Cultivo de tejidos vegetales I

Unidad 3. Tcnicas de esterilizacin y diseo

de un laboratorio de cultivo de tejidos
vegetales

Cultivo de tejidos vegetales I

Unidad 3. Tcnicas de esterilizacin

y diseo de un laboratorio de cultivo
de tejidos vegetales

Sexto semestre

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Unidad 3. Tcnicas de esterilizacin y diseo
de un laboratorio de cultivo de tejidos
vegetales

ndice

Unidad Tcnicas de esterilizacin y diseo de un laboratorio de cultivo de tejidos

vegetales .................................................................................................................. 2
Presentacin de la unidad .......................................................................................... 2
Propsitos de la unidad .............................................................................................. 2
Competencia especfica............................................................................................ 2
3.1. Tipos de esterilizacin...............3
3.1.1. Esterilizacin por calor seco..........3
3.1.2. Esterilizacin por calor hmedo.4
3.1.3. Esterilizacin por filtracin.........5
3.1.4. Esterilizacin superficial.6
2.2. Manipulacin asptica...........8
3.2.1. Cristalera y equipo de diseccin......8
3.2.2. Inculos vegetales...9
3.2.3. Medios de cultivo y constituyentes termolbiles...14
3.2.4. Siembra y transferencia de inculos...15
3.3. Diseo de un laboratorio de tejidos vegetales.....16
3.3.1. rea de lavado y esterilizacin17
3.3.2. Cuarto para la preparacin de medios y material vegettico.17
3.3.3. rea de transferencia (siembra y diseccin).....18
3.3.4. Sala de incubacin....18
3.3.5. Almacn de reactivos19
3.3.6. Invernadero.19
Actividades ............................................................................................................. 20
Autorreflexiones...................................................................................................... 20
Cierre de la unidad ................................................................................................... 20
Para saber ms ...................................................................................................... 21
Fuentes de consulta.21
Anexo ..................................................................................................................... 23

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Unidad 3. Tcnicas de esterilizacin y diseo de un laboratorio de

cultivo de tejidos vegetales

Presentacin de la unidad

Hemos llegado a la tercera y ltima unidad. Esto quiere decir que hemos estudiado los
conceptos fundamentales relacionados al cultivo in vitro, el proceso histrico y empleo
general de los componentes de un medio de cultivo. Ahora, esta unidad presenta las
actividades al interior del laboratorio. Aunque siempre los datos se presentan desde el
punto de vista terico, esta informacin es importante para llevarse a cabo en cada
proceso y manipulacin de los cultivos de tejidos vegetales.

Al concluir con esta primera materia, estars preparado para documentar los procesos
necesarios en el establecimiento de un cultivo de tejidos vegetales, a travs de los
diversos protocolos enmarcados en el cultivo de tejidos vegetales II.

Propsitos de la unidad

Determinar las actividades dentro de un laboratorio

que coadyuven al establecimiento de un cultivo in vitro.
Identificar las tcnicas de esterilizacin y de
manipulaciones aspticas durante el trabajo in vitro.

Competencia especfica

Determinar actividades de laboratorio para establecer un cultivo in

vitro, mediante el estudio de tcnicas de esterilizacin y de
manipulaciones aspticas.

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3.1. Tipos de esterilizacin

Un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales es esencialmente igual a cualquier otro, sin

embargo es de suma relevancia preservar las condiciones de esterilidad. Al respecto.
Manzanares comenta (1991):

Las condiciones de esterilidad de ste son de fundamental importancia porque

todos los medios empleados contienen nutrientes, los cuales facilitan el
crecimiento de muchas bacterias y hongos. El crecimiento abundante de ellos
destruira el crecimiento, ms lento, de los tejidos vegetales; aun los
contaminantes con crecimiento lento son indeseables, pues pueden producir
toxinas que afectan el crecimiento de las clulas vegetales (Manzanares, 1991,
pg. 31)

Por estas razones, el material vegetativo se desinfesta superficialmente antes de iniciar

un cultivo in vitro, y todo el manejo de los tejidos se hace en condiciones aspticas en una
cmara de flujo laminar de aire, en reas especficas para este propsito. As todos los
medios, instrumentos y recipientes de cultivo deben esterilizarse para matar las clulas
vegetativas, esporas y otras estructuras reproductivas para los microorganismos, que son
los causantes de la contaminacin de los cultivos.

Cabe mencionar que la esterilizacin definida por la Organizacin Mundial de la Salud,

OMS (2013), es la tcnica de saneamiento cuya finalidad es la destruccin de toda forma
de vida, aniquilando todos los microorganismos, tanto patgenos como no patgenos,
incluidas sus formas esporuladas, altamente resistentes.

Ahora presentaremos los diferentes tipos de esterilizacin y su empleo general.

3.1.1. Esterilizacin por calor seco

Los recipientes de cristal e instrumentos para la diseccin/ manipulacin pueden ser

esterilizados por calor seco, as como aluminio y contenedores metlicos cerrados.

Hoy en da ciertos tipos de plsticos de uso en laboratorio pueden tambin ser

esterilizados por calor seco, por ejemplo, el polipropileno, polimetilpropileno, polialmeros
y tefln pueden ser repetidamente esterilizados a 121C (Bhojwani, S.S. y Razdan, M.K.,
1996).

La esterilizacin por calor seco, se realiza a travs de un horno a temperaturas entre 160-
180C por 2-4 horas. Es inadecuado para materiales orgnicos e inorgnicos. La
esterilizacin del calor seco provee una baja circulacin y penetracin de la temperatura,

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por ello la carga del horno es esencial. La cristalera debe permanecer en el horno hasta
enfriarse, nunca retirarse caliente. Si se retira antes de estar lo suficientemente fro, el aire
del exterior que est ms fro, es succionado por el horno, exponiendo el material a una
carga de contaminacin bacteriana y eleva el riesgo de fractura. Existen cajas metlicas
para contener este tipo de material (cnulas).

