Final 10/02/12

1. Justifique las siguientes estrategias:

a- la utilizacin de cepas de e.coli con enzimas modificadas del sistema redox para la produccin de proteinas
recombinantes: debido a que el citosol de e. coli es muy reductor, hay bajas posibilidades de formacin de puentes
disulfuros en la estructura tridimensional de la protena recombinante. Por eso, el uso de cepas con enzimas modificadas
del sistema redox permite la expresin de protenas recombinantes con la formacin de puentes disulfuros en el citosol.
Esto permite obtener protenas plegadas en alta concentracin y evitar generar protenas de fusin con secuencias seales
de exportacin a periplasma o coexpresion con protenas formadoras de poros.

b- la utilizacin de cepas de e.coli suplementadas con codones ARNt de baja frecuencia para la produccin de proteinas
recombinantes: las frecuencias de uso de codones son diferentes en clulas procariotas y en eucariotas, por este motivo,
para evitar el dficit de ciertos ARNt requeridos para la expresin de protenas humanas con la consecuente sntesis de
protenas truncadas, hay cepas de e.coli con estos ARNt deficientes.

2. a- Mencione al menos 5 caracterisiticas que se desean en un biorreactor:

1. mantener el cultivo puro una vez sembrado
2. adecuada aireacin y agitacin
3. el menor consumo de energa
4. un control eficiente de pH
5. control de temperatura
5. control del O2 disuelto
6. sistema para la toma de muestra
7. sin perdidas por evaporacin
8. que las operaciones extrafermentacion como limpieza sean minimas
9. verstil
10. superficies internas lisas
11. usar los materiales mas baratos con resultados satisfactorios
b- Mencione las principales ventajas que posee un biorreactor de membrana.: alta densidad de cultivo, fcil separacin
de clulas del medio, medio libre de burbujas, bajas fuerzas de corte, menores volmenes de reaccin.

3. Enuncie si las siguientes frases son V o F y justifique.

a- La expresin de proteinas recombinantes en saccharomyces tiene como principales ventajas el correcto folding de la
proteina, el bajo costo de produccin y el mantenimiento. Verdadero. Son clulas fciles de cultivar dando cultivos de alta
densidad y no requieren equipamiento o medios costosos. Al no formarse cuerpos de inclusin, se mantienen en estado
soluble y nativas las protenas, importante para la funcin proteica
b- La expresin de proteinas recombinantes en clulas animales tiene ventaja sobre la expresin en bacterias en cuanto
al rpido crecimiento, las correctas modificaciones post traduccionales y la alta velocidad de produccin. Falso. Las clulas
animales requieren mayores tiempos de crecimiento lo que aumenta el peligro de contaminacin. Sin embargo, las
correctas modificaciones post-traduccionales son ventajosas para obtener una protena con plegamiento correcto y con su
funcin conservada lo cual es difcil en bacterias ya que las mismas no realizan modificaciones post.traduccionales

4. se realiza un cultivo con pichia pastoris en un laboratorio con una biomasa inicial de 0,53g/L y con un inculo inicial de
15,2g/L de glucosa en un cultivo en BATCH.
Luego de 10hs se frena el cultivo y se obtienen 6,52g/L de biomasa.
a- cul es el rendimiento total del proceso?
Rendimiento: deltaX/deltaS = falta dato de glucosa final
b- Calcular la velocidad especfica de crecimiento sabiendo que todo el proceso se produjo en estado estacionario. En
estado estacionario la velocidad especifica de crecimiento es igual a 0 porque el crecimiento esta detenido.
c- Calcular el tiempo de duplicacin: Considerando fase log: mu = 0,25/h. td = ln2/mu = 2,8 h

5. Se realiza una proteina recombinante bifurina mediante la fusin con una protena X para poder recuperarla y se obtienen
6,92g/L de bifurina en 24,6g/L de proteina total.
a- Cul es la productividad del proceso? (en % de bifurina sobre protena total).
Paso gBifurina en 10L Rendimiento (%) Pureza (%)
Cuerpo de inclusin 6,92 ---
Clivaje de X 2,12 0,56
IEC 1,74 54
IMA 1,31 96
b- Completar la tabla calculando el rendimiento.
c- Calcular el rendimiento y el factor de purificacin de todo el proceso.
No entiendo como copiaron el cuadro
1)
Realizar como primer paso una IEC a pH acido de 5,5. A este pH las proteinas A, D y X tienen carga negativa y las B y C
positiva. Uso un intercambiador de aniones (tienen carga positiva) para que interactuen con las proteinas A, D y X.
Adsorcion con baja FI. Eluyen B y C y aumento la FI para que eluyan por ultimo A, D y X.
Como segundo paso y con alta FI, realizo HIC. A alta fuerza ionica tengo las 3 proteinas interactuando con los ligandos de
la matriz. Al ir disminuyendo la FI primero eluye A, la menos hidrofobica. Luego X y por ultimo D, la mas hidrofobica.
Como ultimo paso, tomo los dos ultimo eluatos anteriores conteniendo D y X y realizo una SEC. La primera fraccion en
eluir sera la de la proteina X, purificada.
Correccion: no es necesario el primer paso de IEC. Hacer primero HIC y luego SEC como se explico a partir del segundo
paso. Es mas conveniente industrialmente, tanto por una cuestion de costos como para evitar pasos extras de purificacion
que puedan llevar a perdida de la proteina de interes.

