Secuenciacin de cidos

Nucleicos

Recuerde mirar el cuaderno 114 y 120 entregar un taller

 DEFINICIN
La Secuenciacin de ADN es un conjunto de
mtodos y tcnicas bioqumicas para determinar
el orden de los nucletidos (A, C, G, T) en un
fragmento (oligonucleotidos) de ADN
La rama de la Gentica que se fundamenta en la
secuenciacin es la Genmica
 Genmica
Definicin:
Es el estudio de los genomas y del rol que tienen
los genes en determinar la estructura,
dirigir el crecimiento y desarrollo,
y en controlar las funciones de los seres vivos
El estudio de la genmica comienza con:
1. La secuenciacin del ADN.
2. Comparar las secuencia para identificar qu
fragmentos o zonas corresponden a genes
3. Identificar la funcin del gen
Cada gen descubierto a travs de proyectos de
secuenciacin se extienden para ver su
aplicacin en el sector de la industria
 Porqu es importante el genoma
En l estn todas las instrucciones genticas para
el desarrollo y funcionamiento de un organismo
En l se ubican los genes (Secuencias):
codificantes, espaciadoras, reguladoras, que
dejaron de ser funcionales y muchas otras
En l se depositan los cambios (mutaciones) que
se han acumulado a lo largo de la historia
evolutiva de la especie y de todas sus
antecesoras..
 Porqu se secuencia el genoma?

1. Para descifrar la funcin de los genes en

diferentes organismos.
2. Para establecer relaciones de parentesco entre
individuos de una misma especie o de especies
diferentes
3. Para conocer la estructura y funcin de un gen y
as aislarlo y emplearlo en la modificacin
gentica de otros organismos, y as obtener
nuevas caracteres en un individuo (plantas,
clulas y organismos para el mejoramiento de la
agricultura , industria y en la salud)
 Por qu se secuencian genomas

4. Para identificar las enfermedades en los seres

vivos
5. Para identificar las especies (plantas, mamferos,
insectos, etc.), sobre todo las de importancia
econmica
 Interrogantes que trae la
secuenciacin de genomas
Cmo son los procesos de regulacin de la
expresin de los genes
Cmo se identifican las diferencias entre el
genoma de individuos de una misma especie
De qu manera las ms sutiles alteraciones
podran predisponer a cada individuo a una
enfermedad
 APLICACIONES DE LA SECUENCIACIN DE ADN

Identificar genes
Estudiar fragmentos de ADN
Hacer plantas transgnicas
Terapias gnicas
Diagnstico de enfermedades genticas
Deteccin de mutaciones
Identificacin de especies y control de cruces
Secuenciacin de ADNs fsiles
Proyecto genoma humano
 Genmica estructural

Realiza la caracterizacin y localizacin de las secuencias

de ADN de los genes, para crear mapas genticos de los
organismos.

Genmica funcional

Revela el funcionamiento del gen con base a la

informacin sistematizada que se tiene de otros genes a
los cuales se les a identificado su funcin
Primer organismo vivo que tuvo su genoma
secuenciado fue la bacteria Haemophilus
influenzae, en 1995 por Craig Venter
Causa: la meningitis, neumona y epiglotitis

Haemophilus influenzae 01. Publicado bajo la licencia Dominio pblico va Wikimedia Commons

https://www.youtube.com/watch?v=dQobQky7Nlg
Fuente: rea de Bioinformtica y Salud Pblica. Instituto de
Salud Carlos III. Madrid. Espaa. http://infobiochip.isciii.es
Bioinformtica
El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha
acelerado la investigacin y los descubrimientos
en biologa.
 La secuenciacin necesita cido nucleico puro.
Genoma grande se fragmenta con enzimas de
restriccin.
Para obtener cantidades de fragmentos de
ADN se emplea la clonacin

Qu son las enzimas de restriccin?

Qu es la clonacin molecular?
 Tipos de secuenciacin
El mtodo enzimtico de cadena terminal o
dedidesxidos propuesto por Federick Sanger
El mtodo de degradacin qumica por
Maxam- Gilbert

Federick Sanger Allan Maxam Walter Gilbert

1942- 1932-
Cules son los dos mtodos bsicos de secuenciacin?
Ambos mtodos tienen en comn
1. Diferenciar fragmentos de una base
2. Necesita marcacin
3. Necesitan un gel de poliacrilamida
4. Tomar fotografa para la visualizacin de los
fragmentos
Ambos mtodos son diferentes
conceptualmente

Cul es la diferencia entre el mtodo enzimtico y el qumico?

