PRCTICA DE LABORATORIO No.

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EXTRACCIN DE LPIDOS DE LA YEMA DE HUEVO

Carlos Alberto Coronado Pinilla Cdigo: 201313054 Ingeniera Qumica

Nicols Perilla Barbosa Cdigo: 201312912 Ingeniera Qumica
Profesor: Luis Eduardo Daz
Fecha: 29 de octubre de 2014

RESUMEN

Los lpidos son biomolculas caracterizadas por su insolubilidad en solventes polares,

especialmente el agua, sin embargo muchos tienen un carcter anftero. Estos
compuestos estn presentes en alimentos y son consumidos para aumentar las reservas
de energa. De acuerdo con lo anterior, en esta prctica se extrajeron tres lpidos de la
yema de huevo: triglicridos, colesterol y fosfolpidos. Para la extraccin de estos se
recurri a la tcnica de cromatografa en columna utilizando solventes de diferente
polaridad y las fracciones recogidas fueron corridas en la cromatografa de capa fina.

ABSTRACT

Lipids are biomolecules characterized by their insolubility in some polar solvents,

especially in water, nevertheless many have an amphoteric character. These compounds
are present in foods and are consumed to increase energy reserves. According to the
above, in practice three lipids were extracted egg yolk: triglycerides, cholesterol and
phospholipids. For the extraction of these column chromatography technique was used
through solvents of different polarity and the collected fractions were run on thin layer
chromatography.

Palabras clave: Colesterol, cromatografa, fosfolpidos, triglicridos, polaridad.

OBJETIVOS

Extraccin de tres lpidos presentes en la yema de huevo a travs de

cromatografa en columna
Caracterizacin de los lpidos mediante la cromatografa en capa fina y
comparacin con muestras de aceite de pescado y lecitina de soya.

INTRODUCCIN calidad-precio y ser ingrediente bsico y

El huevo es un ingrediente habitual en la
alimentacin del hombre desde su
origen. Se caracteriza por su alta
densidad nutritiva, una excelente relacin
verstil a nivel culinario. Un huevo est
formado, bsicamente, por una yema
central (31%) rodeada por el albumen o
clara (58%) y todo ello envuelto por una
cscara externa (11%). El huevo tiene

