HIDROXILAMINA COMO AGENTE MUTAGNICO PARA NEUROSPORA CRASSA

RESUMEN

La mutagenicidad de la hidroxilamina (HA) se ha ensayado en 8 adeninas diferentes requiriendo

mutantes (ad-3B) de Neurospora crassa: 4 mutantes de este conjunto de probador revertieron
despus del tratamiento con cido nitroso y metanosulfonato de etilo indicando que revierten
mediante una sustitucin de pares base, slo despus del tratamiento con ICR

170 que indican que revertirn mediante una insercin o supresin de pares de bases y 2
mutantes

slo espontneamente. La especificidad de la accin de HA sobre los mutantes en el presente

conjunto de probadores es consistente con la hiptesis de que la clase predominante de
alteraciones genticas inducida por HA en Neurospora es transiciones bascpair de la citosina
guanina a adeninefhymine. Adems, se encontr que la friccin de reversin despus del
tratamiento con HA es proporcional al cuadrado del tiempo de tratamiento.

INTRODUCCION

HA induce sustituciones de pares de bases en fagos y el tipo de alteraciones genticas es

preferentemente9 de GC a AT. La reaccin qumica entre HA y el ADN ha sido analizada por FREESE
et al, "que encontr que la HA reacciona slo con citosina y HMC.El tratamiento de ARN con HA
altera tanto uracil y citosina, a pH (u la reaccin es mucho ms rpido con citosina que con uracilo,
mientras que a pH ms alto la relacin se invierte14. HA ha demostrado inducir dao cromosmico
en clulas de mamferos16, pero ningn atternpt anterior ha sido exitosa en la identificacin de la
alteracin gentica inducida por HA en eucariotas a nivel molecular La caracterizacin de las
mutaciones HAinduced en Neurospora es particularmente importante porque puede ser tan
especfico en eucariotas como en el fago en la produccin de mutaciones por sustituciones de par
de base resultantes de transiciones GC a AT. . Dicha especificidad hara que HA estuviera
especialmente bien preparado para la caracterizacin de las alteraciones genticas inducidas por
agentes mutagnicos menos especficos a nivel molecular mediante ensayos de revertibilidad
especfica. Las pruebas para la induccin de reversiones en mutantes resultantes de alteraciones
genticas conocidas son un mtodo mucho ms sencillo para caracterizar los efectos genticos de
los mutgenos que cualquier tcnica conocida de forwardmutation en Neurosporas. La
caracterizacin est limitada por el conjunto de alteraciones genticas en cada mutante que
comprende un conjunto de probador. Sin embargo, al seleccionar mutantes que revierten por las
alteraciones genticas ms comunes, es posible obtener una primera aproximacin del espectro
de alteraciones genticas producidas por un mutagn determinado.

En este documento un conjunto de probador de ad-3B mutantes consistente en 4 mutantes que

revertir

slo por sustitucin de pares de bases, 2 mutantes que slo se revierten por insercin o supresin
de pares de bases y 2 mutantes que slo se revierten espontneamente, se trataron cada uno con
HA y luego se rastrearon para detectar reversiones al tipo salvaje. Los resultados de tales ensayos
muestran claramente que en Neurospora HA produce reversin slo en aquellas cepas que
vuelven por sustitucin de pares de bases. La especificidad de la accin de HA sobre los mutantes
en el presente conjunto de probador es consistente con la hiptesis de que la clase predominante
de alteracin gentica inducida por HA en Neurospora es la transicin de pares de bases de GC a
AT.

Materiales y mtodos

(a) cepas

Los mutantes con el prefijo 217 fueron inducidos por cido nitroso en la cepa de tipo salvaje
Neurospora 74A (DE SERRES, BROCKMAN, BARNETT y K0LMARK, en preparacin). El mutante No.
541 es de origen espontneo (BROCKMAN, indito). Los mutantes han sido aislados por el mtodo
directo3.