2) a) Falso: el cultivo de celulas de mamiferos son los de mayor tiempo de duplicacion de biomasa por lo que no es una
ventaja, tampoco lo es el costo ya que no son bajos, sino altos por ser celulas mas complejas que requieren medios mas
complejos, comparadas con las bacterias o levaduras. En cambio si es una ventaja las correctas modificaciones post-
traduccionales como las glicosilaciones, puentes diS, proteolisis de peptidos seal, etc.
b) Falso: Hansenula no hiperglicosila, como sucede con Saccharomyces. Pero s requieren plantas a pruebas de explosiones
como Pichia ya que usa MetOH como fuente de energia. Presenta altos consumos de oxigeno igual que Pichia.

3)
A)El uso de suero como componente de los medios de cultivo para celulas de mamiferos, si bien es necesario porque
aporta factores de crecimiento y hormonas que estimulan el crecimiento y la adhesion, al ser de composicion muy variable
se desconoce su real composicion. Ademas aporta muchas otras proteinas que influyen negativamente en el proceso de
purificacion de mi producto. Tambien puede tener inhibidores de crecimiento viral que afecten en la produccion de
vacunas. Y tener contaminantes como hongos,virus y bacterias.
B) Un vector de expresion en levaduras debe tener:
-un origen de replicacion
-un marcador de seleccion (auxotrofico)
-um promotor activo en levaduras
-un sitio de clonado multiple
-secuencia terminadora de transcripcin
-elementos que permitan la propagacion y seleccion en E. coli (un gen de resistencia a ATB, promotor para polimerasa de
E. coli, un ori)

4)mu = 0,60
Xo= 0,065
Yxs = 0,35
Qs= 1,71
Qp=0,108
Pf = 2,17
Product=0,22
Falsa. Segun el modelo de Monod la Ks es la cc de sustrato a la cual la velocidad de crecimiento es es igual a mu maxima/2.

5)
Expresion de proteina recombinante en E. coli:
En cuerpos de inclusion
Ventajas: facil de aislar, proteccion contra proteasas, proteina inactiva y no daa huesped, altos rendimientos en la
produccion.
Desventajas: Se debe solubilizar y renaturalizar in vitro lo que aumenta los costos y disminuye el rendimiento.
Soluble en citoplasma:
Ventajas: No requiere renaturalizacion y solubilizacion porque la proteina tiene estructura nativa y funcion
Desventajas: altos niveles de proteina pueden daar huesped, purificacion es compleja, puede ocurrir proteolisis, no
suelen formarse puentes diS.
Soluble en periplasma:
Ventajas: pocos contaminantes y se forman puentes diS
Desventajas: no siempre se logra la secrecion a periplasma, no se logra a gran escala, puede haber proteasas.

21/06/2016
1)Tpico ejercicio de la gua donde se desea purificar una protena x donde tambien se encuentran A, B, C y D
Resuelto en el final del 15/10/2015

2)te deca q la protena recombinante sufri un clivaje proteolitico y realizabas una SEC HPLC. decir fundamento de la
tcnica y graficar como veras el cromatograma.
Una cromatografa de exclusin molecular es un mtodo separativo no adsortivo que se fundamenta en las diferencias de
PM entre las especies a separar. Debido a que la matriz posee una fase estacionaria compuesta de un gel que contiene
poros de determinado diametro, solo va a permitir el ingreso a los mismos de los solutos que tengan un PM tal que no
supere el tamao de estos poros, de esta manera estos solutos quedan retenidos en la columna mas tiempo que los que
quedan excluidos del ingreso a los poros y que eluyen primero debido a que no retrasan su pasaje quedando retenidos en
la fase estacionaria y solo son arrastrados por la fase mvil. Las molculas eluyen en orden decreciente de tamao
molecular.
En un cromatograma, el primer pico corresponde a la molecula de mayor PM y el ultimo a la de menor PM. Entre medio
son PM intermedios y en orden decreciente.

3)v y f
a)si la proteina A precipitaba con menor cc sulfatode amonio q B, B era mas hidrofbica
Falso: la protena que menor cc de sulfato de amonio requiere es aquella que menor densidad de cargas en su superficie
requiere apantallar con la sal por lo que la mas hidrofbica es A. Este apantallamiento de cargas lleva a la interaccion
protena-proteina lo cual lleva a la precipitacin.
b)IEC, depende del vol de elucin: Creo que esta mal redactada.
Falso: IEC, al ser un mtodo adsortivo, permite concentrar la muestra por lo que el volumen de siembra puede ser mayor
al de la columna.
c) vol de siembra de SEC es ilimitado:
Falso. SEC diluye la muestra porque no es un mtodo adsortivo que permita controlar la elucin por lo tanto se requiere
un volumen de siembra de entre 10-30% el volumen de la columna.