La incineracin es proceso muy efectivo para la esterilizacin y disposicin final. Es

tambin usado para esterilizaciones puntuales de asas bacteriolgicas o pinzas, tales
como los empleados en procedimientos de cultivo microbiolgico.

3.1.2. Esterilizacin por calor hmedo

La esterilizacin por vapor hmedo, es el mtodo ms socorrido. En l slo es inadecuado

introducir el papel aluminio y los contenedores metlicos cerrados.

Existen en la actualidad diferentes tipos de autoclaves, sin embargo todas ellas requieren
de cuidados puntuales similares, es la razn de indicar a continuacin los pasos para el
empleo de una autoclave de vapor:

Tabla 1. Procedimiento 1
Empleo de una autoclave de vapor
Paso Instrucciones
Asegurarse que la autoclave tenga el nivel de agua suficiente, el agua debe ser
1
destilada con el fin de evitar incrustaciones en la resistencia.
Colocar en el interior de la autoclave los materiales a ser esterilizados, si se trata
2 de frascos de vidrio con tapa, se sugiere dejarla sobrepuesta. Cada uno de ellos
deber estar debidamente empaquetado.
Cerrar la autoclave, recordando cerrar los tornillos sujetadores en forma de cruz,
3
esto con el fin de proveer un cerrado uniforme.
Abrir la vlvula de salida y encender el instrumento, esto proporcionar un
calentamiento inicial de la cmara y eliminar todo el aire contenido en el. Este
4 paso se completa cuando la salida del aire por la vlvula no es intermitente y se
aprecia un sonido continuo. Si se cierra la vlvula antes de la indicacin anterior,
al final del proceso dejar mojados todos los paquetes.
Cerrar la vlvula de salida. Una vez cerrada la vlvula dejar que el control
automtico mantenga la presin y temperatura a los niveles especificados. En
caso de no contar con un control automtico, observe el manmetro del
5
instrumento y cuando se acerque a los 121C o 15 lb/in2 (1.06 kg/cm2), apagarlo,
cronometrar el tiempo, asegurndose que la aguja no baje de la temperatura o
presin ya mencionada.

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Una vez concluido con el tiempo fijado, desconectar el instrumento y dejar que
6
se descomprese hasta que la aguja indique cero de presin.
Abrir la tapa de la autoclave de la forma en que fue cerrada, sacar el material
estril con los cuidados necesarios para evitar su contaminacin. Observar si el
7
agua residual se encuentra limpia, sin no lo est, drenar, limpiar el instrumento y
agregar nuevamente agua hasta la indicacin de nivel.

El tiempo total del ciclo antes descrito esto es, la suma de todas las etapas descritas,
depende del tipo del aparato, pero de manera general un ciclo de 15 a 20 min puede
demorar entre 50 a 70 min.

Figura 1. Autoclave horizontal (Scipho, 2013).

3.1.3. Esterilizacin por filtracin

La esterilizacin por filtracin es empleada principalmente para soluciones termolbiles

(ver la siguiente ilustracin). Estas pueden ser esterilizadas al pasar a travs de filtros
estriles que pueden retener bacterias, tales como, filtros de membrana (derivados de
celulosa), plsticos, cermica porosa o filtros de vidrio sinterizado, o combinaciones de
ellos. Los filtros que contienen asbesto no deben ser usados.

Se deben tomar las medidas adecuadas para evitar la prdida de soluto por adsorcin
sobre el filtro y evitar la liberacin de contaminantes en el filtro. Filtros adecuados evitarn
el paso de microorganismos, pero la filtracin debe ser seguida por una transferencia
asptica de la solucin esterilizada de los envases definitivos que se sellan
inmediatamente con mucho cuidado para excluir cualquier recontaminacin.

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Figura 2. Filtro ensamblado a una jeringa esterilizada, conteniendo un pequeo volumen de

lquido. La aguja no es siempre requerida (Scipho, 2013).

Generalmente, deben de ser usadas membranas no mayores a 0.22 m de poro nominal.

La eficacia del mtodo de filtracin debe ser validada si se emplean tamaos de poros
ms grandes. Es importante revisar la integridad del filtro de acuerdo a las instrucciones
del fabricante.

Todos los filtros, tubos y equipos utilizados "despus del proceso" deben ser estriles. Los
filtros capaces de soportar el calor pueden ser esterilizados en el montaje antes de su uso
en autoclave a 121C por 15 - 45 minutos, dependiendo del tamao del conjunto de filtro.
La eficacia de esta esterilizacin debe ser validada. Para la filtracin de un lquido en el
que es posible el crecimiento microbiano, el mismo filtro no se debe utilizar para los
procedimientos que duran ms de un da de trabajo.

En el cultivo de tejidos vegetales, generalmente se emplean filtros que se usan una sola
vez y son comprados estriles.

3.1.4. Esterilizacin superficial

La esterilizacin superficial es empleada de manera comn en el cultivo de tejidos

vegetales, sobre todo para desinfestar explantes y para esterilizar instrumento de
manipulacin de uso continuo. Los agentes desinfectantes ms comunes son:

Hipoclorito de sodio (NaOCl), este se encuentra en los blanqueadores

de lavandera, la cual es una solucin con concentracin aproximada de
5.25% (v/v). De manera general el blanqueador de lavandera se diluye
en agua en concentraciones de 5 a 25% (v/v), con dos gotas de Tween-
20 por cada 100 ml (Tween-20/100 ml). La duracin del tratamiento es
generalmente de 5 a 30 min seguido por tres a cinco enjuagues con
agua destilada. Las soluciones obtenidas a partir de un blanqueador

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comercial necesitan ser elaboradas previo a su uso, ya que el gas cloro se disipa. Es
preferible emplear botes pequeos de cloro y etiquetarlos cuando se ha abierto. Algunos
laboratorios ajustan el pH del blanqueador ya diluido a un pH cercano a 7, usando HCl
5M. Lo anterior debido a que el cloro se disipa ms rpidamente a un pH menor.