(b) Preparacin del cultivo

En todos los experimentos se llev a cabo el tratamiento mutagnico sobre suspensiones de

conidios recogidas en matraces Erlenmeyer de 125 ml que contenan 20 ml de medio completo de
glicerol10 (glicerol I0 por litro en lugar de 20 ml) {sulfato de adenina (25 mg / l). Los matraces se
inocularon y luego se incubaron durante 1 da a 30 y luego durante 69 das a 25 . Los conidios se
cosecharon agitando primero los cultivos con perlas de vidrio (4 mm de dimetro) para romper las
cadenas de conidios; a continuacin se suspendieron en solucin salina (0,9%), se filtraron a travs
de un filtro de platino, se lavaron dos veces por centrifugacin y despus se resuspendieron en
solucin salina. Los mutantes Ad-3 difieren entre s con respecto al desarrollo del pigmento
prpura en el micelio y los conidios cuando se crecen sobre glicerol completo, pero aadiendo 250
mg de sulfato de adenina por litro, la acumulacin de pigmento morado se elimina esencialmente.
La densidad de las suspensiones de conidios se midi en un colormetro (Spectronic 20, Bausch y
Lomb, Rochester, Nueva York) a las absorciones de pico de 750 m .

c)Tratamientos

Todos los tratamientos se realizaron con suspensiones de conidios (2 ro7 / ml) en matraces
Erlenmeyer en un agitador rotatorio en bao de agua a 25 para mantener los conidios en
suspensin durante el tratamiento. 5 min antes de la extincin de los conidios se centrifugaron y el
sobrenadante se decant. En el momento del enfriamiento despus del tratamiento con NA, EMS
o ICR170, los conidios se resuspendieron en una solucin salina de 1 l de Fries1 ajustada a pH 8
con NaOH.Esto se repiti 2 veces.

Se ha encontrado que la solucin de sal de FRIES1 ajustada al pH para detener la reaccin entre las
clulas y los compuestos alquilantes y NA inmediatamente (MALLING, sin publicar).

(d) Tratamientos NA

Los conidios se suspendieron en tampn de acetato de sodio 0,05 M a pH 45. Se aadi un

volumen de solucin de nitrato sdico 0,02 M recin preparada a 3 volmenes de conidios. La
concentracin final fue 0,005 M NaN02, y el tratamiento se inactiv como se describi
anteriormente 40 minutos despus del inicio del tratamiento.
(e) Tratamiento EMS

Los conidios se suspendieron en un tampn fosfato 0,067 a pH 7,0. El tratamiento se inici

aadiendo suficiente EMS para llevar la concentracin final hasta 0,1 M; el tratamiento se apag
300 min despus.

f) Tratamiento ICR-I70

ICR170 es el nmero de cdigo asignado al diclorhidrato de metoxi-cloro93 (etil2-cloroetil)

aminopropilamino) acridina por H. J. CREECH y colaboradores del Institute for Cancer Research,
Filadelfia. Los conidios se suspendieron en un tampn de fosfato 0,067 M a pH 7,0. El tratamiento
se inici aadiendo I vol. de una solucin recin preparada de ICR170 (250 mg / 1 H20) a 49
volmenes. De la suspensin de los conidios que dieron una concentracin final de 10,58 M. El
tratamiento se inactiv como se describi anteriormente 130 minutos despus del inicio del
tratamiento. El tratamiento y otras manipulaciones que implican la ICR170 y los conidios se
realizaron bajo luz roja para eliminar los efectos fotodinmicos asociados con el anillo de
acridina12,13. Las placas tambin se incubaron en la oscuridad durante al menos 24 horas para
permitir un tiempo suficiente para que los conidios dieran lugar a pequeas colonias.

(g) Tratamiento HA

Antes del tratamiento con HA, los conidios se suspendieron en 3 M NaCl y luego se diluyeron 5
veces ms en la mezcla de reaccin HA de STRACK, FREESE AND FREESE17 dando una
concentracin final de HA de 1 M.5 min antes de que el tratamiento se apagara , los conidios se
centrifugaron y decantaron, y al tiempo de enfriamiento (es decir, 300 min despus del inicio del
tratamiento) los conidios se resuspendieron en NaCl 3 M. Este procedimiento de lavado se repiti
dos veces y luego los conidios se suspendieron en la solucin salina del medio mnimo1 de Fries
ajustado a pH 8.

(h) Medio de revestimiento

Para estimar la viabilidad de los conidios tratados y no tratados, se sembraron en el mnimo18 de

WESTERGAARD con sorbosa (15 g / l), glucosa (0,5 g / l), fructosa (0,5 g / l), casamino cido (200
mg / 1), una solucin de vitaminas como en glicerol complete (1 ml / 1), y adenina sulfato (25 mg /
1).Para estimar el nmero de revertantes los conidios se depositaron en el mismo submarino
utilizado para evaluar los supervivientes pero suplementado con 0,2 mg / l de sulfato de adenina
en lugar de 25 mg / l de sulfato de adenina.