1
unos contenidos moderados en caloras
y cidos grasos (AG) saturados.
El huevo contiene aproximadamente un
11% de fraccin grasa (6 g por huevo de
60 g) depositada exclusivamente en la
yema. De la cual un 66 % son
triglicridos, un 28% son fosfolpidos y un
5 % colesterol. Es remarcable el alto
nivel de fosfolpidos del huevo que
representan, aproximadamente, 2 g por
huevo y destaca la presencia de
fosfatidilcolina o lecitina. Las vitaminas
liposolubles y los carotenoides forman
parte de un 1 % de los lpidos de la
yema. En cuanto al colesterol, el
contenido medio es de 385 mg por 100 g
de huevo entero (210 mg en un huevo de
unos 60g) y est depositado en la yema
(Barroeta A., 1993).
Los lpidos biolgicos son un grupo de
compuestos qumicos muy diversos cuya
su caracterstica principal, no se cumple
en todos los lpidos, es su insolubilidad
en agua y pueden ser extrados por
solventes apolares (Nelson & Cox, 2005,
pg. 343).
Sus funciones biolgicas son tan
variadas como su qumica; los
fosfolpidos y esteroles son
principalmente elementos estructurales
de membranas. Otros lpidos tienen un
rol importante como cofactores
enzimticos, portadores de electrones,
pigmentos absorbentes de luz, anclas
hidrofbicas para protenas,
chaperones que ayudan a doblar
protenas en la membrana y hormonas
Las grasas y los aceites usados como
forma de almacenamiento de energa en
seres vivos son derivados de cidos
2
grasos, los cuales provienen de fuentes
de carbono e hidrgeno.
Un compuesto anfiptico contiene
regiones polares y regiones no polares.
Cuando una molcula de dicho
compuesto es mezclada con agua, un
solvente polar, la regin hidroflica
interacta favorablemente con el
solvente y tiende a disolverse en el agua.
Por otro lado las regiones apolares se
disuelven fcilmente en disolventes de
polaridad parecida (Nelson & Cox, 2005,
pgs. 52-53). Los compuestos lipdicos
que se determinaran en la yema de
huevo son:
Fosfolpidos: Son los componentes
principales de las membranas biolgicas.
Su caracterstica comn es que
contienen un resto de cido fosfrico
esterificado con el grupo Sn-C-3 del
glicerol. Debido a la presencia del
residuo fosfatidato, a pH neutro los
fosfolpidos tienen una carga negativa.
Imagen tomada de: http://1.bp.blogspot.com/-
dvQZ7zVXSAo/UHoTF7KdHPI/AAAAAAAAKG4/y7BObGxDD44/
s640/fosfolipidos.gif
Triglicridos:
Los triglicridos son los constituyentes
principales de los aceites vegetales y las
grasas animales. Los triglicridos tienen
densidades ms bajas que el agua
(flotan sobre el agua), y pueden ser
slidos o lquidos a la temperatura
normal del ambiente. Cuando son slidos
se llaman "grasas", y cuando son
lquidos se llaman "aceites". Un
triglicrido, tambin llamado
triacilglicrido, es un compuesto qumico
que consiste de una molcula de glicerol
y tres cidos grasos (Zamora, Antonio.
Scientific physic, 2014).
Imagen tomada de:http://salud-gratis.info/blog/wp-
content/uploads/2011/07/trigliceridos-tratamiento.jpg
Colesterol:
El colesterol es un alcohol que se
clasifica como esteroide, grupo que se
encuentra formado por compuestos
caracterizados por poseer una estructura
molecular formada por cuatro ciclos que
se encuentran condensados.
El colesterol es una molcula de lpido
que se encuentra en los tejidos y en el
plasma sanguneo del cuerpo, tanto de
seres vertebrados como invertebrados.
Las concentraciones ms altas de esta
molcula se encuentran en rganos
como el hgado, cerebro, glndulas
adrenales, medula espinal, la piel, etc.
En la molcula de colesterol podemos
hacer referencia a una cabeza polar,
formada por un grupo hidroxilo y una cola
de tipo apolar que se encuentra formada
por un ciclo de carbono con ncleos
condensados y sustituyentes de tipos
alifticos. De esta manera, podemos
decir que el colesterol es una molcula
hidrofbica, y bastante soluble en
3
disolventes de tipo apolar como puede
ser por ejemplo, el cloroformo. En
definitiva, el colesterol est formado por
un centro, o ncleo de anillos
bencnicos, una cadena de tipo aliftica
larga, radicales metilo, y un grupo OH,
el cual es fundamental para formar la
parte hidrfila de la molcula de
colesterol.
Imagen tomada de:
