxysporum f.sp. lycopersici raa 2, M. phaseolina, S. sclerotiorum e S. rolfsii. De acordo com
Bueno et al. (2), a produo de clamidsporos de F. oxysporum f.sp.lycopersici raa 2 deve
ser feita em p de talco e a manuteno das estruturas neste mtodo deve ocorrer em
temperatura de geladeira por at um ano. Microesclerdios de M. phaseolina devem ser
produzidos em substrato areno-orgnico (Figura 2) e a manuteno das estruturas neste
mtodo deve ocorrer em temperatura de geladeira por at um ano. A produo de
esclerdios individualizados de S. rolfsii deve ocorrer na superfcie do meio de
BDA+oxitetraciclina e as estruturas precisam ser mantidas em temperatura ambiente por
at um ano. J a produo de esclerdios individualizados de Sclerotinia sclerotiorum deve
ser feita em meio de feijo+fub e suas estruturas devem ser mantidas em temperatura de
freezer por at um ano.

De acordo com Singleton et al. (6), esclerdios de S. sclerotiorum, aps serem removidos de
plantas doentes ou de meios de cultura, podem ser preservados por muito tempo desde que
mantidos em temperatura de 2-5C.

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Figura 2. Frasco com substrato areno-orgnico, contendo microesclerdios

de Macrophomina phaseolina, e pronto para ser armazenado em temperatura
de geladeira (5 2C).

Fonte: Bueno, C.J. Produo e preservao de estruturas de resistncia de fungos

fitopatognicos habitantes do solo. Botucatu, 2004. 101f. Tese em
Agronomia/Proteo de Plantas Faculdade de Cincias Agronmicas, Universidade
Estadual Paulista.

Novos mtodos para preservar estruturas de resistncias de fungos fitopatognicos

habitantes do solo devem ser desenvolvidos.

Para finalizar, o tempo mximo de preservao precisa ainda ser determinado para muitos
mtodos j desenvolvidos para alguns fungos de solo.

Referncias

1. APARECIDO, C. C.; EGYDIO, A. P. M.; FIGUEIREDO, M. B. Avaliao de trs mtodos

para preservao de fungos fitopatognicos. Summa Phytopathologica, Jaboticabal, v. 27,
n. 4, p. 421-424, 2001.

2. BUENO, C. J.; AMBROSIO, M. M. Q.; SOUZA, N. L. Preservao de fungos

fitopatognicos habitantes do solo. Summa Phytopathologica, Botucatu, v. 32, n. 1, p. 42-
50, 2006.

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3. DHINGRA, O. D.; SINCLAIR, J. B. Basic plant pathology methods. 2.ed. Boca Raton:
CRC Press, 1995. 434 p.

4. FIGUEIREDO, M. B.; PIMENTEL, C. P. V. Mtodos utilizados para conservao e

fungos na micoteca da seo de micologia fitopatolgica do instituto biolgico. Summa
Phytopathologica, Piracicaba, v. 1, n. 4, p. 299-302, 1975.

5. PIMENTEL, C. P. V.; PITTA, G. B. P.; FIGUEIREDO, M. B. Preservao da

patogenicidade de alguns fungos conservados em gua destilada. O Biolgico, So Paulo,
v. 46, n. 12, p. 279-308, 1980.

6. SINGLETON, L. L.; MIHAIL, J. D.; RUSH, C. M. (Ed.). Methods for research on

soilborne phytopathogenic fungi. St. Paul: The American Phytopathological Society, 1992.
265p.

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