2.

1 Identificacin de microrganismos eficientes a nivel de genero capturados de

montaa:
La identificacin de los microorganismos eficientes se realiz en los laboratorios de la
Universidad Mariana sede Alvernia en el mes de febrero (ver apndice R).

Aislamiento de bacterias: tras haber realizado la inoculacin en los medios de

cultivo selectivos MRS, Agar Rogosa y Van Niels, se observaron las siguientes
caractersticas, presentadas en el siguiente cuadro:

Cuadro 1. Caractersticas observadas en medios de cultivos selectivos

MICROORGANISMO MEDIO DE CULTIVO CARACTERSTICAS

Lactobacillus spp
Rhodopseudomona spp
Se observ crecimiento de
Agar MRS colonias pequeas, de color
blanco y superficie lisa.
Se observ crecimiento de
Agar Rogosa colonias blancas, de tamao
mediano y grande, y superficie
lisa.
Se observ colonias
Agar Van Niels pequeas, circulares y
convexas.

El cuadro 7 indica las caractersticas del crecimiento de bacterias

pertenecientes al gnero de Lactobacillus spp en el medio de cultivo MRS. El
crecimiento de este microorganismo se debe a que este medio de cultivo contiene
peptona, extracto de carne y de levaduras que proporcionan los nutrientes necesarios y
aprovechables por este tipo de cepas; donde adems el Polisorbato 80, el magnesio y
manganeso actan favoreciendo su crecimiento y la dextrosa es su fuente de energa
(Dibico, 2017). Por otro lado, el monoleato de sorbitn y las sales de sodio inhiben el
desarrollo de microorganismos o flora acompaante de la cepa de Lactobacillus spp;
donde el citrato de amonio acta como agente inhibitorio del crecimiento de bacterias
Gram negativas (Dibico, 2017)

A su vez, el crecimiento de la cepa de Lactobacillus spp en el Agar Rogosa se

debe a que ste contiene peptona de casena y extractos de levadura que son la fuente de
carbono y nitrgeno, que son los nutrientes necesarios para el crecimiento este tipo de
bacterias, donde el sulfato de hierro, magnesio y manganeso favorecen el crecimiento de
los Lactobacillus y la elevada concentracin de acetato de sodio inhibe el crecimiento
de la flora acompaante (Dibico, 2017).

Por otra parte, el crecimiento de las bacterias correspondientes al grupo de las

Rhodopseudomonas spp en el medio de cultivo Van Niels, se debe a que este medio
proporciona los sustratos orgnicos de azucares simples y complejos. Los contenidos de
sulfatos de este medio son usados como la nica fuente de azufre que las bacterias de
Rhodopseudomona requieren para crecer; mientras que los contenidos de amonio,
dinitrgeno y algunos aminocidos son usados como su nica fuente de nitrgeno. Los
niveles de Fosfato dipotsico no permite el crecimiento y desarrollo de cualquier flora o
microorganismo acompaante (American Type Culture Collection, 2013).

Dentro de este marco, Vzquez et al., (2007) en su trabajo de aislamiento y

caracterizacin de cepas de Lactobacillus spp, inocularon muestras de esta bacteria en
Agar MRS donde observaron colonias de crecimiento de forma pequeas y blancas.
Comparando las caractersticas descritas del trabajo de Vsquez et al., (2007) con
respecto a las de la presente investigacin se puede decir que son similares y permite
verificar que el microorganismo aislado s corresponde a la cepa de Lactobacillus spp.

Del mismo modo, Viloche (2009) en su investigacin sobre el aislamiento de

Lactobacillus spp en Agar Rogosa, observ caractersticas tpicas de esta cepa en este
medio de cultivo; colonias pequeas de color cremoso de 4 ml de dimetro.
Relacionando las observaciones del crecimiento de esta bacteria en el Agar Rogosa de
esta investigacin con respecto a las de Viloche (2009), sus caractersticas son
semejantes y permiten corroborar que la cepa inoculada s corresponde a Lactobacillus
spp.

Finalmente, Cardona y Garca (2008) describen en su investigacin, de la

evaluacin del efecto de los microorganismos eficaces en aguas residuales, las
caractersticas de las colonias de Rhodopseudomona spp en el medio de cultivo Van
Niels; y aluden a colonias que variaban de tamao pequeas a medianas y de forma
circular. Confrontando la descripcin de las colonias de la investigacin anterior
respecto a las de la presente, se puede decir que las caractersticas observadas si se
asemejan a las cualidades propias de la cepa de Rhodopseudomona spp cuando se la
inocula en este medio.

Tincin de Gram: Esta actividad permiti determinar la morfologa de las

bacterias aisladas de Lactobacillus spp y Rhodopseudomona spp. Las Figuras 6
muestran las bacterias tinturadas y el Cuadro 8 muestra las caractersticas morfolgicas
y color observado en el microscopio a 100X.