4)v y f
a)ventaja de usar celulas de mamifero, posibilidad de usar carriers y bajo tiempo de duplicacin
Falso: las clulas de mamferos son las de mayor tiempo de duplicacin lo cual no es una ventaja ya que aumenta las
posibilidades de contaminacin del cultivo. Carriers explicado mas adelante.
b)ventaja de usar inmovilizacion por membranas es la alta retencion del biocatalizador ya que la fuerza de union es muy
fuerte y estable.
Falso: en la inmovilizacin por retencin en membranas, el biocatalizador queda retenido en suspensin en un espacio
limitado por una membrana semipermeable, no unido a la misma por enlaces.
c) nombrar desventaja de una agitacion mecnica
altas fuerzas de corte, turbulencias, difciles de limpiar, complejos.
d)ventaja de produccion de proteina en pastori sobre e coli es que utiliza como inductor metanol y no hiperglicosila
Falso: la no hiperglicosilacion por Pichia no es una ventaja frente a E. coli ya que esta no glicosila. Tampoco lo es el uso
de metanol como inductor ya que requiere instalaciones especiales a pruebas de explosiones. Las ventajas frente a
E.coli serian que las levaduras son de fisiologa bien conocida, bajos costos, de alta densidad de cultivos, sin
componentes toxico como pirgenos de E. coli, no forman cuerpos de inclusin, no requieren equipamiento costoso a
excepcin del anterior mencionado, bajos niveles de proteasas, realiza modificaciones post-traduccionales.

Final Complementaria 15/9/16

1) Ejercicio de Batch, te daban como dato la biomasa final e inicial, cuanto duraba la fase lag, cuanto duraba todo el
proceso, la cantidad de sustrato inicial. Haba que calcular: u, ysx, ypx, productividad volumtrica y cuanta biomasa haba
a un cierto tiempo.
Resuelto en otras fechas.

2) Preguntas del uso clulas en biotransformacin (ventajas y desventajas). La biotransformacin es un proceso biolgico
por el cual una molecula sea natural o sintetica es transformada en un producto deseado y recuperable por medio de
reacciones qumicas llevadas a cabo por clulas o enzimas aisladas. Tiene como ventajas la alta selectividad, las
condiciones de reaccin suaves a diferencia de la sntesis qumica, no suele ser necesario proteger grupos funcionales,
uso de medios acuosos, menor numero de pasos, mayor rendimiento, menor gasto de energa, menor generacin de
desechos y menor costo del proceso. Las desventajas son el costo del desarrollo, tiempos de reaccin largos, productos a
bajas cc, estabilidad limitada de biocatalizadores.
ventajas y para qu tipo de clulas se usan los biorreactores descartables: el uso de biorreactores descartables se aplica
para cultivo de clulas animales, vegetales, humanas, de insecto. Sus ventajas son: fcil manipulacin, prevencin de
contaminacin cruzada, tiles para microorganismos patgenos, alta seguridad, ahorro de tiempo y de costos de
mantenimiento, se pueden autoclavar las bolsas y destruir.
Y un V/F: En inmovilizacin siempre conviene usar clula porque no requieren cofactores y el producto se obtiene libre de
productos. Falso: si bien es cierto que el uso de celulas aporta los cofactores necesarios para las reacciones de
biotransformacin, no es cierto que el producto de inters se obtenga libre de otros productos no deseados ya que las
reacciones se realizan dentro de una celula donde ocurren muchas mas reacciones de su propio metabolismo.

4) Fundamento de isoelectroenfoque y como se visualiza la desamidacin de protenas.

El isoelectroenfoque es un tipo de electroforesis en donde se crea un gradiente de pH sobre el gel y frente a una corriente
elctrica las protenas cargadas migran hacia la zona de pH = a su pI. De esta forma se pueden separar distintas protenas
cargadas segn su pI. Las protenas que se encuentren a pH menor a su pI tendrn carga positiva y migraran hacia el
catodo que es alcalino, en cambio, las protenas a pH mayor a su pI tendrn cargas negativas y migraran hacia el anodo
que es acido.
Desamidacion de protenas: la desamidacion de protenas genera cargas negativas y se puede usar IEC para identificarlas.
FINAL 18-Jun-2015