Hipoclorito de calcio (Ca(OCl)2) al 0.8% (p/v) (8 g de hipoclorito de calcio en un litro de

agua, agitar por 1-5 min, permitir que se precipite, decantar la solucin, y mezclar con
partes iguales de agua), adicionar dos gotas de Tween-20/100 ml, tratar el tejido por 5-30
min.

Alcohol etlico o isopropilico al 70% (v/v). Este agente puede ser usado para limpiar el
material vegetal antes de la desinfestacin, y puede ser usado para sumergir el material
vegetal durante 1-5 min antes o despus del tratamiento con hipoclorito de calcio o sodio.
Perxido de hidrgeno (H2O2). El H2O2 es un oxidante fuerte, y puede ser usado del 3-
10% (v/v) por 1-30 min, antes de esterilizar enjuagar con agua en combinacin con otros
desinfectantes o solo. Una interaccin entre el NaOCl y el H2O2 es txico al tejido para
plantas, por lo que es importante enjuagar el explante vigorosamente si ambas soluciones
son empleadas.

El gas cloro (Cl2) es efectivo para desinfestar en seco semillas. Se colocan semillas
secas en una caja de Petri dentro de un desecador al vaco (esto debe llevarse a cabo
bajo una campana de extraccin). Abrir parcialmente la tapa de la caja de Petri, colocar
100 ml del blanqueador comercial en un vaso de precipitados dentro del desecador. Abrir
en el desecador una rendija e introducir lentamente 3.3 ml de HCl concentrado con ayuda
de una pipeta, al vaso con blanqueador. Inmediatamente sellar el desecador para que el
gas cloro sea generado y concentrado. Despus de 16-18 h, abrir cuidadosamente el
desecador y usar una varilla de vidrio para cerrar la caja de Petri. Cerrar la campana de
extraccin nuevamente y permitir que el gas cloro se disipe por un par de horas. Sellar la
caja de Petri con parafilm y almacenar las semillas estriles hasta su uso.

La sal disdica del cido dicloroisocianrico (NaDCC), puede ser menos txica a los
tejidos de planta que son sensibles al hipoclorito de sodio y calcio y no necesita el
enjuagado.

Los antibiticos (gentamicina y amplicilina) pueden ser benficos para reducir la

contaminacin sobre el explante despus de la desinfestacin empleando etanol o
blanqueador. Una inmersin del explante en una solucin antibitica (51-100 mg/l)
durante 30 min antes del cultivo, puede eliminar algunos microorganismos.

Por otra parte, los instrumentos usados para la manipulacin asptica, tales como pinzas,
bisturs, agujas y esptulas, son normalmente esterilizadas por inmersin en alcohol al
95% en etanol, seguido de flameado y enfriado. Esto se lleva a cabo al inicio del trabajo

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de transferencia y varias veces durante la operacin (Bhojwani, S.S. y Razdan, M.K.,

1992). Esta operacin debe ser realizada con cuidado, separando el recipiente
conteniendo el alcohol a un lado de la campana de transferencia lejos de la flama. Nunca
coloque el alcohol al lado de un mechero de bunsen o lmpara de alcohol.

3.2. Manipulacin asptica

En funcin a las consideraciones indicadas en la seccin 3.1, existen dos precauciones

obvias a seguir: i) no compartir el rea de cultivo de tejidos vegetales con secciones de
microbiologa o patologa y ii) remover cultivos contaminados del rea de cultivo tan
pronto sea detectado. De igual manera, es importante sabe que existen varias posibles
fuentes de contaminacin al medio de cultivo: a) el recipiente de cultivo, b) el medio
mismo, c) el explante, d) el medio ambiente del rea de transferencia, e) los instrumentos
usados y la manipulacin del material vegetal durante la inoculacin y subcultivo, y f) el
medioambiente del cuarto de cultivo. Sabiendo lo anterior se presentan a continuacin
alternativas de cuidado a los cultivos contra la contaminacin (Bhojwani, S.S. y Razdan,
M.K., 1996).

3.2.1. Cristalera y equipo de diseccin

Cuando existan materiales de cristal nuevos, solo debern ser usados despus de un
lavado vigoroso. Tradicionalmente se ha empleado cidos fuertes como el dicromato de
sodio y el cido sulfrico, pero por motivos medioambientales, hoy en da se prefiere
protocolos ms amigables con el medioambiente, por ejemplo la cristalera nueva debe
ser sumergida en una solucin de HCl 5% durante toda la noche, seguida de un enjuague
con agua corriente y despus con agua destilada para remover completamente toda traza
de cido.

Cuando se trate de material usado, lavar cuidadosamente con detergentes especiales

para laboratorio en funcin a la delicadeza del trabajo, por ejemplo el uso de extran al 2-
3% es adecuado para sustiuir el empleo de cido, seguido por los enjuagues con agua, tal
como se describi anteriormente. Sin embargo el uso de detergentes comerciales
tradicionales es empleado sin problema en algunos laboratorios.

En el caso de contar con material conteniendo agar, es

adecuado fundirlo empleando un autoclaveado a baja
temperatura. Si el caso implica material contaminado, no
deber abrirse hasta que est debidamente esterilizado, de
acuerdo a las especificaciones dadas en la seccin 3.1.2.

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Una vez lavado el material, se deja escurrir y/o secar en gabinetes de aire caliente
(~75C) y almacenarlo en lugares libres de polvo.

Todos los recipientes de cristal e instrumentos para la diseccin, son frecuentemente

esterilizados juntos con el medio de cultivo por vapor hmedo.