Figura 1. Tincin de Gram de Lactobacillus spp y Rhodopseudomonas spp

Cuadro 2. Caractersticas observadas en las cepas de Lactobacillus spp y

Rhodopseudomona spp..
Microorganismo Caracterstica observadas
Lactobacillus spp Forma bacilar y color violeta
Rhodopseudomona spp Forma bacilar y color rosado

Como se observa en el Cuadro 8 y teniendo en cuenta la figura 6, la cepa de

Lactobacillus spp presenta un color y una forma especfica tras ser coloreada a travs de
la tincin de Gram, que permite la diferenciacin de bacterias pertenecientes a la familia
de las acido lcticas BAL. Con respecto a Romero (2007) establece que en materia de
aislamientos de bacterias provenientes de productos lcteos, la forma bacilar y color
violeta corresponden a microorganismos acido lcticos potencialmente probiticos.

As tambin el color violeta caracterstico de las bacterias acido lcticas se

debe al contenido de un polmero denominado peptidoglucano en las dos capas externas
de la membrana celular bacteriana (Murray et al; 2006), el cual, en bacterias Gram
positivas, se encuentra en mayor cantidad con respecto a las bacterias Gram negativas;
aproximadamente el 90 % del total de la membrana (Bailey y Scott, 2009). A su vez, el
color violeta en las Gram positivos se debe a que el contenido de peptidoglucano no
permite resistir la decoloracin del colorante primario (violeta de genciana) con el
alcohol cetona; haciendo que la safranina, el segundo colorante, no se adhiera con
mayor impacto a la pared celular tomando el color del primer colorante (Bailey y Scott,
2009).

Igualmente, Sossa et al., (2009) en su investigacin relacionada con el

aislamiento e identificacin de Lactobacillus spp, realizaron tincin de Gram a bacterias
acido lcticas, donde observaron bacterias con morfologa bacilar, con tamao de 10 m
y de color violeta. Contrastando las caractersticas observadas de la cepa de
Lactobacillus spp de la investigacin de Sossa et al., (2009) con respecto a las de este
trabajo, se puede decir que son iguales y por lo tanto se infiere que las bacterias
observados corresponden efectivamente a clulas Gram positivas.

Relacionado a ello, Sobrino (1999) realiz la caracterizacin bioqumica e

inmunolgica de Lactobacillus sake 148, en donde aisl esta cepa en matrices de
embutidos crnicos para realizar posteriormente tincin de Gram, obteniendo como
resultados la observacin de las caractersticas innatas de bacilos Gram positivos de este
tipo de clulas. Comparando estas observaciones con respecto a las de esta
investigacin se puede decir que son iguales y permite corroborar que la cepa de la
bacteria tinturada corresponde a Lactobacillus spp.

Ahora bien, el color rosa de la cepa de Rhodopseudomona spp se debe a la

escasa cantidad de peptidoglucano de su membrana celular siendo sta una bacteria
Gram negativa; el cual varia de un 20 a un 40% del total de su membrana y permite
inferir que sta pertenece a la familia Rhodospirillaceae (Larimer et al., 2004).

Pacheco et al., (2012) en su trabajo de aislamiento y caracterizacin de

bacterias fottrofas de la familia rhodospirillaceae pudieron observar que la cepa de
Rhodopseudomona spp presenta forma bacilar y color rosa cuando es sometida a la
tincin de Gram; catalogndola como una bacteria Gram negativa. Comparando las
anteriores caractersticas con las de esta investigacin, se dice que estas bacterias son
semejantes y la bacteria tinturada corresponde a Rhodopseudomona spp.
 Prueba de Oxidasa: La prueba de oxidasa result negativa, ya que la
reaccin de oxidasa se debe nicamente a la presencia de un sistema citocromooxidasa
que activa la oxidacin del citocromo de la tirilla del test, que es reducido por el
oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno, evidenciado cuando la
tira de oxidasa no cambia en su viraje. Por lo general, el sistema citocromooxidasa
slo se encuentra en los organismos aerobios y en algn microaerfilo (Vibrio fetus),
pero los anaerobios facultativos carecen de actividad oxidasa; el caso de Lactobacillus
spp (Cortes, 2002). La figura 7 muestra el resultado de la prueba de oxidasa.

Figura 2. Resultado prueba de oxidasa para Lactobacillus spp

As, Rodrguez (2007) en su Trabajo de Aislamiento e identificacin de

bacterias cido lcticas en matrices lcticas, realiz la prueba de oxidasa a 31 muestras
de productos lcteos donde el 97.34% de ellas fueron negativas. En ese contexto, y
comparando los resultados de esta esta prueba con los de Rodrguez (2007) se puede
confirmar que efectivamente la cepa identificada corresponde a Lactobacillus spp.

Prueba de Catalasa: La prueba de catalasa para Lactobacillus result

negativa, debido a que esta bacteria sintetiza el perxido de hidrogeno H2O2 gracias a la
actividad de determinadas flavoprotein-oxidasas o NADH-peroxidasas que desdoblan la
molcula de perxido de hidrogeno en agua y oxigeno produciendo la aparicin de
burbujas tal cual como lo indica la figura 8 (Sobrino, 1993 citado por Rodrguez, 2007).
Figura 3. Prueba de catalasa negativa para Lactobacillus spp

De acuerdo a la investigacin de Rodrguez (2007), observ que la prueba de

catalasa para la cepa de Lactobacillus spp con perxido de hidrogeno al 30% de
concentracin resulto negativa, evidenciando la presencia de burbujas en sus ensayos.
Lo anterior permite corroborar que la formacin de burbujas en la muestra bacteriana es
un indicador innato de la pureza de la cepa de Lactobacillus spp.

