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    REVISTA DE LA SOCIEDAD PERUANA DE NEUMOLOGIA + Vol. 48 -N° 2+ May. jombre 2004, NIVEL SERICO DE CITOQUINAS EN PACIENTES ASMATICOS CRONICOS ESTABLES Autor Principal : Gayoso Cervantes, Oscar Danilo, Médico Asistente del Servicio de Neumologia Coautores : Dra, Patricia Paola, Jumbo Lucioni, Investigador principal - HNICH. Dr. José Luis, Aguilar Olano, Jefe de Seccién inmunclogia. Fac. Ciencias y Filosofla UPCH. Dr. César, Loza Mundrriz, Médico Asisiente del Servicio de Nefrologia-HNCH Dr. Eduardo, Gotuzzo Heren Bigo. twain Arcadic |, Director del Instituto de Medicina Tropical «AvH»-UPCH Dr. Jorge Enrique, Celedonio Colquicocha, Sub-investigador clinico - HNCH Lozada Requena,Investigador asociado-Seccién Inmunologfa. Fac. Ciencias y Filosofia-UPCH. MSc. vin, Best Cuba Laboratorio de Inmunclogia Instituto de Medicina Tropical «AVH»-UPCH RESUMEN: Objetivo: Evaluar el perfil inmunolégico de pacientes asméticos crénicos estables mediante el nivel sérico de croquinas Tht y Th Materiales y métodos: Se midieron los niveles séricos de IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-c e IFN-y por la técnica Cytometric Bead Array (CBA), en 40 asmaticos crénicos estables del «Hospital Nacional Cayetano Heredia» durante Febrero del 2004.Se indagé por factores demagraficos, clinicos y funcionales. Se asigné la severidad de acuerdo al GINA del afio 2002, incluyendo el régimen terapéutico. La atopia se evalué en funcién a la coexistencia o antecedente de cuadros clinicos alérgicos. Resultados: Encontramos una diferencia significativa entre los asmaticos leves y severos para IL-2 (r=-6.5), IL-4 (r=-5.04) ¢ IL-10 (r=1.21).El uso de corticoides: inhalados fue significativamente mayor en los asmaticos severos que en los leves (P=0.005).Asimismo, se encontré una relacién significativa entre IL-2 (r=0.36),lL-4 (r=0.31),IL-10( 0.35) y el %VEFI pre-broncodilatador; y una relacién positiva significativa entre IL-5 (r=0.4) eIL-10 (r=0.45) y el porcentaje de variacién det VEF1.En cuanto a atopia, IL-4/IFN-y fue significativamente mayor en los atépicos. Conelusiones: Nuestros hallazgos sugieren que IL-2 (pese a ser una citoquina Th1), IL-4 e IL5 son Gitoquinas importantes en la patogénesis del asma, asociéndose IL-4 a atopia més que al asma per se. La expresion de las dos primeras citoquinas est modulada por el uso de esteroides inhalados. Por el contrario, IL-10 denota un rol anti-inflamatorio, aunque los hallazgos respecto al %evariacion del VEFI refleja una funcién ain no bien definida. INTRODUCCION Se canocen por lo menos 2 sub-poblaciones de linfocitos T-helper (Th) segin el perfil de citoquinas que producen: Thi y Th2. Linfocitos Th1 secretan interleuquina {IL)-2, IL-12, interferon (IFN)-yy factor de necrosis tumoral (TNF)-B; y los Th2 producen IL-4, ILS, IL6, IL-9 @ IL-13. Ambos subtipos, Thi y Th2, secretan factor de necrosis tumoral (TNF)-8 (1, 2) Hay un balance por inhibicién mutua entre ambos: IFN-g ??inhibe la actividad celular Th2, mientras que la IL-4 inhibe la actividad Tht (3).La poblacién de células ThO es un tercer grupo de células T CD4-+ capaces de producir citoquinas Th1 y Th2, diferencidndose finalmente hacia una de ellas (4); y las células T reguladoras(Tr), como IL-10 y el factor de transformacién de crecimiento (TGF)-b, tienen un rol importante en la inmunoregulacién con supresion de la respuesta Thi. Elasma constituye un desorden atopico visto como una enfermedad del sistema inmune. No todo caso de asma es walérgicon; sin embargo, la atopia es el mayor factor de riesgo identificable para el desarrollo de asma. Se caracteriza