Si la esterilizacin se lleva a cabo empleando vapor seco,

la manipulacin se llevar de acuerdo al material estril.
Por ejemplo, si se trata de un bistur, pinzas o tijeras de
diseccin, estas se colocan dentro de un tubo de traslado
conteniendo alcohol al 95% sumegidas dos terceras
partes. El tubo de traslado deber contener en el fondo
algodn o un pao que evite que el instrumento a trasladar
rompa el tubo. Es conveniente que el tubo sea colocado
dentro de un vaso robusto o en un vaso de precipitados, de
igual manera colocar un poco de agua en l, proveera una mayor estabilidad y evitar que
el tubo de traslado se caiga. Cuando desee emplear el instrumento, este deber ser
flameado antes de su uso (Smith, 2013).

Si el esterelizado se realiza por vapor hmedo, la cristalera deber ser cubierta con
tapones (algodn y gasa) cubiertos con papel tipo estraza o en su caso por papel
aluminio. En caso de instrumentos, stos pueden ser forrados en su totalidad para ser
destapados bajo una campana de flujo laminar, siguiendo el protocolo de uso ya
mencionado.

3.2.2. Inculos vegetales

Figura 3. Explante de Lobelia cardinalis (SciPhoto, 2013).

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Uno de los ms grandes problemas en un laboratorio de cultivo de tejidos es el de tener

una infestacin de insectos, especialmente caros. Existen diferentes tipos de caros,
Dermataphagoides pteronyssimus, Dermataphagoides farinae y Tyrophagus putrescentiae
o caros del polvo, el cual puede ser un problema mayor. Los caros pueden vivir en los
ductos y filtros del aire acondicionado y pueden encontrarse en la ropa y cabello. Pueden
ser desplazados por las corrientes de aire y generalmente son ms activos durante el
inicio de la noche y son atrados por la humedad y material orgnico. Se alimentan de
hongos y no de material vegetal. Su ciclo de vida media es de cerca de dos semanas. Los
cultivos son contaminados debido al desplazamiento de caros en el interior o al exterior
de los medios de cultivo sin ser notados, hasta que sus huellas son visibles debido al
crecimiento de hongos, los cuales fueron diseminados por las patas de los caros. Los
insectos pueden ser introducidos por el personal del laboratorio (sobre el cabello, sobre
sus ropas, zapatos, etc.), por las macetas de plantas, por explantes grandes de plantas,
por laboratorios adyacentes con trabajos sobre insectos o por el almacenamiento de
grandes cantidades de semillas o material seco de plantas. La contaminacin de ductos
del aire acondicionado, especialmente con organismos fngicos
tambin es comn (Smith, 2013).

No debe olvidar que aunque la mayora de los microorganismos se

encuentran en la superficie de los rganos vegetales, existen
evidencias de la presencia de algunos en la parte interna de las
plantas. As, se ha reportado que existen bacterias en los espacios
intercelulares de las hojas de petunia, lo cual trae como consecuencia
una serie de problemas durante el cultivo, pues no pueden ser
eliminadas por la desinfestacin superficial del tejido. Las bacterias
contaminantes que son encontradas con mayor frecuencia, pertencen a los gneros
Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter, Klebsiella, Staphylococcus, Lactobacillus, sin
embargo, su crecimiento en el medio de cultivo puede controlarse por la adicin de
antibiticos. Las siguientes combinaciones de antibiticos se han aplicado con xito en
cultivo de tejidos de plantas: Cefotaxime, Gentainicina, Rifampicina, Nystatina +
Carbenicilina, Gentamicina + Amphotericina B, Vancomicina HCI + Mycostatin and
Streptoinicina + Carbenicilina. Existen reportes de toxicidad causada en
algunos cultivos por: Penicilina, Estreptomicina, Bactericina y Sparsomicina (Manzanares,
1991).

Algunos explantes, tales como semillas muy pequeas o esporas de helechos, son
desinfectados superficialmente en tubos con tapa de centrfuga cnicos, despus del
centrifugado el pellet de semillas se obtiene decantando la solucin con el empleo de
una pipeta (Smith, 2013) (ver seccin 3.1.4.).

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No se debe olvidar que aunque la mayora de los microorganismos se encuentran en la

superficie de los rganos vegetales, existen evidencias de la presencia de algunos en la
parte interna de las plantas. As, se ha reportado que existe una bacteria en los espacios
intercelulares de las hojas de petunia, lo cual trae como consecuencia una serie de
problemas durante el cultivo, pues no pueden ser eliminadas por la desinfestacin
superficial del tejido. Sin embargo, su crecimiento en el medio de cultivo puede
controlarse por la adicin de antibiticos. Otro ejemplo lo proporciona una bacteria
sistmica, encontrada en yemas auxiliares de vainilla (Manzanares, 1991).

El trabajo que se realiza en la sala de siembra o cultivo puede hacerse en una mesa de
laboratorio, creando un rea estril con unos mecheros Bunsen, pero para reducir la
posibilidad de contaminacin, el trabajo se lleva a cabo en un rea estril, proporcionada
por una cmara de flujo laminar de aire. Lo ideal consiste en tener estas cmaras en
cuartos independientes, los cuales se esterilizan previamente con luz ultravioleta (UV).
Estos cuartos tienen, adems de la cmara, una superficie como rea de trabajo y los
servicios esenciales, as como un filtro de aire o unidad de ventana. En una cmara de
flujo laminar de aire, este es forzado bajo presin a travs de un filtro por la parte trasera
de la cmara y fluye sobre el rea de trabajo a una velocidad uniforme. La velocidad del
flujo de aire evita que las partculas se depositen en el rea de trabajo. Estas cmaras
pueden ser de uso individual o para dos o tres personas (Manzanares, 1991).

