Proyecto de Biofsica

ADN: Extraccin y Electroforesis

Introduccin
Extraccin de ADN
El ADN genmico puede ser
aislado de clulas por la ruptura del
tejido y entonces explotar las
diferencias en las propiedades entre
el ADN, las protenas y otros
constituyentes. Se ha podido extraer
ADN empleando su: insolubilidad en
soluciones diluidas de NaCl,
solubilidad en soluciones
concentradas de NaCl, insolubilidad
en alcohol, y puede disociarse de las
protenas por tratamiento con fenol
y/o detergentes.
Un problema encontrado
durante la manipulacin descrito
abajo, es que el ADN es
inevitablemente esquilado (cortado),
lo cual no es sorprendente considerar
que los cromosomas, en los cuales
esta contenido el ADN, varan en
tamao de 0.3 a 200 pares de
megabases. El cuidadoso manejo de
la muestra es requerido a lo largo del
proceso. Cuando el ADN es
precipitado con etanol, este debe
estar a 20 C para evitar el
esquilado. El ADN precipitado puede
entonces ser enrollado de la solucin
usando una varilla de vidrio; en
teora, la recoleccin por
centrifugacin puede causar
contaminacin al co-sedimentar con
la muestra.
Electroforesis de cidos nucleicos en
geles de agarosa
Las tcnicas de zona son las
formas ms frecuentemente usadas
de electroforesis e involucra la
aplicacin de una muestra en una
zona pequea para un rea
relativamente grande de medio inerte,
el cual permite la deteccin
subsecuente de las zonas de muestra
separadas.
La electroforesis por medio de
geles de poliacrilamida o agarosa es
el mtodo estndar usado para
separar, identificar y purificar
fragmentos de ADN. La tcnica es
simple, rpida de realizar y capaz de
resolver fragmentos de ADN que no
puedan ser separados
adecuadamente por otros
procedimientos, tales como
centrifugacin de gradiente de
densidad. Adems, la localizacin de
ADN dentro del gel puede ser
determinada directamente por tincin
con bajas concentraciones de un
agente intercalante fluorescente:
bromuro de etidio; las bandas que
contienen tan poco como 1-10 ng de
ADN pueden ser detectados por la
examinacin directa del gel con
radiacin ultravioleta.
Los geles de agarosa y
poliacrilamida pueden ser vertidos en
una variedad de formas, tamaos y
porosidades, y pueden ser corridos
en un nmero de configuraciones
diferentes. La eleccin con estos
parmetros depende principalmente
del tamao de los fragmentos a ser
separados.
Los geles de agarosa son hoy
en da los medios ms populares
para la rutinaria separacin
electrofortica de cidos nucleicos de
tamao medio y grande.
Antecedentes
Por qu estudiar los cidos
nucleicos?
La herencia es un fenmeno
discernible para cualquier observador,
pero su base qumico-biolgico no fue
disertado hasta pocas recientes.
Aunque desde principios de siglo se
estudiaban preparaciones biolgicas
con la idea de identificar sustancias
responsables de sus significantes
cualidades, no fue sino hasta 1944
que los investigadores Oswald Avery,
Colin McLeod y Maclyn McCarty
sugirieron, cautelosamente que el
material hereditario podra estar
contenido en el cido nucleico del tipo
desoxirribosa.
Durante los siguientes aos,
trabajando con sistemas de
separacin y anlisis, los
investigadores del campo de la
gentica bioqumica demostraron, de
manera inequvoca, que el cido
nucleico es el material hereditario.
En 1953, James Watson y
Francis Crick dedujeron la estructura
tridimensional del ADN e El grupo fosfato de cada uno
inmediatamente interpretaron su
mecanismo de replicacin. Este
descubrimiento ha sido uno de los
ms significativos en la historia de la
biologa.
Para entender su funcin
biolgica, debemos conocer sus
caractersticas estructurales (vase
diapositiva 1).
El cido desoxirribonucleico
(ADN), es un polmero lineal, muy
largo de aspecto filamentoso y
construido por unidades
monomricas, los
desoxirribonucletidos, cada uno de
ellos compuesto por una base
nitrogenada, un azcar
(desoxirribosa) y un grupo fosfato.
Las bases nitrogenadas de las
molculas de ADN son las portadoras
de la informacin gentica, en tanto
que los grupos de azcar y fosfato
tienen un papel estructural. La doble
hlice del ADN forma una hlice que
gira hacia la derecha (la doble hlice)
en la cual una vuelta completa ocurre
cada 10 pares de bases.