http://4.bp.blogspot.com/_axdsOlk2nRA/SwoTIBsfYBI/AAAAA
AAAABA/Jz5rSTrFn3Q/s1600/colesterol.png
Para la caracterizacin de los lpidos
utilizaremos la lecitina de soya y aceite
de pescado.
Lecitina: Es un fosfolpido, tambin
conocido como fosfatildicolina. La lecitina
puede encontrarse en gran
concentracin en la soya y en la yema de
huevo. Aunque la lecitina es una
sustancia grasa, acta como agente
emulgente, contribuyendo a la
descomposicin de las grasas y el
colesterol.
Imagen tomada de: http://www.plantascurativas.net/wp-
content/uploads/2013/05/s2.gif
Aceite de pescado: Los lpidos presentes
en las especies de peces seos pueden
ser divididos en dos grandes grupos: los
fosfolpidos y los triglicridos. El Aceite
de Pescado es una sustancia compuesta
por cidos grasos esenciales
poliinsaturados, entre los que destaca
el Omega 3. Este aceite posee
escualeno y otros esteroles que ofrecen
beneficios para la salud tales como:
acciones antioxidantes
cardioprotectoras
Imagen tomada de:
http://www.naturallya.com/docs/images/6_a.jpg
Como se mencion anteriormente los
tres lpidos (colesterol, triglicridos y
fosfolpidos) se extraern y se
determinaran por 3 mtodos los cuales
son: Extraccin, Cromatografa en
columna (CC) y Cromatografa capa fina
(CCF) los cuales se conceptualizaran a
continuacin.
Extraccin:
La extraccin con disolventes es la
tcnica de separacin de un compuesto
a partir de una mezcla slida o lquida,
aprovechando las diferencias de
solubilidad de los componentes de la
mezcla en un disolvente adecuado.
Constituye una de las tcnicas de
separacin de compuestos ms utilizada
en el laboratorio qumico. El principal
objetivo de la extraccin es separar
selectivamente el producto de una
reaccin, o bien eliminar las impurezas
que lo acompaan en la mezcla de
reaccin, gracias a sus diferencias de
solubilidad en el disolvente de extraccin
elegido.
Cromatografa en columna (CC): El
principal objetivo de la extraccin es
separar selectivamente el producto de
una reaccin, o bien eliminar las
impurezas que lo acompaan en la
mezcla de reaccin, gracias a sus
diferencias de solubilidad en el disolvente
y
de extraccin elegido.
Cromatografa capa fina (CCF): El
principal objetivo de la extraccin es
separar selectivamente el producto de
una reaccin, o bien eliminar las
impurezas que lo acompaan en la
mezcla de reaccin, gracias a sus
diferencias de solubilidad en el disolvente
de extraccin elegido.
Para revelar el TCL se utiliz una
solucin de sulfato de amonio al 20% por
aspersin
MATERIALES
Solucin NaCl 1 M, ter etlico, metanol /
cloroformo (2: 1 en volumen), 5% de
metanol en cloroformo, 9: 1 de ter de
petrleo y ter etlico, cloroformo /
metanol / agua (1: 3: 1 en volumen),
cloroformo, columna empacada con 2ml
de slice gel en 4 ml de ter de petrleo,
ter de petrleo / ter etlico / cido
actico (75: 25: 1 en volumen),
cloroformo / metanol / cido actico
(65:25:10 en volumen), sulfato de amonio
al 20%, pipeta Pasteur o gotero, tubos de
centrifuga con tapa rosca de 15 ml.,
placas slice gel, lecitina de soya, aceite
4
de pescado, capilares, micropipetas de 1
mL, centrfuga, plancha de
calentamiento, vrtex, pipetas de 5 y 10
mL, rota evaporador, crisoles, balanza
analtica, cmara de extraccin, papel
aluminio, pinzas, probetas de 10 mL.
Metodologa
Para esta prctica, como se mencionaba
en el marco terico se utilizaron 3
mtodos de separacin los cuales
fueron: extraccin, separacin por
columna y cromatografa en capa fina.
Esto con el fin de extraer las 3 grupos
importantes de los lpidos que se
encuentran en la yema de huevo
utilizando como solvente metanol y
cloroformo, separar fracciones de lpidos
como triglicridos, colesterol
fosfolpidos por medio de
(cromatografa en columna) con una
columna de gel slice y finalmente
analizarlas por medio de
(cromatografa capa fina).
Para realizar las extracciones
mencionadas anteriormente se deben
preparar una dispersin de yema de
huevo el cual se debe diluir la yema de
huevo y agregar NaCl 1M hasta
completar 80 mL, se mezcla bien y se
extraen 3 mL de la mezcla,
posteriormente se adicionan 190 mL de
ter etlico. Se centrifugo a 8000 rpm por