Figura 4. Mechero Bunsen (Scipho, 2013).

Una campana de transferencia de flujo laminar, est equipada con una ventilacin de
presin positiva con un filtro HEPA (high-efficiency particulate air) a prueba de bacterias.
Una campana de flujo laminar puede ser de dos tipos. Generalmente el aire es forzado a
entrar al gabinete a travs de un filtro de polvo y de un filtro HEPA, posteriormente
direccionada en flujo vertical u horizontal sobre la superficie de trabajo de manera
constante. El constante flujo de aire filtrado libre de bacterias y esporas de hongos
previene que el aire no filtrado y partculas se depositen sobre el rea de trabajo,
mantenindolo limpio y desinfectado. Un gabinete simple de transferencia es un encierro
de plstico o gabinete con una lmpara de UV. En una campana de transferencia, se
debe tener listo algunas herramientas de uso comn tales como bisturs, pinzas de

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diseccin largas, y algunas veces esptulas. Ocasionalmente son necesarias pinzas con
punta, tijeras, hojas de rasurar o sacabocados (Beyl, 2005).

Figura 5. Campanas de flujo laminar (Scipho, 2013).

Algunas personas prefieren realizar manipulaciones estriles sobre superficies pre-

esterilizadas, tales como cajas de Petri o tejas de cermica. Otras alternativas de trabajo
es el empleo de toallas de grado laboratorio. Estas pueden ser protegidas en papel
aluminio y ser esterilizadas antes de su uso. El siguiente protocolo de trabajo
(procedimiento 2), es un ejemplo del trabajo dentro de una campana (de transferencia) de
flujo laminar (Beyl, 2005).

Tabla 2. Procedimiento 2
Trabajo bajo la campana de flujo laminar (Beyl, 2005)
Paso Instrucciones
1 Encienda la campana de flujo laminar, observar que se mantiene aire a presin
positiva. Esto asegura que todo el aire que pasa sobre la superficie de trabajo es
estril. Se debe sentir el flujo de aire contra el rostro (si se trata de un flujo
horizontal). Asegurar que ninguna corriente de aire proveniente de una ventana o
aire acondicionado interfiera con el flujo de la campana.

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2 Usar un bote con espray conteniendo etanol al 70%

(v/v), aplicar en el interior de la campana, pero NUNCA
aplicar al filtro HEPA. Este tipo de alcohol es ms
efectivo que el alcohol absoluto, ya que el etanol al
70% desnaturaliza el DNA. Usar una pieza de gasa o
algodn para saturar con etanol al 70% ayudando a
distribuirlo de manera uniforme. Permitir que seque. Para
mantener la lnea de limpieza, cualquier cosa que sea colocada
al interior de la campana, debe ser rociada con etanol 70%. Esto
incluye la lmpara de alcohol, el recipiente conteniendo etanol al
80 o 90% para ayudar a flamear los instrumentos, un contenedor
para los frascos que contendrn el medio de cultivo, toallas o
cajas de Petri / tejas de cermica pre-esterilizadas y
herramientas varias (pinzas de diseccin, esptulas, bisturs,
etc.).
3 Cuando se decida iniciar, quitar todo tipo de joyera y lavar
las manos (con uas cortas) vigorosamente con agua y
jabn, manteniendo el frotado por 30 segundos. Justo en el
momento de colocar las manos en la campana, rociarlas
con etanol al 70%.
4 Iniciar el trabajo abriendo las cubiertas de los materiales de trabajo y
colocndolas sobre las superficies de trabajo. Nunca bloquear el flujo de aire que
proviene de la unidad filtrante. De igual manera NO hacer pasar la mano
interfiriendo el flujo que va hacia la superficie u objeto de trabajo. Hablar mientras
se est en la unidad compromete la esterilidad. Si por alguna razn se debe
hacerlo, hay que mover la cabeza a un lado. Si se tiene cabello largo, atarlo para
que no cuelgue sobre la superficie de trabajo.
5 Nunca dejar contenedores estriles abiertos por mucho
tiempo. Cuando se abra un contenedor que ha sido
esterilizado, mantener los dedos fuera del rea abierta. Si
se abre un contenedor o vaso de cristal, como regla
general, flamear a travs de una flama. Esto crear una
corriente ascendente desde el vaso, auxiliando a prevenir
que la contaminacin entre a l.

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6 Flamear los instrumentos puede ser azaroso si olvida que el etanol es flamable.
Cuando se flamee para esterilizar instrumentos, tales como pinzas de diseccin,
sumergir el instrumento al recipiente que contiene etanol al 80%. Cuando se
levante sacndolo, mantener en un ngulo tal que lejos de los dedos escurra el
exceso de alcohol. Entonces pasar el extremo del instrumento por la flama de la
lmpara de alcohol, permitir que la herramienta enfre sobre el rea
preesterilizada, con el fin de que se encuentre lista para su empleo posterior.
NUNCA dejar herramientas calientes cerca del contenedor de etanol al 80%.

No debemos olvidar que en un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, la limpieza y la

organizacin eficiente, tanto en el laboratorio como en el trabajo, contribuir a reducir el
riesgo de contaminacin (Manzanares, 1991).

3.2.3. Medios de cultivo y constituyentes termolbiles

Los contaminantes microbianos estn normalmente presentes

en el medio desde su preparacin inicial. Para destruirlos, es
necesario cerrar la boca del matraz (si ese es el caso) con un
tapn apropiado para evitar la entrada de bacterias y
autoclavear el medio de cultivo, empleando calor hmedo bajo
presin, 1.06 kg/cm2 (121C) durante 15-40 min a partir de que
se haya alcanzado la temperatura requerida. La esterilizacin
depende de la temperatura y no directamente de la presin. El
tiempo de exposicin vara con el volumen del lquido a ser
esterilizado (ver siguiente tabla). Monnier (1976) report que el calentamiento a 120C
hace decrecer el valor nutritivo del medio de cultivo para embriones jvenes de Capsella.
Mejores resultados fueron observados cuando el medio de cultivo se esteriliz a 100C
por 20 min. En el caso de que una autoclave no est disponible, una olla de presin
domstica es adecuada. Debe tenerse sumo cuidado en respetar el tiempo de enfriado.
Una rpida prdida de presin har que el lquido contenido ebulla vigorosamente. El
indicador de presin de la autoclave deber indicar cero (temperatura no mayor a 50C)
antes de que la autoclave sea abierta.

