9260 B.

Aislamiento e identificacin cualitativa General de Procedimientos de

Salmonela
En lugar de un protocolo especfico para la deteccin de Salmonella en agua, un breve resumen
de los mtodos adecuados para la recuperacin de estos organismos se da. Los mtodos
actualmente disponibles tienen ha utilizado en numerosas investigaciones de campo para
demostrar la Salmonella tanto en agua dulce y marinos ambientes acuticos. La presencia de
Salmonella en agua es muy variable; hay limitaciones y las variaciones en la sensibilidad y la
selectividad de aislamiento de Salmonella aceptada procedimientos para la deteccin de los ms
de 2300 serotipos de Salmonella actualmente reconocidas.

Por lo tanto, un resultado negativo por cualquiera de estos mtodos no implica la ausencia de
salmonelas, ni qu implica la ausencia de otros patgenos.

1. Tcnicas de Concentracin

Salmonella son ubicuos en el medio ambiente y pueden ser detectados a concentraciones bajas en

mayora de las aguas superficiales. Estos organismos estn generalmente presentes en pequeas
cantidades en comparacin con coliformes, por lo tanto, es necesario examinar una muestra
relativamente grande para aislar el organisms. . Swab tcnica: Preparar frotis de estopilla 23 cm
de ancho, doblado cinco veces en 36-cm longitudes, y cortar a lo largo de un plazo de 10 cm de
la cabeza en tiras de aproximadamente 4,5 cm de ancho. Segura envolver el extremo sin cortar o
plegada de cada bastoncillo con alambre de calibre 16-para su uso en suspensin el hisopo en
agua. Coloque los hisopos en bolsas de papel kraft de tipo y esterilizar a 121 C durante 15 min.
Lugar hisopo justo debajo de la superficie del lugar de muestreo para la exposicin 1 a 3 d.2, 3
(Longer Swab no aumentar el atrapamiento de los agentes patgenos.) Almohadillas de gasa de
similar grosor puede estar sustituido. Durante el muestreo, las partculas y microorganismos se
concentra a partir de la que pasa el agua a travs o por encima del aplicador. Despus de la
exposicin, recuperar el hisopo, colquelo en una bolsa de plstico estril, hielo, y enviar al
laboratorio. Mxima de almacenamiento de trnsito de tiempo permitido es de 6 h. No transporte
hisopos en medio de enriquecimiento, la temperatura ambiente puede causar transporte
proliferacin suficiente de organismos competitivos para enmascarar salmonelas. En la
almohadilla de laboratorio lugar, o partes de l medio de enriquecimiento. Cuando frascos de
medio de enriquecimiento que contienen hisopos helado se incubaron entre 40 y 41 C, y los
matraces lugar en un bao de agua 44,5 C durante 5 min antes de la incubacin en una
incubadora de aire.

b. Tcnica de tierra de diatomeas: Colocar una almohadilla absorbente (no un filtro de

membrana) en un membrana receptculo embudo de filtro, montar el embudo y aadir 2,5 g de
diatomeas estril tierra * # (55) para empaquetar el cuello alto sin apretar. Aplicar vaco y filtrar
2 L de muestra. Despus filtracin, desmontar el embudo, dividir resultante'''' enchufe de tierra
de diatomeas y la almohadilla absorbente en medio aspticamente con un filo de cuchillo,
esptula estril, y agregar a medios de enriquecimiento adecuadas. Como alternativa, coloque el
enchufe entero en medio de enriquecimiento.

c. Gran volumen de muestras: Utilice un filtro compuesto de microfibras de vidrio borosilicato

unidos con resina epoxi para examinar varios litros o ms de muestra, a condicin de que la
turbidez de la muestra hace no limitar filtration.4 El aparato de filtracin consta de un filtro de
2,5 6,4 cm de cartucho y un filtro titular. # (56) Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15
min. Coloque el aparato de filtro estril (Conectado en serie con la tubera a un depsito de agua
20-L botella y la bomba de vaco) en el 20-L recipiente de la muestra apropiadamente calibrado
para medir el volumen de muestra filtrada. Aplicar vaco y filtrar un volumen apropiado. Cuando
la filtracin es completa, retire el filtro y colquelo en un medio de enriquecimiento selectivo.

d. Filtro de membrana tcnica: Examinar baja turbidez del agua, varios litros de filtro a travs de
un estril 142-mm-Dimetro de la membrana de poro size.5 0,45-m para aguas turbias, capa
filtrante del filtro:

hacer 1 L de suspensin estril de tierra de diatomeas (5 g / L agua de grado reactivo) y filtrar

sobre 500 ml. Sin interrumpir la filtracin, agregue rpidamente muestra (1 litro o ms) para
permanecer suspensin y el filtro. Despus de la filtracin, la membrana en un lugar estril vaso
de la licuadora con 100 ml estril al 0,1% (w / v) de agua de peptona y homogeneizar a alta
velocidad durante 1 min. Aadir todo homogeneizado a 100 ml de doble potencia medio de
enriquecimiento selectivo. Como alternativa, utilice mltiplo de 47 mm de dimetro membrana
filtros para filtrar la muestra. Sumergir cada membrana aspticamente en 50 ml de simple
potencia medio de enriquecimiento selectivo y se incuba.