30 minutos hasta lograr dos fases
lquidas, con una fase intermedia
delgada de material insoluble y se
transfiri la fase superior amarilla al
baln del rota evaporador. El ter etlico
de la fase orgnica se retira por
evaporacin rotatoria y los lpidos
concentrados se dispersan en el mismo
volumen de 60 ml de 1 M NaCl
empleado inicialmente y se mezcla con
los 3 ml tomados de la dilucin inicial. Lo
anterior puede ayudar a estabilizar la
dispersin ya que contiene protenas,
pero mucho menos de protenas de la
que inicialmente tendra si se toma la
yema de huevo directamente,
favoreciendo as una posterior extraccin
de lpidos.
Extraccin de lpidos
Con la dispersin de lpidos de la yema
de huevo en NaCl 1 M se mezclan 0,8 ml
de esta dispersin con 3 ml de
metanol/cloroformo (2:1) en un tubo de
centrifuga de 15 ml con un tapn de
rosca. Despus de agitar el tubo, aadir
1 ml de NaCl 1 M y cloroformo. El tubo
se tapa y se agita, luego se centrifuga
brevemente para separar las fases.
y
Despus de retirar se desecha la fase
CC
superior acuosa, se pasa la fase inferior
a un crisol previamente pesado,
guardando 100 L en un tubo de micro
CCF
centrfuga (solucin A), de los cuales 5
L se aplican a las placas de TLC
(abajo). El disolvente de la solucin
presente en el crisol se elimina en la
cmara de extraccin con ayuda de un
calentamiento suave. Cuando el residuo
est seco se pesa el crisol. El residuo es
el conjunto total de lpidos.
Cromatografa en columna
Para separar las distintas fracciones de
lpidos, se prepara una pequea columna
empacada con 2 mL de slice gel en 4
mL de ter de petrleo en una jeringa
con tapn de lana de vidrio en la parte
inferior. Se disuelve el residuo extraccin
anterior en 2 ml de ter de petrleo y se
vierte en la columna, guardando lo que
sale inicialmente (solucin que contiene
algunas de triglicridos) en un tubo
previamente pesado. Para completar la
5
elucin de los triglicridos, se adicionan a
la columna 9 ml de una mezcla 9: 1 de
ter de petrleo y ter etlico, recogiendo
el eluido en el mismo tubo anterior. El
colesterol se eluye entonces en otro tubo
previamente pesado usando 9 ml de 5%
de metanol en cloroformo. Finalmente,
para eluir por completo los fosfolpidos,
se adicionan 9 ml de cloroformo /
metanol / agua (1: 3: 1 en volumen) y se
recoge en un tubo con tapa. A este tubo
agregar 2 ml de cloroformo y 2 ml de 1 M
NaCl para romper fases y deshacerse del
agua (fase superior acuosa); la fase
inferior orgnica se retira a un tubo limpio
previamente pesado.
10 L de los eluidos de triglicridos son
la solucin B.
10 L de los eluidos de colesterol son la
Solucin C.
5 L de los eluidos de fosfolpidos son la
Solucin D.
Estos se aplican a las placas de TLC
para CCF. Despus los disolventes de
los eluidos se eliminan transfiriendo las
soluciones B a D a crisoles secando con
calentamiento suave en la cmara de
extraccin para luego pesar.
DATOS
Tabla No. 1. Datos de pesos de los
lpidos aislados durante la
cromatografa.
6
Cromatografa en capa fina
Se tienen dos placas de TLC (4x10 cm)
por grupo (Merck Slice Gel 60), y se
aplican en cada placa las soluciones de
A a D con ayuda de los capilares en la
parte inferior de cada placa, junto con 5
L de lecitina de soya y 5 L de aceite
de pescado (de los que se comercializan
encapsulados como suplemento
alimenticio). Se desarrollan las placas en
vasos de precipitados de 400 mL
cubiertos con papel de aluminio que
contienen 10 ml de mezclas de
disolventes cloroformo / metanol / cido
actico (65:25:10 en volumen). La corrida
se realiza hasta que la mezcla solvente
alcance el 90% de la altura de la placa.
Se deja retira la placa de los beakers y
se deja evaporar la mezcla solvente. Los
spots se revelan por aspersin, adicin
con gotero o pipeta Pasteur de sulfato de
amonio al 20% sobre las placas, se retira
el exceso de la solucin de sulfato de
amonio en caso de quedar muy
empapada la placa, y luego se calienta
durante un corto tiempo en una plancha
de calentamiento a una temperatura no
muy elevada.
Para los resultados obtenidos en la placa
de TLC se hayo el respectivo rf (factor de
retencin) con la siguiente formula:
()
=
( )
RESULTADOS