1. Se desea purificar a homogeneidad a una protena X a partir de 500 litros de sobrenadante de cultivo en el que
tambin estn A, B, C y D. Los datos de las protenas son los siguientes:
Peso de la protena (kDa) Hidrofobicidad en [(NH4)2SO4] pI
A 40 1.5 5
B 100 2.0 6
C 45 1.5 7
D 90 0.5 5
X 95 1.5 5
Disee una secuencia de pasos lgica y viable para escala industrial para lograr la purificacin de X por mtodos
cromatogrficos. Indique en cada etapa las condiciones de pH y fuerza inica necesaria para la siembra y la elucin de las
protenas en las matrices. Dibuje el cromatograma esperado en cada paso y los gradientes de elucin cuando
correspondan.
Es igual al problema del 15/10/2015. Habria que agregar que antes de realizar los pasos en la etapa cromatografica de
purificacin, se debera realizar la etapa no cromatografica para reducir el volumen principalmente. Se puede realizar una
centrifugacin y luego resuspender el pellet en menor volumen para pasar a la etapa de purificacin fina. Tambien se
pueden usar membranas de filtracin tangencial o precipitaciones. Asi se logra reducir el volumen y enriquecer el producto.

2. Por qu se utilizan vectores de expresin con promotor T7 para produccin en E. coli? Qu tipo de cepa utiliza como
husped de expresin? Menciones ventajas y desventajas de la aplicacin de este sistema a escala industrial.
El uso del promotor T7 en vectores de expresin para E.coli es el mas utilizado porque es de alto nivel de expresin (altas
velocidades de transcripcin) e inducible con IPTG lo que permite un fcil control del momento de la expresin, por ejemplo
disociar la misma del momento de crecimiento donde la protena podra ser toxica para la celula. Para poder utilizar la
ARNpol del fago T7 y no la de E.coli, se usa la cepa lisogenica. Esta cepa tiene su genoma mutado, con el operan lac
modificado (DE3). Este operon, al ser inducido con IPTG, sintetiza la ARNpol viral la cual puede luego unirse al promotor
T7 del plasmido. Es decir, este vector, con el promotor T7, no se expresa en cualquier E.coli, solo en las lisogenicas que
pueden expresar primero desde su genoma y por induccin, la ARNpol viral. Esta cepa, adems, tiene un plasmido LysS
o LysE que expresa una lisozima que inactiva la polT7 sintetizada de forma basal y sin induccin asi se evita la expresin
de protenas recombinantes en ausencia de IPTG.
Ventajas: Fcil manejo, alta nivel de produccin, produccin controlada por doble induccin, posibilidad de disociar
crecimiento celular de expresin del producto de inters. Desventajas: Cepa DE3 tiene alto costo, debo contar con plsmido
Lyss que tambin es un costo adicional, se suman pasos al protocolo y eso a nivel industrial implica tiempo y costos.

3. Indique verdadero o falso y justifique su respuesta.

1. Si la protena A precipita con mayor concentracin de (NH4)2SO4 que la protena B entonces B es ms hidrofbica
que A. Verdadero, a mayor cc de sal requerida, mayor densidad de carga en la superficie de la protena por lo que la
misma es menos hidrofbica. B precipita primero, es mas hidrofbica.
2. En IEC el volumen de elucin de la protena de inters siempre es menor al volumen de siembra. Verdadero porque
los mtodos adsortivos permiten concentrar.
3. El volumen de muestra sembrado en SEC es ilimitado. Falso. Se debe sembrar entre 10 y 30% del volumen de la
columna ya que los mtodos no adsortivos diluyen la muestra.
4. En HIC si una protena A se adsorbe a la matriz con menor concentracin de (NH4)2SO4 que la protena B, A es ms
hidrofbica que B. Verdadero. A es mas hidrofbica y por lo tanto requiere menor cc de sal para apantallar las cargas de
su superficie y poder adsorberse a la matriz hidrofbica de la columna.

4.A) Describa al menos tres desventajas que posee usar enzimas inmovilizadas.
El uso de enzimas inmovilizadas presenta desventajas como la posible perdida de la actividad de la misma, la necesidad
de agregar cofactores y su costo, la difcil regeneracin del soporte y recuperacin de la enzima.
B) Conteste verdadero o falso. Justifique.
Cuando se realiza inmovilizacin de enzimas por unin covalente resulta sencillo solucionar la prdida de actividad
agregando ms enzima. Falso, la inmovilizacin por enlaces covalentes es una unin fuerte por lo que es irreversible y
no permite recuperar el soporte lo que no hace viable el recambio de las enzimas inactivas con mas enzima agregadas.
C) Describa ventajas de biorreactores descartables. Respondido en 15/9/16

5. Se realiza un cultivo de P. pastoris en batch usando medio de cultivo con 18 g/l de glucosa. La concentracin final de
levadura fue de 0,55 g/l. a las 15 hs se agoto la fuente de carbono y la biomasa final fue de 7,5 g/l. Adems el
microorganismo produce etanol, cuya concentracin inicial fue de 0,26 g/l y la velocidad especfica de produccin es de
0,22 g de etanol/g de biomasa.
A) Si la fase lag fue de 1,75 hs, calcule la velocidad especfica de crecimiento, la velocidad especfica de consumo de
sustrato y el tiempo de duplicacin. Mu= 0,20. Qs=0,51. Td=3,47
B) Calcule el rendimiento de biomasa en funcin del sustrato.Yxs=0,39
C) Calcule la velocidad especfica de produccin de producto y la concentracin de producto final. Qp= 0,22(dato)
Pfinal=7,96
D) Coloque verdadero o falso y justifique.
Una desventaja del mtodo de cultivo en batch es que no se puede regular la velocidad especfica de crecimiento.
Verdadero.La velocidad especifica de crecimiento va a depender de variables como las propias del microorganismo y de
fatores externos como temperatura, fuente de carbono, oxigeno. Por lo tanto, en batch las condiciones se mantienen
constantes y no permite regular mu.