Identificacin de levaduras: Esta actividad se realiz analizando la forma del

crecimiento de las levaduras en los agares PDA y SAB con respecto a las claves
taxonmicas Bonifaz (2012). A nivel macroscpico, el crecimiento de estas colonias
son convexas, lisas y opacas, de apariencia hmeda, cremosa, con colores que van desde
blanco a color crema, y su tamao varia de entre 1 y 2cm; (figura 9)

Figura 4. Levaduras del genero

Saccharomyces spp a nivel Macroscpico

En la figura 10 se muestran las levaduras observadas a nivel microscpico, las

cuales presentan forma cilndrica y los conidios tienen base muy ancha; caractersticas
innatas del genero Saccharomyces spp, Las especies de Saccharomyce spp producen de
una a 4 ascosporas, las cuales son redondas y tienen mayor afinidad a los colorantes,
que el cuerpo de la levadura, lo que ayuda a su identificacin (Bonifaz, 2012).

Figura 5. Levaduras del genero Saccharomyces spp a nivel microscpico

As mismo, la Universidad de Antioquia de Colombia (2017) en su estudio de

la morfologa macroscpica y microscpica del genero Saccharomyce spp a partir de un
cultivo en medio de jugo de vegetales, muestran las caractersticas del crecimiento de
este microorganismo en Agar Sabouraud. Comparando la descripcin de las colonias de
crecimiento de esta investigacin en el medio de cultivo SAB y la forma de las
levaduras observadas en el microscopio infieren a que s corresponden a levaduras
pertenecientes al grupo de las Saccharomyce spp.

Inoculacin de los microorganismos eficientes en el suero lcteo: tras haber

realizado la inoculacin de los tres microorganismos a nivel de gnero (Lactobacillus
spp, Rhodopseudomona pss y Saccharomyces spp) en el suero lcteo, se realiz la
siembra de stos en los agares MRS, Van Niels y SAB respectivamente, para observar
su permanencia y ser vertidos al suelo. Las figuras 11 y 12 muestran los medios de
cultivo con las cepas inoculadas en el suero lcteo.

Tabla 1. Caractersticas fisicoqumicas y bromatolgicas del lacto suero generado

por la industria Porvenir el Campo.

Anlisis fisicoqumico
Ph 3.2
Densidad (g/ml) 2.03
Nitrgeno Total (%) 0.18
Anlisis Bromatolgico
Proteina % 0.96
Grasa % 0.40
Cenizas % 0.69
 Figura 6. Cultivos Cepas de Rhodopseudomonas spp y Lactobacillus spp. De lacto suero en
medios de cultivo Van Niels y MRS respectivamente

Como muestra la figura 11, se evidencia la presencia de colonias pequeas, de

color blanco y con superficie lisa en el agar MRS, y se observ colonias pequeas,
circulares y convexas en la superficie del agar Van Niels; infiriendo as que el suero
lcteo, a pesar de ser un compuesto acido, no tiene un efecto bactericida sobre las cepas
Lactobacillus spp y Rhodopseudomona spp. En el mismo sentido, en la figura 12 se
observa la presencia de colonias convexas, lisas y opacas, de apariencia cremosa y de
color blanco. Despus de la inoculacin y observar el crecimiento micolgico, se puede
decir que el suero lcteo no tiene un efecto fungicida sobre las levaduras del genero
Saccharomyces spp.

Figura 7. Cepa de Saccharomyces de lacto suero spp en medio de cultivo PDA

Cabe considerar que despus del proceso para obtener productos derivados de
la leche, y que dan origen al suero lcteo, ste todava conserva el 55% de sus
componentes innatos, tales como: lactosa, calcio, sales minerales y protenas lacto-
sricas; que no reaccionan con el cuajo (Horwitz, 2007). La conservacin de estos
componentes en el lacto suero hacen que se garantice la supervivencia previendo de los
nutrientes y aminocidos necesarios para que los microorganismos eficientes puedan
realizar las actividades o procesos metablicos para obtener su fuente de carbono; tales
como fermentacin de lactosa, para el caso de Lactobacillus spp (Prez y Ramrez,
2007); nitrificacin, para Rhodopseudomona spp (Larimer et al., 2004); y glucolisis
para Saccharomyces spp (Cordell y McCarthy, 2013).

De manera similar, Sanchez et al., (2009), en su investigacin del aprovechamiento

del suero lcteo con microorganismos eficientes, inocularon Lactobacillus spp en la
matriz lctea; donde se evidencio el crecimiento eficiente de esta cepa, concluyendo que
la casena del suero lcteo provee su fuente de carbono para su supervivencia.
Comparando lo anterior con las observaciones de esta investigacin, se puede inferir las
protenas del suero lcteo si garantizan los nutrientes necesarios para que la cepa de
Lactobacillus spp pueda crecer.