Qu tienen en comn los mtodos de secuenciacin
El mtodo de Sanger se basa en la sntesis de
una nueva cadena de ADN cuya elongacin se
detiene mediante la incorporacin de una base
modificada o terminador
El mtodo de Maxam & Gilbert esta basado en
la degradacin qumica parcial de la cadena
original de ADN.
El mtodo enzimtico de cadena
terminal o de didesxidos
Materiales
Hebra de ADN
Iniciadores, cebadores primers
Desoxirribonucletidos dATP, dCTP,
dGTP, dTTP
Didesoxirribonucletidos ddATP,
ddCTP, ddGTP, ddTTP
Enzima polimerasa de ADN
MgCl y KCl2
Nucletido

didesxidos
 Pasos
El mtodo enzimtico de cadena terminal o de
didesxidos
1. Se necesita ADN molde de
hlice sencilla, para esto se
clona en un vector.
 2. Pasos
El mtodo enzimtico de cadena terminal o de
didesxidos

2. Un enzima que replique el ADN, la ADN

Polimerasa I del bacterifago T4. va
aadiendo nucletidos a partir de un cebador
o "primer".
 3. Pasos
El mtodo enzimtico de cadena terminal o de
didesxidos

3. Un cebador = oligonucletido = "primer" ( 20

pb) marcado con radioactividad
para que la ADN polimerasa I comience a
aadir nucletidos por el extremo 3' OH.
 Pasos
El mtodo enzimtico de cadena terminal o de
didesxidos

4. Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP,

dGTP y dTTP). Se marcan o no con
radioactividad, depende del cebador
 Pasos
El mtodo enzimtico de cadena terminal o de
didesxidos

5. Nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y

ddGTP), nucletidos modificados Se
incorporan a la cadena de ADN naciente, pero
no es posible que se una a ellos ningn otro
nucletido por el extremo 3'. Por tanto se
termina la sntesis de la cadena de ADN.
 Descripcin del mtodo enzimtico de
terminacin de cadena

1. Se realiza en cuatro tubos diferentes,

cuatro mezclas de reaccin.
2. Se producen una serie de molculas
de ADN de nueva sntesis de diferente
longitud que terminan todas en el
mismo nucletido y marcadas todas
radiactivamente por el extremo 5'
(todas contienen en el extremo 5' el
cebador utilizado). Parte de un gel de secuenciacin
con marcaje radiactivo
 Descripcin del mtodo enzimtico
de terminacin de cadena
3. Se separan por tamaos mediante
electroforesis en geles verticales de
acrilamida muy finos. Los productos
de cada una de las cuatro mezclas de
reaccin se insertan en cuatro calles o
carriles diferentes del gel.

Parte de un gel de secuenciacin

con marcaje radiactivo
 Descripcin del mtodo enzimtico
de terminacin de cadena
4.El gel se pone en contacto con una pelcula
fotogrfica de autorradiografa.
El mtodo enzimtico se automatiz
 Diferencias entre enzimtico y automtico

1. Tipo de marcaje.
Automtico = Fluorescencia
Enzimtico = Radiactividad los
Cebadores o ddNTPs

Vista del comienzo de un ejemplo de lectura con el terminador (fondo coloreado)

 Diferencias entre enzimtico y automtico

2. La deteccin de los fragmentos de ADN.

Automtico = al mismo tiempo que la
electroforesis (simultaneo)
Enzimtico = primero el gel y despus se lee
el gel

Grfico de una secuencia de ADN obtenido por electroforesis capilar(electroferograma)

 Igualdad entre enzimtico y automtico

1. Cuatro mezclas de reaccin, cada una con

nucletido trifosfato (dTTP) marcado con un
fluorocromo distinto.
 El Mtodo de Degradacin Qumica
Maxam Gilbert
1976-1977

Allan Maxam y Walter Gilbert

Mtodo para secuenciar ADN basado en la
modificacin qumica del ADN y posterior
escisin en bases especficas.
 Mtodo de degradacin qumica
Maxam Gilbert
1976-1977
1. genera rupturas en cada una de las cuatro
reacciones (G, A+G, C, C+T).
2. Los fragmentos se separan por tamao en un
gel de electroforesis.
3. Visualizacin de los fragmentos.
 El mtodo de degradacin qumica
Maxam Gilbert
1976-1977
Tcnica en desuso debido a su complejidad,
Uso de productos qumicos peligrosos

Dificultades para hacerla.

No puede adaptarse para utilizar un kit

biolgico estndar.

Marcaje con radioisotopos

Ventaja de la degradacin Qumica
No requiere polimerasa de ADN

No requiere primers o iniciadores

Se puede secuenciar fragmentos de

ADN muy pequeos
El mtodo de degradacin qumica por
Maxam Gilbert
Pasos:
Cadena sencilla de ADN marcada en los extremos
DMS sulfato de dimetilo corta en G nicamente
Hidrazina corta en T y en C al mismo tiempo
Hidrazina + NaOH corta en C nicamente
cido frmico corta en G y A al mismo tiempo
Piperidina cataliza el rompimiento de las bases
modificadas
El mtodo de Maxam & Gilbert esta basado en
la degradacin qumica parcial de la cadena
original de ADN.