17/9/15 : Tomaron el mismo examen del 30/7/15 (Literal, la hoja tenia la fecha)
1) Diferencias del interfern recombinante producido en celulas CHO y en E.coli.
El interfern producido en clulas CHO es una nica cadena polipeptidica de 166 aa y glicosilada. En E.coli carece de la
metionina inicial, la cistena 17 esta reemplazada por una serina y no esta glicosilada
2) Verdadero o falso de protenas recombinantes.
5) Veradero o Falso de Inmovilizacin ( Enlaces cruzados, Biorreactores de lecho ) y describir ventajas de la produccin
de proteinas recombinantes en levaduras en comparacion con celulas de mamifero.
Ventajas: las levaduras tienen pared celular lo que las hace mas resistentes, las clulas de mamfero no. Las levaduras no
requieren soportes para anclaje como las de mamferos. Los tiempos de duplicacin son cortos en levaduras lo que genera
cultivos de menores tiempos y menos riesgo de contaminacin. Los cultivos de levaduras son menos costosos y con
equipamientos menos complejos. Se dispone de una gran variedad de vectores de expresion

Final Jueves 11/12/14

Se crece una levadura en un tanque agitado de 2L de volumen operativo en modo batch a una temperatura de 28C. A las
16 horas de cultivo se agota la fuente de carbono y energia (glucosa). El rendimiento celular es de 0,4 gr Biomasa/gr
Glucosa y la velocidad especifica de crecimiento maxima es de 0,34 h-1. La concentracion del inoculo es de 0,17 gr/L. Este
microorganismo produce etanol, cuya concentracion al inicio del cultivo es de 0,12 gr/L y su velocidad especifica de
produccin es de 0,12 gr Etanol/gr Biomasa x h. Ademas esta levadura posee un tiempo de latencia de 2,2 h.
a) Cuanto tiempo dura la fase exponencial de esta levadura? Tiempo total menos latencia.
Calcule el tiempo de duplicacion de este microorganismo. ln2/mu
b) Cual sera la concentracin inicial del sustrato limitante? Con el valor de rendimiento se puede despejar la cc de
glucosa inicial ya que se tienen los datos de biomasa inicial y final.
Cual sera la velocidad especifica de consumo de sustrato? Qs = mu.Yxs
c) Calcule el rendimiento del producto en funcin de la biomasa, la concentracin de etanol al final del cultivo y la
productividad volumtrica. Ypx = deltaP/deltaX. Con qp = mu.Ypx puedo obtener el valor de Ypx y despejar Pfinal.
d) Conteste V o F y justifique. De acuerdo al modelo de crecimiento microbiano descripto por Monod, se entiende por
concentracion de sustrato limitante, a la concentracin del sustrato que regula la velocidad especifica de crecimiento
Verdadero para aquella cc de S en la cual la mu es menor a la mu mxima. Para cc de S mucho mayores a la Ks, la mu =
mu max y el cambio en la biomasa solo depende de Xo.

Final Biotecnologa 19-09-13

1) - Hacer un cuadro comparativo con ventajas y desventajas de la expresin de protenas recombinantes en E.coli en
periplasma y soluble en citoplasma. Respondido en 15/10/2015

2) - Comparar los mtodos de recuperacin primaria y los mtodos de purificacin fina.

Los mtodos de purificacin primaria se realizan antes de aquellos de purificacin fina porque su principal objetivo es
enriquecer el producto de interes reduciendo el volumen de la misma, principalmente quitando el exceso de agua. A su
vez es la etapa en donde se eliminan otros compuestos como acidos nucleicos, sobre todo cuando la muestra proviene
de un lisado celular por ser la protena recombinante intracelular, se eliminan tmb proteasas si es que la protena es
sensible a las mismas, se eliminan agregados proteicos y materiales particulados como detritos celulares y restos. Utiliza
procesos de aislamiento o enriquecimiento como centrifugacin, precipitacin, filtracin con membranas. Luego, al
obtener la protena de inters en un menor volumen, se pasa a la etapa de purificacin fina que se vale de tcnicas
cromatograficas para lograr obtener un producto con una pureza adecuada y mximo rendimiento, a un costo razonable.
Se utiliza el menor numero de etapas posibles por una cuestin de costos como de rendimiento, utilizando mtodos que
se valgan de las diferencias fisicoqumicas del producto e impurezas para lograr la mxima resolucin, eliminando
siempre primero los contaminantes en mayor concentracin y usando por ultimo siempre SEC (ya que diluye). Se deben
evitar los acondicionamientos para pasar a etapas siguientes, como cambio de buffer, concentracin o desalificacion.
Utilizar primero tcnicas adsortivas y matrices cromatograficas mas costosas al final.