En las placas para determinar la supervivencia, la densidad de los conidios fue de 510 conidios por
ml de sustrato en un volumen total de aproximadamente 1oo ml. Para el marcado de los
revertantes despus del tratamiento con NA, EMS o ICR170, los conidios se sembraron a una
densidad de 106 conidios por ml y 2, 115 conidios por ml, cada uno en un volumen total de 1oo
ml. Para la puntuacin de los revertantes despus del tratamiento con HA, la densidad de los
conidios fue de 2,106 por ml en un volumen total de 500 ml.

i) Prueba estadstica

La prueba de significacin se realiza de acuerdo con BIRNBAUM (vase la referencia 2, pgina

261). Se considera que el nmero de revertantes tiene una distribucin de Poisson. La
probabilidad se calcula suponiendo que las dos proporciones siguientes pertenecen a la misma
poblacin:

Poblacin total (sobreviviente despus del tratamiento)

Poblacin total (sin tratamiento) + poblacin total (supervivencia despus del tratamiento) (1)

Nmero total de revertentes en la poblacin tratada

Nmero total de revertentes en la poblacin no tratada + nmero total de (2)

revertentes en la poblacin tratada

Una probabilidad inferior al 5% indica una diferencia significativa entre el nmero de reversiones
en el control y las series tratadas.

(a) Supresores

La identificacin de la alteracin gentica en mutantes individuales mediante la determinacin de

la especificidad en la induccin de reversiones despus del tratamiento con diferentes agentes se
ver distorsionada por la aparicin de mutaciones supresoras junto con mutaciones inversas. Los
reactivos de 20 mutantes diferentes inducidos en los loci ad-3 (refs. 5, II, y BARNETT, inditos) se
han analizado por la aparicin de supresores extragnicos, y ninguno se encontr. Por lo tanto,
podemos suponer que los supresores que ocurren fuera del locus ad-3A o ad-3B son raros o que
no ocurren.

(b) Alteracin gentica inducida por HA

La mutagenicidad de la HA ha sido estudiada determinando si existe alguna especificidad en su

actividad de accin para inducir reversiones con un conjunto tester de 8 mutantes (Tabla I). Sobre
la base de los datos actuales, 4 de estas cepas parecen revertir slo por sustituciones de pares de
bases (revertible por NA y EMS), 2 cepas parecen revertir por una insercin y / o supresin de par
de base (slo revertible por ICR170), y 2 cepas revertir slo espontneamente.

ICR170 es un gas de mostaza de acridina monofuncional; las mutaciones avanzadas inducidas por
ICR 170 en Neurospora crassa parecen ser principalmente inserciones o deleciones de pares de
bases4.
Mutante P or c e nt aj e de S up e r v i v e nc i a Reversiones por 10 8 supervivientes

No. NA EMS JCR-r70 HA SP NA EMS ICR-r70 HA

2-17-8 75 86 54 o o
77
o o
5
o o
2-17-23
5-4-r So
88 95
77 6I
68 62
50 0.3
0.2 o 5 1938 o
2-I 7-7 50 69 70 90 4 o 5 749 o
2-17-61 So 68 62 60 5 183 198 o 45
2-17-155 93 99 72 62 79 377 8 20
2-17-18 61 71 6r 64 3 182 ro gr o
2-17-126 82 95 90 68 4 136 77 146 8
TABLA 1 EL PORCENTAJE DE SUPERVIVENCIA Y LAS FRECUENCIAS DE REVERSIN DEL TESTER SET
DESPUS DE TRATAMIENTO CON ICR170, NA, EMS Y HA

a o significa que la frecuencia de reversin no es significativamente diferente de la muta

espontnea frecuencia de respuesta al 5% de confianza.

Por lo tanto, es probable asumir que los mutantes que revertir despus del tratamiento con ICR-
170 y no despus del tratamiento con NA y EMS, que induce predominantemente sustituciones de
pares de bases, revertir mediante una insercin o delecin de pares de bases. Sin embargo, se
encontr (Tabla I) que los mutantes que revertieron por sustituciones de pares de bases (217155,
21718,

217126) tambin se repiten despus del tratamiento con ICR170. Esto puede explicarse por el
hecho de que ICR170 es una mostaza monofuncional y por lo tanto capaz de alquilar, y el
resultado de una alquilacin en el ADN es usualmente una sustitucin de pares base.