por una respuesta celular de tipo Th2 frente a la inhalacién de alergenos, que comanda la secrecién de citoguinas. Las citoquinas juegan un rol integral en la ccordinacién y persistencia de este proceso inflamatorio crénico en las vias aéreas que caracteriza al asma bronauial (5). No habiendo sido llevados a cabo estudios similares en nuestro medio, el objetivo principal de nuestro estudio es evaluar el perfil inmunolégico de pacientes asmaticos crénicos estables mediante el nivel sérico de interleuquinas Tht: Ike2 e IFN-y; Th2: IL-4 y 5, citoquinas Tr como la 1L-10 y proinflamatorias como TNF-a, en funcién a la severidad de! asma mediante una tecnica nueva usada por primera vez en nuestro medio. mEéTODos Pacientes Se reclutaron 40 pacientes asmaticos crénicos estables (32 mujeres y 8 varones) de acuerdo a los, estndares de diagnéstico del American Thoraccic Society (ATS) (6), mayores de 14 afos, registrados y controlados periédicamente en el Hospital Nacional Cayetano Heredia durante Febrero del 2004. Los riterios de seleccién fueron: 1) no haber presentado algun episodio de obstruccién bronquial en las eae REVISTA_DE LA SOCIEDAD PERUANA DE NEUMOLOGIA + Vol. 48 - N° 2_+ Mayo - Diciembre 2004 ltimas 4 semanas que haya. motivado consulta a algén personal de salud; 2) no tener otra enfermedad respiratoria crénica; 3) no ser furmador; 4) no presentar ninguna condicién de inmunodeficiencia primaria 0 adquirida; 5) no haber presentado alguna infeccién respiratoria en las Gltimas 4 semanas; 6) no ser gestantes; 7) sin antecedente de cirugia mayor en los ultimos 6 meses; 8) sin antecedente de parasitosis intestinal en los Liltimos 6 meses; 9) sin corticoterapia sistémica en Ultimos 2 meses y sison cursos cortos, haber pasado por lo menos 2 semanas de-ditima dosis (7). Se consulté respecto a su historia de asma, medicamentos, comorbilidades, sintomes en las ltimas 2 semanas: tos, sibilantes, falta de aire u opresién de pecho y su frecuencia durante.el dia, noche 0 con alguna actividad. Se utiliz6 el espirémetro modelo Vitalograph-ALPHA manufacturado en Inglaterra, segtin las guias estandarizadas publicadas por la ATS (8). Se considero el porcentaje de volumen espiratorio forzado al primer segundo respecto al predicho o %VEF1 para fines de clasificacion de severidad. En el caso de que los pacientes estuvieran recibiendo o hubieran recibido recientemente un curso corto de corticoides sistémicos, 0 que hubiesen presentado alguin episodio de obstruccién bronquial en las itimas 4 semanas que haya motivado consulta u hospitalizacién, se tomaban sus datos y eran citados huevamente transcurrido el tiempo requeride de acuerdo a los critetios de exclusién. En la nueva cita se realizaba una nueva espirometria, previo ala toma de la muestra de sangre. Clasificacion de severidad delasma Seasigné el grado de severidad de acuerdo a las quias del GINA (9). Dado que los pacientes eran pacientes ~continuadores, la clasificacién de severidad utilizada fue la que incluye el régimen de medicacién diaria. ‘Atapiat Se evalué en funcién a la coaxistencia 0 antecedente de cuuadros clinicos alérgicos incluyendo: rinitis alérgica, dermatitis atapica, ete, fedici eceos por la técnica de citometria de flujo Cytometric Bead Array (CBA) usando un. kit comercial(BO® CBA Th1, Th2), catdlogo N°5S0749. Para calibrar el citometroy ‘uantificar los valores de las muestras, se ensayaron nueve muestras esténdar y el control negativo del kit, La técnica se fundamenta en el uso de seis poblaciones de petlas con distintas intensidades de Fluorescencia, las cuales han sido revestidas con anticuerpos de captura especificos para |L-2, IL-4, IL-5, I-10, TNF-c. e IFN-y. Las 6 pablaciones son mezcladas tomatido SOul para cada uno de los tubos de ensayo (10). Luego se agrega a cada uno de los tubos, S0ul de un anticuerpo monoclonal especifico para las citoquinas en estudio, unido a una sustancia fluorocroma: ficoeritrina (PE); y se afhade 50ul de las diluciones esténdary del contral negative a los tubos control; y 50ul de las muestras a los tubos de prueba. Se incubé por 3 horas a temperatura ambiente protegidos de la luz; se agregé ml de buffer de lavado. se centrifugé por 5 minutos.Se aspir6 y descarté el sobrenadante; y se afiadié nuevamente 300ul de mismo buffer a cada tubo para resuspender las particulas.Mediante un citémetro de flujo se complet6 el dosaje de las citoquinas tanto en las muestras esténdar como en las muestras problema (10). Aspactos Eticos Se cumplieron ios principios éticos de la Declaracion de Helsinki. Andlisis Estadistica: ESTUDIO DE SERIE DE CASOS DE TIPO ANALITICO, Las caracteristicas de variables independientes y dependientes se muestran en tabjas. La relacién entre las variables categoricas fue analizada con la prueba de Chi? y el test exacto de Fischer; y las continuas con el T-test para datos no apareados y la suma de rangos de Wilcoxon. Se correlacion6 las variables continuas independientes y dependientes mediante el test de Spearman. La relacién fue estadisticamente significativa si PS0.05. Se usé el software estadistico STATA versién 8. RESULTADOS Caracteristi fi ni poblacién: Las caracteristicas demograficas se presentan en la Tabla 1.Las caracteristicas clinicas se muestran en la tabla 1. Once pacientes (28.21%) controlaban su asma ‘con un farmaco; 21 pacientes (53.85%) can dos; y 7 (17.35%) con tres o més férmacos. Un paciente era intermitente leve; 11 eran persistentes leves; 17, persistente moderados; y 11, persistentes severos GGrafico 1}. El unico paciente con asma intermitente leve fue reagrupado con los pacientes persistentes leves, siendo calificados como «leves». Lic ocala hin ee und, anACTERISTICA Ds i Td ise ve @ Feat ‘ar TTF @ Tale (es) SKIS 91 0 “| Frempoae 38 iF @ stern ts arr Siar ia ig events ST [ey Bi ee, ae REVISTA DE LA SOCIEDAD PERUANA DE _NEUMOLOGIA - Vol. 48 22M \iciembre 2004 Gu 1, Grn de sever del as on a pablo de pacientes Disetbctéade os patenes de suerte seer dela (080) Nizar de patel Atopia; Once eran atépicos, de los cuales 10 no. tenian antecedente de tuberculosis. Los valores séricos se muestran en la Tabla 2. ‘abln2- Nel cede aterousaus nes paete eens (enya vase JB = romeo cr ay ae ae lar ar Bo a ine Tae a ra fay Ts ier 7 La IL-2 e IL-4 estaban inversamente asociadas con el grado de severidad; la -10 aumenta con la severidad. Se encontré una diferencia estadisticamente significativa entre pacientes leves y severos para estas ‘tres interleuquinas. IL-5 e IFN-y aumentan con el grado de severidad del asma (P>0.05). No hay resultados contributorios para TNF-o.Ver tabla 3 y Gréfico 2. TRA Neate nce dscns ha cionne cnea SACRA CONTENT eTERLEUQUINA ory ¥ remy) Cibeieit raging — Tiere] Imeterate ei nt Taeeaes sy] es ase | Ras aaa aaa TOS ae] Ha) ATE TPE W'saan gOS | CRESTS} aa psy nauias | ay aut ase tar | ascnian Na eaans)|Soune | Bawa BeMs Saw | AE Trams imag: | istecw tsar | xs ieee 57 ean rte seuss) | isieare | wan [raat latte fi t ear ronan | rien | cm mane Gedtige2, Nivel eso de L-10 de acuerdo aa svendad det som itequinas yla nat: Hubo una relacién significativa entre el nivel sérico deL-2 y 4 (r=0.36 y 0.31 respectivamente) y el %VEFI pre-broncodilatador; y se encontré una relacién significativa con IL-10 (r=-0.35). En los 30 pacientes con