Deteccin cualitativa de Salmonella en agua potable sospechoso tambin se puede lograr con
xito por un anlisis ms detallado de algunos M-Endo culturas MF (de 100 ml de volumen de la
muestra) que contienen un crecimiento significativo y fondo total de coliforms.6 Despus de
completar la rutina Recuento de coliformes, filtro lugar entero con un crecimiento mixto en 10
ml de caldo tetrationato (que contiene 1:50 000 tinte verde brillante) para el enriquecimiento de
Salmonella antes del aislamiento diferencial colonia en agar verde brillante. Este enfoque nico
no requiere de grandes colecciones especiales de la muestra y puede ser una extensin de los
anlisis de rutina coliformes totales.

2. Enriquecimiento

Selectivamente enriquecer la muestra concentrada en un medio de crecimiento que suprime el

crecimiento de bacterias coliformes. Enriquecimiento de la muestra es esencial, porque los
patgenos por lo general estn presentes en nmeros bajos y medios slidos selectivos para el
aislamiento de colonia son algo txicos, incluso a patgenos. No solo medio de enriquecimiento
se puede recomendar que permite el crecimiento ptimo de los todos los serotipos de Salmonella.
Use dos o ms medios de enriquecimiento selectivos en paralelo para una ptima deteccin. Las
altas temperaturas de incubacin entre ellos 40 , 41,5 y 43 C y la adicin de tinte verde
brillante a los medios de ayudar a suprimir el crecimiento de fondo y puede mejorar la deteccin
de Salmonella, pero estas modificaciones tambin suprimir el crecimiento de algunos serotipos,
incluyendo Salmonella typhi. una. Selenito cistena inhibe caldo gram-positivos y enterobacterias
patgenas, mientras que lo que permite la recuperacin de la mayora de especies de Salmonella,
incluyendo Salmonella typhi. ptimo tiempo de incubacin para la mxima recuperacin de
Salmonella es 48 horas a 35 a 37 C. Repita rayas de tubos con turbidez varias veces durante el
primer da, y todos los das hasta el 5 d para aumentar el potencial de la recuperacin de todos
los serotipos que pueden estar presentes. Transferir 1 ml de caldo de cultivo selenito a un tubo
fresco de mismo medio para la incubacin continua para enriquecer el crecimiento de Salmonella
y mejorar an ms recuperacin de las placas de raya.

b. Selenito-F caldo permite la recuperacin ptima de la mayora de las especies de Salmonella,

incluyendo Salmonella typhi, despus de 24 h a 35 a 37 C. Este aumento de la recuperacin de
Salmonella es acompaado por una ligera disminucin en la selectividad en comparacin con
selenito cistina. Ms significativamente, el crecimiento de E. coli no se inhibe. Repita rayas de
varios tubos con turbidez veces durante el primer da y todos los das hasta 5 d para aumentar la
recuperacin potencial de todos los serotipos de mayo de estar presente. Transferir 1 ml de caldo
de cultivo selenito a un tubo fresco de mismo medio durante continuo incubacin para enriquecer
el crecimiento de Salmonella y mejorar an ms la recuperacin de las placas de raya.

c. Caldo de tetrationato, se incub a 35 C, inhibe coliformes y bacterias Gram-positivas,

permitiendo el enriquecimiento selectivo de la mayora de las especies de Salmonella,
incluyendo S. typhi. Ha sido inform que el caldo tetrationato es ms selectivo para Salmonella
que el selenito basados en medios de comunicacin cuando incubaron durante 48 horas a 43 C.
Mientras que esta formulacin es altamente selectiva, es incapaz de inhibir Proteus mirabilis, que
muestra un crecimiento ptimo. Crecimiento de Proteus y Citrobacter puede ser inhibido con
adicin de verde brillante (ver Seccin 9260B.3a). La incubacin a 43 C y Adems de verde
brillante tambin inhiben algunas especies de Salmonella, incluyendo S. typhi.