3) - Comprar mtodos adsortivos y no adsortivos y decir ejemplos de cada uno.

Metodos no adsortivos: SEC. Diluyen la muestra. Volumen de muestra debe ser 10-30% el de la columna. No se puede
controlar la elucin con la composicin del buffer.
Metodos adsortivos: IEC, HIC, AC. Concentran la muestra. Volumen de siembra ilimitado. Elucion modificable por cambio
en composicin de buffer.

4) - Ejercicio de cintica. Te daban de dato umax=0,29 hs-1, tiempo 15 hs (se terminaba la fuente de energa), tiempo de
latencia 2 hs, cc inculo = 0,45 g/l, te daban el Yxs 0,55 g, te avisaba que es sustrato se agotaba y el producto final 2,6
g/l (inicial=0) y daba volumen 2 litros.
a - Cuanto dur la fase expotencial. Calcular td
b - Calcular sustrato inicial
c - Qs
d - Yps y Qp
Problemas similares resueltos en otras fechas.
e - Decir si el siguiente enunciado es correcto: la Ks depende de umax, de u y de la concentracin de sustrato, pero no
del tiempo y el pH (o algo similar). Falso. Ks depende de umax y esta de condiciones como pH, temperatura y el
microorganismo por lo que Ks depende de eso tmb.

5) - a - Ventajas y desventajas de utilizar clulas en biotransformacin.

Ventajas: pueden realizar varios pasos enzimticos, aportan cofactores y eso disminuye costos.
Desventajas: formacin de productos secundarios, limitacin en el pasaje a travs de membrana del S o P
b - FoV: Es fundamental que en inmovilizacin de clulas la sntesis de producto este disociada del crecimiento y que
este se acumule intracelularmente.
Falso. Las clulas no crecen inmovilizadas al soporte por lo que la formacin de producto no puede estar asociada al
crecimiento. Ademas, una de las principales ventajas de la inmovilizacin es la reutilizacin de las clulas por lo que el
producto debe ser secretado y fcilmente separado del biocatalizador

Diciembre 2014: Final 11-12-14

Segn la ecuacin de Monod, la concentracin de sustrato limitante es aquella que regula la velocidad especfica de
crecimiento. Verdadero. Solo cuando mu es menor a mumax.

2) v o f justificar
a- Una desventaja de la inmovilizacin por inclusin de clulas es que se encuentran expuesta al alto shear stres del
biorreactor de agitacin mecnica. Falso. La inmovilizacin protege a las celulas del shear estrs.
c- Cuales son las caractersticas que tienen que tener los microcarriers para el cultivo de clulas de mamfero y cualea
son las ventajas y desventajas. Los microcarriers son microesferas de vidrio, plstico o polietileno que permiten el
crecimiento de las clulas en su superficie aportando una alta rea de superficie de cultivo por unidad de volumen.
Permite el cultivo de clulas en un sistema compacto lo cual es importante cuando se trabaja con patgenos. Mantiene
todas las ventajas de los sistemas en suspensin. Disminuye la mano de obra. Es usualmente utilizado para la
produccin de virus. Las condiciones de cultivo son fcilmente controlables sacando una muestra y analizndola. Se
pueden usar en airlifts, frascos spinner, botellas rollers. Como desventajas tienen el difcil escalado y que algunas clulas
no siempre se adhieren bien. Suelen ser mas sensibles a remolinos microscpicos que las clulas en suspensin. Los
microcarriers deben tener una superficie adecuada para el pegado de las clulas. La densidad debe ser mayor a la del
medio de cultivo para evitar que floten. Deben tener propiedades pticas que permitan su observacin al microscopio. No
ser toxicas ni rigidas. Existen microcarriers macroporosos que aumentan aun mas la superficie de crecimiento y dan
mayor proteccin frente al shear estrs, pero limitan el pasaje de oxigeno al interior.

5) Diferencias entre biorreactor de agitacin mecnica y neumtica:

Agitacion mecnica Agitacion neumtica
Mecanimante complejos simples
Altas fuerzas de corte bajas
Turbulencias ergo distribucin irregular distribucin uniforme
Difciles de limpiar fciles
Verstiles menor flexibilidad

Final sin fecha

2) a) V o F justificar. "La principal diferencia entre biorreactor de columna de burbujeo y Airlift es la velocidad de aireacin
que se emplea par agitar el medio de cultivo" Falso, la ppal diferencia es que el segundo utiliza una corriente ascendente
y una descendente mientras que la de burbujeo una sola ascendente.
B) Vo F justificar. "En un proceso de biotransformacin no es necesario el agregado de precursor cuando se utilizan
clulas enteras". Falso. El concepto de biotransformacin implica la transformacin a un producto de inters a partir de
un precursor, sea natural o sintetico, y sea a travs de clulas o de enzimas aisladas.