Algunos reguladores de crecimiento de plantas (RCP), tales como GA3, zeatina, ABA y
ciertas vitaminas, son termolbiles. Ellas no deben ser esterilizadas. Cuando sea
necesario a un medio de cultivo adicionar algn componente termolbil, el medio de
cultivo es esterilizado en un matraz y se mantiene despus de su esterilizacin en una
campana de flujo laminar hasta que la temperatura descienda. Las soluciones
termolbiles son esterilizadas por filtracin con membrana (ver seccin 3.1.3) y
adicionado al medio estril, cuando se encuentre a una temperatura aproximada de 40C,

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de un laboratorio de cultivo de tejidos
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en el caso de que se trate de un medio semislido (justo antes de que el agar solidifique),
si el medio es lquido se espera a que se encuentre a temperatura ambiente.

Tabla 3. Tiempo mnimo necesario para la esterilizacin de medio de cultivo por

vapor hmedo, sugerido por Biondi y Thorpe (1981).
Minutos de
Volumen
esterilizacin
(ml)
(121C)
20-50 15
75 20
250-500 25
1000 30
1500 35
2000 40

3.2.4. Siembra y transferencia de inculos

La siembra y transferencia de inculos, sigue los mismos

protocolos de trabajo que los indicados en la seccin 3.2.2.

Cada uno de los explantes o cultivos de material vegetal

establecidos previamente, son transferidos a medio nuevo, de
acuerdo a los protocolos aplicados en cada caso.

En condiciones de asepsia y siempre bajo la campana de flujo laminar se transfieren

explantes. El ejemplo que se muestra a continuacin es el proceso de generacin de un
cultivo en suspensin de clulas a partir de callos.

Con ayuda del bistur se fragmenta el callo, se transfiere siempre el desarrollo joven. En
cada nuevo matraz deben transferirse entre 500 a 750 mg de material con el objeto de
asegurar la iniciacin por transferencia. Si el deseo es obtener un cultivo de clulas en
suspensin, se emplea medio fresco lquido y se mantiene en agitacin, a una velocidad
entre 30-150 rpm, en algunos casos es necesaria la oscuridad, pero siempre a
temperaturas entre 25 y 27C.

Si durante los tres primeros das el medio tiene apariencia lechosa, es seal de que el
medio se ha contaminado. Lo que procede es retirarlo inmediatamente y se esteriliza
antes de desecharlo.

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El subcultivo inicial puede realizarse 7 o 10 das despus de hecho el cultivo; es necesario

fltrarlo a travs de un filtro de nylon estril para eliminar residuos del inculo y de los
racimos celulares grandes.

Para determinar la densidad celular se emplean los siguientes mtodos:

i) Conteo celular. Un cultivo en suspensin invariablemente portar colonias celulares

de varios tamaos, por lo que es difcil realizar un conteo celular de forma directa. La
exactitud de este conteo puede ser mejorado si las clulas y agregados celulares son
primero dispersados por tratamiento con cido crmico (5-8 %) o pectinasas (0.25%).
Este mtodo fue empleado para el conteo de clulas de sicmoro (Street, 1977) de la
forma siguiente: se aaden por cada volumen de clulas en suspensin dos volmenes
de trixido de cromo al 8%; esta mezcla se calienta a 70C de 2 a 15 min (la duracin
est determinada por el crecimiento del cultivo). Se enfra y se disgrega la muestra con
un pipeteo constante o por una agitado vigoroso durante 10 min, posteriormente se
realiza el conteo en hematocitmetro.

ii) Volumen del paquete celular (VPC). Para determinar el VPC se transfiere un
volumen conocido de una suspensin dispersa y uniforme a un tubo de centrifuga
graduada a 15 ml, se centrifuga a 200 g durante 5 minutos. El VPC se expresa en ml
de pellet por ml de cultivo.

iii) Peso fresco celular. Esto puede ser determinado al colectar clulas sobre la
condicin de un pre-pesado (en condicin hmeda) a travs de un filtro circular o
soporte de nylon soportado en un filtro, las clulas se lavan con agua para remover el
medio, se drenan con vaco y se pesan nuevamente.

iv) Peso seco celular. Siguiendo el proceso antes mencionado de pre-pesado, las
clulas colectadas por el filtro, son secadas durante 12 h a 60C y repesadas. El peso
celular es expresado por litro de cultivo (Bhojwani, S.S. y Razdan, M.K., 1996).

3.3. Diseo de un laboratorio de tejidos vegetales

En la planeacin y organizacin de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales para la

produccin comercial deben tomarse en cuenta, principalmente, las condiciones de
asepcia en las que se debe trabajar, as como las funcionalidades, i.e. los flujos de
trabajo, permitiendo el movimiento diario de suministros, personas, cultivos y el producto
final en un patrn facil y lgico. En muchas ocasiones, ante la imposibilidad de construir
un laboratorio desde el principio, la remodelacin de casas residenciales para acomodar
las necesidades es siempre una opcin. Con el objetivo de mantener los contaminantes
que se mueven por el aire, las instalaciones ideales deben tener pocos sitios de entrada

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Unidad 3. Tcnicas de esterilizacin y diseo
de un laboratorio de cultivo de tejidos
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(puertas) y frecuentemente grandes reas designadas como cuartos limpios con aire
purificado (empleando filtros HEPA), fluyendo bajo presin positiva (Manzanaes, 1991;
Suttle, 2005). Las reas bsicas de un laboratorio son las siguientes:

3.3.1. rea de lavado y esterilizacin

En esta sala se llevar a cabo el lavado de la cristalera en general; tambin puede

emplearse el primer lavado con detergente del material vegetativo. Aqu se puede instalar
el autoclave para esterilizar tanto el medio de cultivo como el material contaminado.
Tambin es recomendable instalar una lavadora de cristalera (opcional) y una estufa u
horno para el secado de la cristalera. Por el calor generado por las autoclaves, es
recomendable una buena ventilacin limpia.