3. Crecimiento selectivo

La separacin adicional de los agentes patgenos de la poblacin no patgeno bacteriano restante

es facilitado por la eleccin adecuada de la temperatura de incubacin de enriquecimiento
primario seguido por diferenciacin secundaria en slido selectivo media.7 Estos factores,
temperatura de incubacin, medio de enriquecimiento y medio de aislamiento, estn
interrelacionados. Ninguna combinacin es ptima para recuperacin de todos los serotipos de
Salmonella. Mtodo de comparaciones son animados a determinar el mejor combinacin para
una circunstancia dada.

Los medios slidos usados comnmente para la deteccin de patgeno entrico puede ser
clasificado en tres grupos:
(A) los medios de comunicacin diferenciales con poca o ninguna inhibicin a las bacterias
patgenas, como EMB (Que contiene sacarosa), (b) medios selectivos que contienen sales
biliares o desoxicolato de sodio como inhibidores, 8, tal como agar de MacConkey, agar
desoxicolato, o xilosa lisina desoxicolato (XLD) agar, y (c) medios selectivos que contienen
colorante verde brillante, tales como agar verde brillante o bismuto sulfito agar. Cualquier medio
seleccionado debe proporcionar una supresin ptima de coliformes permitiendo al mismo
tiempo una buena recuperacin del grupo de patgenos. Gran habilidad en la deteccin de estos
patgenos es necesario debido al crecimiento de la competencia no patgenos diferentes. Rayar
duplicar placas, una gran medida y una ligera, a menudo ayuda en el reconocimiento de
patgenos entricos en el presencia de grandes cantidades de organismos interferentes. Agar
verde brillante: tpicas colonias bien aisladas Salmonella cultivadas en este medio son blanco
rosado con un fondo rojo. S. typhi y algunas otras especies de Salmonella crecen poco debido al
contenido de colorante verde brillante. Fermentadores de lactosa no est sujeto a la supresin del
crecimiento formarn colonias verdosas o pueden producir otras coloraciones. De vez en cuando,
ms despacio lactosa fermentadores (Proteus, Citrobacter, y Pseudomonas) se producen colonias
parecidas las de un patgeno. Reprimir efecto de propagacin de Pseudomonas mediante el
aumento de agar concentracin de 2%. En algunos casos, Proteus se ha observado que
enjambre''''; reducir este tendencia mediante el uso de placas de agar se seca para eliminar la
humedad superficial. Si las colonias sospechosas de Salmonella no se observ despus de 24 h
de incubacin, reincubate para un adicional de 24 h para permitir el crecimiento lento o
parcialmente inhibida organismos para desarrollar colonias visibles. Si las colonias tpicas no se
observan o si el plato est lleno racha, aislar en cultivo puro algunas colonias de bioqumica
caracterizacin. No fermentadoras de lactosa colonias en estrecha proximidad a la lactosa de
fermentacin colonias pueden estar enmascarados.

b. Bismuto sulfito agar (Wilson y Blair medium): exuberante crecimiento de Salmonella muchos
especies (incluyendo S. typhi) se puede esperar en este medio. Examinar las placas despus de
sulfito de bismuto 24 h de incubacin para las colonias sospechosas; reincubate durante 24 h
para detectar cepas de crecimiento lento. Tpico colonias se desarrollan generalmente un color
negro, con o sin un brillo metlico, y con frecuencia este ennegrecimiento se extiende ms all
de la colonia para dar un halo'' efecto''. Algunas especies de Salmonella desarrollar una
coloracin verde, por lo tanto, aislar algunos de estos tipos de colonias cuando las colonias
tpicas estn ausentes. Como con agar verde brillante, coloracin colonia tpica puede ser
enmascarada por numerosos bordeando las colonias despus de 48 h de incubacin. El color
negro tambin es desarrollado por otro Productora de H2S colonias, por ejemplo, Proteus y
coliformes determinados.

c. Xilosa lisina desoxicolato de agar: En comparacin con colorante verde brillante, desoxicolato
de sodio es slo ligeramente txico para Salmonella fastidioso. Organismos de Salmonella y
Arizona producir negro centrados en las colonias rojas. Bacterias coliformes, Proteus,
Enterobacter y muchos producen amarillo colonias. Tiempo de incubacin ptimo es de 24 h. Si
las placas se incuban ms, una reversin alcalina y posterior ennegrecimiento ocurrir con H2S-
positivas no patgenos (Citrobacter, P. vulgaris, y P. mirabilis).

d. Xilosa lisina agar verde brillante: este medio es especialmente bueno para Salmonella
muestras marinas. El verde brillante inhibe muchos Proteus, Enterobacter y Citrobacter especies.