espirometria pre- y post-broncodilatador, hubo una relacién significativa entre IL-5 y 10 (r=0.40 y 0.45 respectivamente) y el porcentaje de variacion del VEF1 (Gréfico 3) Gcifig 3. Nive rica de ILS de sever a % do varia dst VEFI por Brorcosider gE 83 I : [s i 88 Trienta y uno pacientes usan corticoides inhalados y 9 pacientes no usan. Al comparar el uso de! esteroide inhaladso, la diferencia es significativa entre asmaticos leves y moderados, como entre el grupo de leves y severos. Ver tabla 3 y Gréfico 4. Gilead Uso de conicoides inhabids (CT de acuere ae severided cel REVISTA DE LA SOCIEDAD PERUANA DE_NEUMOLOGIA - Vc 2+ Mayo - Diciembre 2004 Relacién entre ¢l nivel sérico de las citaquinas y atopia: La relacién IL-4/IFN-y fue significativamente mayor en los at6picos (P= 0.0059).IL-10.es menor en los atépicos con un P cercano a 0.05. Ver tabla4 y Grsiico 5. ‘Hien sng sa BRETGTS ag canvcrenitca) EA Te | EAE Wee ai Ta i | aw wa rcs? [| wl [wa pes|ens|ons| os | [ats |oas jn “fa eae) a a fem | us | fos nan) on fae its | FR ew | ta foe [au] | | a [acs Pe fom jew fa) see] on La base fisiopatolégica de la obstruccién reversible de las vias aéreas caracteristica del asma bronquial es la inflamacién caracterizandose por un reclutamiento selective de células T de tipo Th? Muchos estudios han sugerido que la severidad del asma esté relacionada con el grado de inflamacién (11, 12). Nuestro estudio sugiere resultados similares. IL2 € IL-4 fueron significativamente mayores en los asmaticos leves que en los severos; y esto asimismo va acorde con la relacién pasitiva significativa encontrada entre el nivel sérico de estas dos citoquinas y el %VEFI en el grupo de pacientes reclutados. Pese a ser reconocida como citoquina Th1, se ha visto que la administracién de IL-2 en modelos animales produce un incremento en el nimero de Células inflamatorias presentes en fluido proveniente de lavado broncoalveolar, asociandose a hipersensibilidad de las vias aéreas (13); y estos hrallazgos se han repetido en el lavado broncoalveolar de pacientes con asma sintomatico (14). La a importancia de la IL-4 es aun mayor al controlar los principales eventos celulares que se presentan en el asma, registrandose niveles elevados en sangre periféricay lavado broncoalveoiar de pacientes asmaticos (15). Su expresién puede ser considerada como el mecanismo subyacente en los diferentes pprocesos alérgicos y no exclusivo del estado asmatico per se (16). Aunque serfa mas légico pensar que a mayor severidad de asma oa menor %VEFI, los niveles séricos de IL-2 y/o IL-4 deberlan ser mayores, hay uni aspecto que tenemos que tomar en cuenta ‘en, nuestros pacientes: el uso de corticoides inhalados, Este es significativamente mayor en el grupo de. pacientes asmaticos severos comparados con lés pacientes asméticos leves, estableciéndose entre ambos una diferencia estadisticamente significative para esta variable (P=0.005), lo cual explicaria ta relacion hallada entre los niveles séricos de 1L2 y/o Il- 4 la severidad del asma y/o %VEFI. La evidencia muestra que los corticaides inhalados mediante su accién antiinflamatoria, inhiben la transcripcién de varias interleuquinas entre ellas,IL- 2 e Il-d; en especial, son inhibidores potentes de la transcripcién del gen de la IL-2 (17). Elle podria explicar los menores niveles séricos registrados para IL-2 e IL-4 en los pacientes asmaticos severos. Seha reportado que los corticoides inhalados incrementan los niveles de IL-12 en las vias aéreas, la cual incrementa la proliferacion de células Tht y la secrecién de IFN-« (18). Asimismo, Shahid y

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