Es indispensable contar con el material siguiente:

Cristalera
Gabinetes para la cristalera (de preferencia con puertas para evitar que se
empolve)
Estufa u horno de secado por conveccin
Autoclave
Agua caliente y fra
Agua destilada, agua desionizada (destilador y desionizador opcionales)
Fregadero (de preferencia de doble tarja profunda)
Instalacin elctrica: 110 y 220 V.

3.3.2. Cuarto para la preparacin de medios y material vegetativo

En esta sala se preparan los medios de cultivo que sern utilizados en las siguientes
fases de desarrollo de los inculos, al igual que el material vegetativo del cual se tomar
el inculo seleccionado. Aqu el medio de cultivo es transferido a los recipientes de cultivo,
tales como frascos de vidrio.

Es indispensable contar con el material siguiente:

Gabinetes para guardar los reactivos

Gabinetes para almacenar cristalera
Gabinete o cajones para guardar los tubos de ensaye, as como las tapas para
matraces y frascos de vdrio
Cnulas para esterilizar cajas de Petri

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Cnulas para esterilizar pipetas

Charolas de plstico para transportar soluciones stock y medio preparado
Gradillas de material para colocar los tubos con medio de cultivo (preferentemente
40 tubos por gradilla)
Agitadores magnticos con calentamiento
Dosificador automtico de medio de cultivo (puede suplirse con soportes, anillos y
embudos de 500 ml con manguera de hule y pinzas Mohr)
Reloj alarma de 120 min
Balanza granataria y analtica
Pontecimetro
Refrigerador y congelador
Instalacin elctrica de 110 y 220 V
Instalacin de gas
Instalacin de vaco.

3.3.3. rea de transferencia (siembra y diseccin)

En esta sala se deben tener los mximos cuidados de asepsia, para lo cual se empean
cmaras de flujo laminar de aire, utensilios estriles, cubrebocas, cubrecabezas y aire
filtrado en la sala. Esta sala es el corazn de cualquier laboratorio, ya que en l se lleva a
cabo el inicio del cultivo y los subsecuentes subcultivos.

En l deben existir:

Aire acondicionado y filtracin, vaco para esterilizacin por filtrado, cmara de flujo
laminar de aire, microscpio estereoscpico, lupa con lmpara, instalacin elctrica 110 y
120 V, instalacin de gas, gabinetes, instrumentos de diseccin, lmpara de luz UV.

3.3.4. Sala de incubacin

Generalmente esta sala es la ms grande de cualquier

laboratorio, aqu es donde los cultivos son incubados en
anaqueles bajo regmenes de luz y temperatura
especfica. La cantidad y calidad de luz son el factor
clave para el xito del cultivo. De manera general son
usadas las lmparas fluorescentes regulares o de alta
intensidad de iluminacin fra.

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Unidad 3. Tcnicas de esterilizacin y diseo
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En esta sala deben tenerse muy en cuenta las instalaciones elctricas, pues las diferentes
fases del crecimiento de los inculos necesitarn diferentes fotoperiodos, temperatura,
intensidad lumnnica, etc.

No deben faltar aire acondicionado y filtrado, control de temperatura, anaqueles para

incubacin, se sugiere su construccin en seis niveles con 50 cm entre cada nivel.

Colocacin de las balastras fuera de la sala, un reloj por nivel, termostatos separados
parea temperatura de da y de noche, apagado automtico de temperatua de emergencia
para cada sala, fotoperiodo programable.

3.3.5. Almacn de reactivos

Debe guardar los reactivos y la cristalera en existencia. El

material debe mantenerse en condiciones de baja humedad
relativa y en un lugar no caliente y de preferencia oscuro. Es
importante sealar que nunca debe almacenarse demasiado, el
almacn debe guardar aspectos bsicos de temporada. La
localizacin lgica para un almacn debe estar cerca de una
puerta externa o cerca del rea de preparacin de medios.

3.3.6. Invernadero

Son muy importantes las condiciones del o los invernaderos a los

cuales se van a transferir las plantas provenientes del laboratorio,
pues en este lugar donde se pueden recontaminar o sufrir daos
por insectos, roedores, etc. Lo ms adecuado e indispensable
ser contar con:

Regulacin de la luz, tanto en intensidad como en fotoperiodo

Regulacin de la temperatura
Control de humedad
Pisos de concreto
Aire filtrado
Exclusin de insectos (mosquitero)
Sistema de nebulizacin
Fertilizacin e irrigacion automtica
rea de almacenamiento para los implementos del invernadero

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Mezclas de suelos estriles

Bancales para maceteros.

Actividades

La elaboracin de las actividades estar guiada por tu docente en lnea, mismo que
te indicar, a travs de la Planeacin didctica del docente en lnea, la dinmica que t
y tus compaeros (as) llevarn a cabo, as como los envos que tendrn que realizar.

Para el envo de tus trabajos usars la siguiente nomenclatura: BCTV1 _U3_A1_XXYZ,

donde BCTV1 corresponde a las siglas de la asignatura, U3 es la unidad de
conocimiento, A1 es el nmero de actividad, el cual debes sustituir considerando la
actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de
tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones

Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de

Autorreflexin indicadas por tu docente en lnea y enviar tu archivo. Cabe
recordar que esta actividad tiene una ponderacin del 10% de tu evaluacin.