TEMA 2:
5)a) Vo F justificar. "los biorreact descartables se usan principalmente para cultivar celulas de mamifero porque tienen
bajo shear stress y cumplen ms facilmente las GMP que los biorreact tradicionales(neumaticos y mecanicos)". Tienen
bajo shear estrs aquellos que usan agitacin por ondas. Ambos cumplen fcilmente las GMP pero se usan ppalmente
para evitar la contaminacin cruzada ya que son descartables.
c) como se puede aumentar el numero de copias de un gen de interes usando un plasmido integrativo(o algo as):
aumentando en numero de vectores durante la transformacin o direccionando la recombinacin a regiones de ADN
ribosomal que se encuentran en alto numero de copias

final 29/12/14:
3) Mencione propositos de expresar proteinas recombinantes como proteinas de fusion en E.coli. Describa 3 tipos de
etiquetas de fusion mas usadas para este proceso. Facilita la purificacin de protenas difciles de purificar o recuperar.
Tambin se utilizan protenas de fusin con pptidos seal para secrecin a periplasma de donde es mas fcil recuperar
o generar modificaciones como S-S. los tag dan mayor rendimiento, mayor solubilidad, secrecin, mejor plegamiento,
purificacin facilitada. Etiquetas: secuencia seal de exportacin a periplasma, cola de histidinas o de argininas.
4) Qu tipo de configuraciones de biorreactores descartables conoce? Agitacion por ondas o movimiento de balanceo.

Final 27-02-2014
2- a- caracteristicas de un precursor y del producto para biotransformacin: el precursor debe poder atravesar la
membrana de la celula o ser sustrato de la enzima. El producto debe poder ser liberado de la celula y no ser
metabolizado a mayor velocidad que su produccin o liberacin. El precursor o producto no deben ser toxicos para la
celula o inhibidores de la enzima. Si fuese toxico el producto, seria conveniente que se secuestre en vacuolas o se libere
con alta eficiencia al medio para ser removido y no afectar la viabilidad de las clulas.
b- ventajas y desventajas de la inmovilizacin
Ventajas: la reutilizacin es la ppal, tmb la fcil separacin del producto, alta densidad de biocatalizador inmovilizado,
proteccin de fuerzas de corte, mayor estabilidad de enzimas, menor probabilidad de contaminacin en clulas, permite
diferentes configuraciones, mayor productividad.
Desventajas: perdida de actividad de enzimas o viabilidad de clulas, la velocidad de difusin del sustrato y producto
puede ser limitante, la sntesis del producto no debe estar asociada al crecimiento, mayor costo y complejidad.
c- fundamento de inmov por inclusin: mas para clulas que quedan atrapadas dentro de una matriz tridimensional que
permite la difusin del sustrato y del producto pero el biocatalizador no interviene en la formacin de la matriz. Pueden
ser polmeros sintticos (toxicos) o naturales que gelifican o forman redes ionicas las cuales se disuelven frente a
quelantes y tienen poca resistencia.
d- se inmovilizan celulas por inclusion con alginato y con agarosa. Se obtiene mayor produccion con alginato, a que se
deberia dicha diferencia. La inclusin con alginato presenta mayor % de viabilidad.
3-a- V/F el biorreactor de lecho empaquetado se utiliza principalmente con biocatalizadores inmovilizados y su principal
limitacion es la agitacion mecanica para mantener homogeneo el medio. Verdadero. Las partculas (biocatalizador) estn
quietas rellenando biorreactor.
b- desventajas de la adsorcion en microcarries en el cultivo de celulas animales: difcil escalado, clulas no se adhieren
bien, dao por remolinos microscpicos, difcil difusin de oxigeno en los de tipo macroporosos.
4-V/F
a- en la obtencion de proteinas recombinantes en cuerpos de inclusion en E. coli, es necesario renaturalizar la proteina
antes de purificar. Es mas fcil purificar primero y luego renaturalizar.

Final 12/12/13
B ) mencione y describa los elementos geneticos presentes en un vector de expresin para cel animales
Ori, marcador de seleccin auxotrofico, elementos para propagacin en e.coli, promotor activo en clulas animales, MCS,
secuencia terminadora de transcripcin.

Final 8/8/13
5) V o F
a) El metodo de agitacion por ondas se usan para levaduras porque permite una buena oxigenacion con bajo shear
stress. Falso: una de sus limitaciones es en cultivo de clulas de levaduras y microorganismos aerobios por sus altas
tasas de consumo de oxigeno.
b) Una de las ventajas de usar cel de mamiferos es que se adhieren a una superficie lo que les permite una mejor llegada
de oxigeno y nutrientes.