Las frecuencias de reversin despus del tratamiento HA son bajas en comparacin con las
frecuencias de reversin despus del tratamiento con NA y EMS a frecuencias de supervivencia
comparables. La cepa 217155 se ha tratado con HA a pH 6,2 durante varias longitudes de tiempo.
Una expresin directa que demuestre que HA tiene un efecto mutagnico en Neurospora se puede
obtener calculando la razn (M / Mo) donde (M) = el nmero de reversiones por

1o6 conidios despus del tratamiento HA y (Mo) = el nmero de reversiones espontneas por
conidios I06. En la Fig. 1 se puede observar que se obtuvieron 8 veces ms mutantes en la serie
tratada con HA que en el control.

Fig. I, El aumento en el pliegue del nmero de reversiones (M) anotadas despus del tratamiento
HA sobre el nmero de mutaciones espontneas (M0) representadas en funcin del tiempo de
tratamiento con HA.

Fig. 2. El porcentaje de supervivencia representado en funcin del tiempo de tratamiento con HA.
Por lo tanto, podemos concluir que HA es mutagnico en Neurospora. La supervivencia no fue
inferior al 42% incluso para el tratamiento ms largo (Fig. 2). Se encontr que HA induce
reversiones en 3 de las 4 cepas que revertir por sustituciones de pares de bases (Tabla 1]. El
fracaso de ciertos mutantes de sustitucin de pares de base para revertir con HA se puede explicar
si asumimos que induce predominantemente transiciones de GCAT en Neurospora como lo hace
en fagos. Si ese es el caso, entonces esperaramos que existan ciertos mutantes de sustitucin de
pares base que no pueden ser revertidos por HA.

(c) La cintica de induccin de reversiones

Las frecuencias de reversin inducidas por HA no son proporcionales al tiempo en Neurospora,

sino que siguen una cintica de segundo orden (Fig. 3). Sin embargo, la HA indujo la mutacin
directa y reversa en el fago siguiendo la cintica de orden8,9.

Fig. 3. Cintica de las inducciones de reversiones por HA en el mutante de sustitucin de pares de

bases 2-17-155. La frecuencia de las reversiones por 108 supervivientes se representa en funcin
del cuadrado del tiempo de tratamiento con HA.

Esta incoherencia podra resultar de varios mecanismos: (I) que una reversin inducida en
Neurospora debe expresarse en un conidium, que tiene un promedio de 2 ncleos, y la expresin
depende de la inactivacin de uno de los 2 ncleos, (2) que el tratamiento HA promover una
penetracin ms rpida de HA en la clula, o muy probablemente (3) que la reaccin de HA con
citosina ocurre en dos pasos (para revisin, schuster y WITTMAN15) y que la velocidad de reaccin
de los 2 pasos es ms casi igual en Neurospora que en fago.

La velocidad de reaccin de la citosina con HA depende del pH; el aumento del pH da lugar a
velocidades decrecientes de reaccin14. Los experimentos para investigar la relacin entre el
mecanismo de mutagnesis de HA en virus y Neurospora mediante el estudio del efecto del pH
sobre las tasas de mutacin estn ahora en curso.

(d) Mutaciones hacia adelante inducidas por HA

Se han llevado a cabo experimentos para obtener informacin ms detallada sobre los efectos
genticos de HA en Neurospora mediante el tratamiento de un dikaryon equilibrado
genticamente marcado7.

La frecuencia de emisin directa despus del tratamiento de 6 horas bajo las condiciones descritas
aqu proporcion 600 mutantes por conmoides supervivientes de 1o K. Las mutaciones obtenidas
en este sistema de ensayo estn ahora en proceso de ser analizadas con respecto al genotipo
(mutaciones nicas o multilocus), complementacin allica porcentaje de mutantes
complementarios as como los tipos de patrones de complementacin) y revertibilidad especfica
despus del tratamiento con NA, EMS, ICR170 u otros agentes y se informar en otra parte.

ACNOWLEDGEMEKT

Deseo agradecer al Dr. F. J. DE SERRES valiosas sugerencias y cooperacin, la ayuda del Dr.
MARVIN KASTENBAUM en el anlisis estadstico, y el Dr. H. J. CREECH y colaboradores del Instituto
para la Investigacin del Cncer, Filadelfia, por su don de ICR170. Esta investigacin fue
patrocinada conjuntamente por los Institutos Nacionales de Salud y por la Comisin de Energa
Atmica de los Estados Unidos bajo contrato con el

Union Carbide Corporation