Para el envo de tu autorreflexin utiliza la siguiente nomenclatura: BCTV1

_U3_ATR _XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la asignatura,
U3 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y
la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu
apellido materno

Cierre de la unidad

Como ha podido darse cuenta, muchos de los procedimientos estudiados, requieren tener
siempre en mente los elementos que pueden permitir una contaminacin. Esto con el fin
de evitarlos y proveer un cultivo de tejidos en condiciones aspticas.

El diseo de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, implican entre otras cosas

permitir su funcionalidad y el flujo lgico de las actividades desarrolladas en l.

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Unidad 3. Tcnicas de esterilizacin y diseo
de un laboratorio de cultivo de tejidos
vegetales

Esta unidad 3, nos hace concluir con los objetivos de cultivo de tejidos vegetales I, la
siguiente materia corresponder a comprender los protocolos ms empleados en el cultivo
de tejidos vegetales.

Para saber ms

Diseo de un laboratorio de propagacin de plantas. Informacin en ingls. http://aggie-

horticulture.tamu.edu/tisscult/microprop/facilities/microlab.html
Cultivo de tejidos vegetales, informacin en ingls.
http://www.accessexcellence.org/LC/ST/st2bgplant.php
Procedimientos para germinacin de germoplasma de arroz silvestre, informacin en
ingls: http://www.ars.usda.gov/Main/docs.htm?docid=19960&pf=1&cg_id=0
Manual de procedimientos para trabajos en invernadero, informacin en ingls:
http://ricelab.plbr.cornell.edu/greenhouse_procedures_manual
Catalogo de equipos de laboratorio: http://lumistell.com.mx/campanas-horizontales/

Fuentes de consulta

Beyl C.A. 2005. Getting started with tissue culture: Media preparation, sterile technique,
and laboratory equipment. En: Trigiano RN y Gray D.J. Plant development and
biotechnology. USA: CRC Press. ISBN 0-8493-1614-6.

Bhojwani S.S. y Razdan M.K., 1996. Plant Tissue Culture: theory and practice. USA:
Elsevier. ISBN 0-444-81623-2

Biondi, S. y Thorpe, T.A., 1981. Requirements for a tissue culture facility. En: T.A. Thorpe
(Ed.), Plant Tissue Culture: Methods and applications in agriculture. New York, NY.:
Academic Press.

Freepho, 2013. http://www.freedigitalphotos.net

Labconco 2013. Proyectos de diseo de laboratorios [en lnea]

http://www.labconco.com/company/laboratory-design-projects (consultado el 7 de
noviembre 2013).

Manzanares, M.E., 1991. Tcnicas de esterilizacin y manipulaciones aspticas En:

Hurtado M.D.V. y Merino M.M.E. (Eds.). Cultivo de tejidos vegetales. Mxico: Trillas. ISBN
968-24-2159-4.

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 Cultivo de tejidos vegetales I
Unidad 3. Tcnicas de esterilizacin y diseo
de un laboratorio de cultivo de tejidos
vegetales

Monnier, M. 1976. Culture in vitro de lembryon immature de Capsella bursa-pastoris

Moench (1). Rev. Cytol. Biol. Veg. 39:1-120.

Smith, 2013. Plant tissue culture, techniques and experiments (3rd Ed.). USA: Academic
Press

Suttle, G.R.L. 2005. Commercial laboratory production En: Trigiano RN y Gray D.J. Plant
development and biotechnology. USA: CRC Press. ISBN 0-8493-1614-6.

OMS, 2013. Third Supplement to the Fourth Edition of The International Pharmacopoeia.
World Health Organization (WHO) [en lnea] (consultado el 26 de octubre 2013).

Scipho, 2013. Science photo library [en lnea] www.sciencephoto.com (consultado el 25

de octubre 2013).

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vegetales

Anexo

En sntesis, un labratorio de cultivo de tejidos vegetales debe contar, indispensablemente,

con el material siguiente (Manzanares, 1991):

Autoclave
Balanza analtica
Balanza granataria
Potencimetro
Refrigerador
Lavadora de cristalera (opcional)
Destilador
Desionizador
Lavadora de pipetas
Agitador magntico con calentamiento
Esptulas
Microesptulas
Frascos ambar para guardar soluciones stock
Buretas
Soporte universal
Anillos
Pinzas de Mohr
Pinzas largas de diseccin
Filtro millipore
Termmetros (-10C a 120C)
Guantes de asbesto
Tapones para tubos de ensaye
Tapones para frascos de vidrio
Gradillas para 40 tubos
Matraces Erlenmeyer
Matraces aforados
Desecador
Picetas
Aspersores
Pipetas graduadas y volumtricas
Goteros
Propipetas
Probetas
Vasos de precipitado
Cmaras de flujo lamina de aire
Microscopio estereoscpico
Lupa con lmpara

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Estuche de diseccin
Bisturies
Navajas para bistur
Tijeras
Pinzas
Mechero bunsen
Bomba de vaco
Cajas de Petri
Cnulas para cajas de Petri
Cnulas para pipetas
Tuberas de plstico
Agitadores magnticos
Papel filtro
Pepel parafilm
Gasa
Algodn
Toallas de papel
Detergente
Blanqueador de lavandera
Escalera de tijera
Tambores rotatorios (para cultivo sumergido)
Agitador para matraces Erlenmeyer
Timer (reloj con alarma)
Lmparas de luz fra
Termostatos
Balastras
Gradillas para tubos, tubos de ensaye 25x150 y 25x200
Microccopio de inmersin
Cubreobjetos
Portaobjetos
Lmara de alcohol.

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