5. V o F. justificando
b. La inmovilizacion por adsorcion, no se usan enzimas porque se eluyen del soporte y la fuerza es debil. Falso. Es un
mtodo para inmovilizar enzimas y clulas a travs de enlaces dbiles y presenta como desventaja la posibilidad de
elucin por labilidad de unin.
d. En la biotransformacion, las celulas no requieren de cofactores y por lo tanto SIEMPRE se las prefiere antes que las
enzimas. Falso, si bien las clulas aportan los cofactores necesarios para las reacciones llevadas a cabo en la misma, no
siempre son de eleccin ya que las enzimas aportan ventajas que a veces son preferibles: especificidad de sustrato, fcil
purificacin, ausencia de contaminantes y posibilidad de reutilizacin. En cambio la clulas puede generar productos no
deseados y limitar el pasaje del sustrato o producto y asi su recuperacin.

Final 23/02/2012
2) Dos V o F:-uno sobre las desventajas del cultivo de clulas de mamferos-el otro sobre la ventaja de usar una especie
de levadura sobre otra
3) Caractersticas de clulas q se utilizan en biorreactores de lecho empaquetado; diferencias con los de agitacin
mecnica. Las clulas no deben generar gases, deben estar en partculas incompresibles (deben estar inmovilizadas en
membranas o por inclusion). No deben requerir grandes aportes de oxigeno.

Final 10/12
Que estrategia usar si: la protena es txica; la protena es inestable por las proteasas bacterianas.
Cepas de control ajustado de expresin, deficientes en proteasas, que se secreten al exterior asi no se acumulan en la
celula, promotores inducibles, secuencia seal de exportacin, co expresin con BRP para formar poros y liberarse
4. sobre las desventajas de usar Hansenula vs Saccharomyces;
Equipamiento a prueba de explosiones, no gras, baja estabilidad de plasmidos episomales.
sobre desventajas de los biorreactores descartable
sensores poco confiables, compuestos toxicos liberados del plstico, dificultad de cultivar levaduras y microorganismos
aerobios de alta tasa de consumo de oxigeno, difcil escalado.
5. Como deducir la oxidacin de Met por mapeo peptdico

Final 23-05-13
2) Estrategias de proteinas recombinantes: - Si la proteina que se expresa es toxica. Y uno mas que no me acuerdo.
3) Verdadero y Falso de inmovilizacion y biotrasformacion: a- Metodo de inclusion con alginato, si este procedimiento
daaba a las celulas y no se podia usar (algo asi), b- Biotransformacion, algo de los pasos que se hacian en la sintesis
de novo y en la biotransformacion.
5) a) Clonaron un plasmido con un fragmento de cDNA y tenian que decir dos enzimas que usaron de una lista. Decir la
estrategia que se utilizo y como daria en un gel. Estilo problema 5 de la guia de proteinas recombinantes y clonado del
seminario. b) Pregunta muy mal redactada, decia algo como " Que sistema de expresion de E.coli se utilizaria para
expresar una proteina recombinante? o.O, onda me respondia en la respuesta en la pregunta, pero cuando pregunte se
referia a que vector se utilizaria. Y en la misma pregunta habia; de que manera se mejoraria el procedimiento (podia ser
geneticamente) para que mejore la purificacio ya que al final del procedimiento se obtenia mi proteina de interes con un
contaminante.

Final 21-12-12
1- Se obtiene una proteina con el 50 % de la actividad biologica.
a- Disee una estrategia para aumentar la actividad, sin modificar el plasmido.
b. Como evaluaria la estrategia
2- Era un ejercicio donde te daban el pi. hidrofobicidad, PM y te iba diciendo como se purifico. Pedi hacer los graficos de
la IEC, SEC y HIC, justificar por que se separa en cada metodo y tambien caluclar la AE y FP.
3. Ejercicio donde pedia calcular el rendmiento de biomasa. Td. Qs.
V o F : " En un batch la velocidad maxima no depende del pH siempre y cuando se ponga el sustrato en una
concentracion limitante"
4- Como interfiere el ADN en la purificacion.

Final 14-12-12
- Componentes del vector de expresion de celulas de mamiferos.
2) Elegir el que le parece el mejor metodo para la produccion de una proteina terapeutica en humanosProtocolo A.
expresion en cuerpos de inclusion, obtencion de la proteina con un tag de histidina y purificacion con IMACProtocolo B.
expresion en el citoplasma, de la proteina fusionada con una tiorredoxina, clivaje de la tiorredoxina y purificacion por
cromatografia de afinidad.
4- Vo F.a. el cambio de buffer no permite la elucion en IEC.b. para separar una proteina de otra en SEC no puede haber
mas de un volumen de columnac. se puede desalar usando SEC y el volumen de siembra no excede el 30%d. usando
SEC el volumen de muestra es ilimitado
6. a. como puedo hacer para expresar en altos niveles en levaduras un plasmido integrativo?b. ventajas y desventajas
entre Saccharomyces y Pichia.