Tabla No. 2. Factor de retencin de las

muestras en la cromatografa en capa
fina.

Imgenes cromatografa en capa fina:

Nota: Nuestra placa la corrimos pero la

no tomamos foto despus de ser
revelada, sin embargo calculamos los rf
directamente sobre la placa.

ANLISIS

De acuerdo a los resultados anexados en

la tabla 1 de los pesos obtenidos de los
lpidos extrados nos podemos dar
cuenta de que se obtuvieron ms
fosfolpidos que los dems, esto no era
de esperarse debido a que segn la
literatura representa una cantidad grande
pero no la mayor parte de la grasa total
de la yema (2 g) debido a que los

7
triglicridos son los que tienen mayor
presencia en el huevo, sin embargo el
resultado que obtuvimos fue bajo
comparndolo con el de literatura, esto
pudo deberse a que alguna parte de los
fosfolpidos pudo ser arrastrados cuando
se extrajeron las fracciones para
colesterol y triglicridos debido a que al
hacer las mezclas de solventes de fase
mvil tambin se agregaron sustancias
tanto polares como apolares y como los
fosfolpidos tienen tanto como un
extremo polar como apolar esto sustenta
la explicacin anterior y produce que se
pierda una cantidad considerable de este
lpido.
Para el colesterol pudo haber ocurrido lo
mismo debido a que como el fosfolpido
tiene tambin una parte polar por el
grupo hidroxilo y apolar por el grupo
carbonado del otro extremo y al realizar
la extraccin de triglicridos que fue la
primera, una parte del colesterol se pudo
ir junta con los triglicridos, segn la
literatura en un huevo comn de 60 g hay
210 mg de colesterol al compararlo con
el resultado obtenido podemos darnos
cuenta que perdimos una cantidad
prxima a la mitad del colesterol que
debamos encontrar, pero debido a que
no sabemos los datos exactos del huevo
utilizado en la prctica no se puede hacer
una correcta aproximacin a los
resultados.
Para los triglicridos se esper que el
resultado sea el ms exacto y el ms
alto debido a que es la primera
extraccin y es poco probable que se
haya ido parte hacia otra fraccin, pero
cuando lo comparamos con los
resultados de los lpidos y contra la
literatura nos damos cuenta que; primero
no es el peso ms alto de lpidos
8
encontrados a pesar de que constituyen
cerca del 66% de las grasas encontradas
en el huevo y segundo el dato esperado
debera aproximarse a 6 g y resulto ser el
dato ms alejado, esto pudo haber
ocurrido debido a que en los
procedimientos anteriores se
desechaban las fases superiores, ah
pudo haber ocurrido la mayor prdida de
este lpido, ya que es una perdida muy
grande casi del 80% aproximadamente.
Todo esto se compar con el artculo El
huevo y sus componentes como alimento
funcional de A.C. Barroeta.
Podemos observar que la sustancia con
mayor distancia recorrida fue el aceite de
pescado, debido a que la molculas del
omega 3 y 6 presentan una larga cadena
que distribuye la carga del grupo
carboxilo a lo largo de ella. Por otro lado,
el resultado de la lecitina de soya fue
similar a uno de los sustratos separados
de las soluciones C y D, correspondiendo
a la de colesterol y fosfolpidos
respectivamente; debido a que es un
fosfolpido concuerda con su homlogo
D. No obstante, la cromatografa en
columna no fue efectiva pues se obtuvo
una separacin inefectiva donde se
puede ver que el colesterol tambin pas
a la solucin D.
CONCLUSIONES
El proceso de extraccin por
cromatografa en columna fue poco
efectivo debido a que al comparar lo
obtenido con la literatura el resultado
vara mucho a lo que debera
aproximarse dando un dato muy
pequeo.
Es recomendable cambiar la proporcin
de solventes debido a que estas no
fueron efectivas para una ptima
extraccin.
En la cromatografa de capa fina se
obtuvo un comportamiento esperado
debido a la polaridad de las molculas de
los lpidos.
BIBLIOGRAFA
Nelson, D., & Cox, M. (2005). Lipids. En
D. Nelson, & M. Cox, Lehninger
Principles of biochemistry (pg.
343). New York: W. H. Freeman
and Company.
Raheja R.K., Charanjit Kaur, Ajit Singh,
I.S. Bathia. New colorimetric method for
the quantitative estimation of
phospholipids without acid digestin.
Journal lipid research. ASBMB.
Department of Chemistry and
Biochemistry, Punjab Agriculture
University, Ludhiana 2004, India.
A.C. Barroeta. El huevo y sus
componentes como alimento funcional.
Departament de Cincia Animal i dels
Aliments. Universitat Autnoma de
Barcelona. 1993. Bellaterra, Barcelona.
Takehiko Yamamoto, Lekh Raj Juneja,
Hajime Hatta, Mujo Kim. Hen Eggs: Basic
and Applied Science. Pags 73-83. CRC
press LLC. 1997. Link:
(http://books.google.com.br/books?hl=es
&lr=&id=fLmAYGxmTfIC&oi=fnd&pg=PA
73&dq=egg+yolk+lipids&ots=NzvmNYSh
SJ&sig=A-
JA53iadVWsrfU4GKiLfKUfuVs#v=onepa
ge&q=egg%20yolk%20lipids&f=false)
Jan Koolman, Klaus-Heinrich Rhm.
Bioquimica: Texto y atlas. Pags 46-50.
Panamericana. 2004. Link:
(http://books.google.com.br/books?id=f61
Mvd-
vl60C&pg=PA46&dq=lipidos&hl=es&sa=
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