4. Reacciones bioqumicas Muchos organismos entricos de poco o ningn patogenicidad

compartir algunas importantes bioqumico caractersticas con Salmonella. La identificacin de
patgenos por caractersticas de las colonias en medios slidos selectivos tiene limitaciones
inherentes en las variaciones biolgicas de ciertos organismos y no puede ser invocado por
identificacin an provisionales. Las colonias sospechosas crecido en selectiva medios slidos
debe ser purificado y caracterizado adems por las reacciones bioqumicas; definitiva
verificacin se basa en la identificacin serolgica. Por lo general, un gran nmero de cultivos
ser obtenido a partir del procedimiento de seleccin. Comercialmente disponibles kits de
medios diferenciales (vase la Seccin 9225) se puede utilizar como un alternativa a Phases1, 2,
y 3 se describe a continuacin, antes de la confirmacin serolgica. Estos kits de dar 95 a 98% de
acuerdo con las pruebas convencionales, aunque ms pruebas importantes ser necesario para
lograr una mayor diferenciacin entre las cepas de Enterobacteriaceae. Cuando dichos kits no se
utilizan, siga un patrn secuencial de las pruebas bioqumicas que se resultar en un mayor ahorro
de tiempo y medios para laboratorio personnel.

Fase 1-screening preliminar, la actividad de la fenilalanina desaminasa: Descartar fenilalanina

positivas desaminasa-culturas inmediatamente como indicativas del grupo Proteus. En esta
prueba, el punto aislados en agar fenilalanina y se incuba durante 24 horas, ya sea en 35 o 37 C.
La fenilalanina actividad desaminasa se indica por una zona verde que se desarrolla alrededor de
la colonia despus de la inundacin de la placa con una solucin 0,5 M de FeCl3. Asunto
fenilalanina desaminasa negativos-las culturas para la pruebas bioqumicas de

Fase 2-Bioqumicas pruebas: Las pruebas utilizadas son:

La conformidad con los patrones tpicos bioqumicos de la Salmonella determina si se culturas

ulteriores del proceso (Phase3). Culturas aberrantes pueden encontrar que no se ajustan a todas
las reacciones clsicas atribuir a cada grupo patgena. En todos los casos, por lo tanto, examinar
las reacciones en su conjunto y no descartar culturas sobre la base de un pequeo nmero de
aparente anomalas.
Fase 3-fermentacin reacciones: reacciones de prueba de fermentacin en dextrosa, manitol,
maltosa, dulcitol, xilosa, ramnosa, y caldos de inositol para caracterizar an ms la bioqumica
capacidades de los aislados. Esta clasificacin adicional reduce el nmero posible de positivo
culturas para ser procesados para la confirmacin serolgica. Si el laboratorio de pruebas est
equipado para confirmacin serolgica (ver 9260B.5.), esta serie de ensayos bioqumicos pueden
ser eliminados.

5. Identificacin de Gnero por tcnicas serolgicas

Al trmino de las pruebas bioqumicas recomendadas, inocular la sospecha de Salmonella cultivo

puro sobre una inclinacin de infusin de cerebro-corazn agar y se incuba durante 18 a 24 h a
35 a 37 C. Con lpiz de cera (china marcador), dividir un alcohol limpiar en portaobjetos de
vidrio en cuatro secciones. Prepare una suspensin densa de organismo de prueba mediante la
suspensin de crecimiento de un 18 - a 24-agar inclinado h en 0,5 ml 0,85% de solucin de
NaCl. Coloque una gota de antisuero de Salmonella'' O'' polivalente en la primera seccin y
antisuero ms 0,85% de NaCl en la segunda seccin. El uso de un bucle de inoculacin limpio,
transferir un asa de siembra de suspensin bacteriana a la tercera seccin que contiene 0,85% de
solucin de NaCl y se a la cuarta seccin contiene 0,85% de solucin de NaCl ms antisuero.
Agite suavemente deslizarse hacia atrs y sucesivamente. Si la aglutinacin no es aparente en la
cuarta seccin al final de 1 min, la prueba es negativa. Todas las dems secciones deben
permanecer despejadas. Cuando las reacciones bioqumicas son caractersticas de S. typhi y la
cultura reacciona con'' O'' antisuero polivalente, revise otras colonias de la misma placa para la
reaccin antgeno Vi. Si hay se observa una aglutinacin con antisuero Vi de Salmonella, la
cultura no es S. typhi. Identificacin de los Serotipos de Salmonella requiere la determinacin de
antgenos H y fase del organismo como descritos por Edwards y produciendo Ewing.10 aislados
reacciones bioqumicas consistente para Salmonella y positiva con polivalente'' O'' antisuero
puede ser identificado como'' Salmonella sp., serotipo o bioserotype indeterminado.'' Si la
identificacin de las especies es necesario, enviar los aislamientos confirmadas como Salmonella
mediante pruebas bioqumicas y polivalente'' O'' antisueros de referencia para laboratorios para
su anlisis posterior.

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