Las dos cadenas de
azcarfosfato del esqueleto de la
hlice (las cuales son antiparalelas) y
las pares de bases (planares) estn
apilados dentro de la estructura. La
hlice esta estabilizado por
interacciones hidrofbicas entre las
bases apiladas y por la neutralizacin
de las cargas en los grupos fosfato
(p. ej. por iones metlicos divalentes,
o poliaminas en bacterias, o por
protenas cargadas positivamente
histonas en eucariontes las cuales
neutralizan la acidez del ADN) (vase
diapositiva 2).
de los nucletidos esta adyacente al
azcar en la posicin nmero 5 de su
carbono. El trmino cido agregado
a estas sustancias fue derivado de la
representacin comn de los grupos
fosfato por tener un ion hidrgeno
disociable (PO4H+). El grupo fosfato
es responsable por la fuerte carga
negativa de los cidos nucleicos.
(vase diapositiva 3)
En los organismos el ADN esta
empaquetado en formas
ordenadamente superiores.
Dependiendo del nivel de evolucin
del organismo, la longitud del ADN
total contenido vara desde
micrmetros a varios centmetros. El
ADN esta reunido en simples
cpsides de virus, en clulas
procariticas, o en los ncleos de
clulas eucariontes.
 En numerosos estudios se ha manufacturador. Estas diferencias
demostrado que, el ADN de doble pueden afectar tanto la migracin del
cadena no es una molcula ADN como la capacidad de
semejante a una varilla perfecta a recuperacin del ADN a partir del gel.
grandes pesos moleculares. En
cambio, la molcula se comporta La agarosa se funde cuando
como una cadena rgida, semejante a se calienta a 100 C y s re-solidifica
un gusano. Esto quiere decir que a cuando se enfra aproximadamente
longitudes cortas es semejante a una por debajo de los 50 C. Cuando se
varilla, pero a longitudes (contornos) solidifica, la agarosa forma una
mayores, la cadena se curvea y dobla matriz. El tamao de los poros puede
gradualmente en direcciones ser variado usando diferentes
arbitrarias. concentraciones de agarosa: a mayor
concentracin de agarosa, menor el
Por qu electroforesis con gel de tamao del poro. Algunas tiles
Agarosa? concentraciones de agarosa para la
La agarosa es un polisacrido separacin de fragmentos de ADN se
de la D-galactosa y 3,6-anhidro L- muestran enseguida (Tabla 1).
galactosa derivada del agar sin carga,
el cual es extrado del alga marina, es Por consiguiente, un fragmento
un polmero lineal cuya estructura de ADN lineal de un tamao dado
bsica es: migra a tasas diferentes a travs de
OH O geles que contengan diferentes
CH OH
O concentraciones de agarosa. Hay una
O O HO O
relacin lineal entre el logaritmo de la
OH O movilidad electrofortica del ADN ()
y la concentracin del gel (), el cual
La agarosa comercialmente es descrito por la siguiente ecuacin:
disponible no es completamente pura;
esta contaminado con otros log = log 0 Kr
polisacridos, sales y protenas. donde 0 es la movilidad libre del ADN
y Kr es el coeficiente de retraso, una
La cantidad de contaminantes constante que esta relacionada a las
vara de mezcla a mezcla de agarosa propiedades del gel y el tamao y
y, de manufacturador a forma de las molculas que migran.
Tabla 1. Rango de separacin en geles conteniendo diferentes cantidades de agarosa
Cantidad de agarosa en gel
(% w / v)
0.3 %
0.6 %
0.7 %
0.9 %
Los geles de agarosa tienen un
poder de resolucin bajo con
respecto a los geles de
poliacrilamida, pero tienen un rango
superior de separacin. ADNs desde
200 pb hasta aproximadamente 50 kb
de longitud pueden ser separados en
geles de agarosa de varias
concentraciones. Los geles de
agarosa son usualmente corridos en
cajas electroforticas de
configuracin horizontal, en un campo
elctrico de constante fuerza y
direccin. ADNs mayores, superiores
de 10,000 kb de longitud, pueden ser
separados por electroforesis en gel
de campo pulsado, en la cual la
direccin del flujo elctrico es
cambiada peridicamente.
Factores bsicos que influencian
la movilidad electrofortica:
Durante la electroforesis la
fuerza manejada sobre una partcula
es determinada por la carga en la
partcula y el gradiente de potencial
(voltaje). A velocidad constante este
es balanceado por la resistencia de
friccin del medio y en la solucin
libre, la Ley de Stokes, es obedecida.
Sin embargo, en un gel como medio,
la Ley de Stokes no es estrictamente
obedecida y la resistencia de friccin
es entonces influenciada por un
nmero de factores, no solo la
viscosidad del solvente, sino tambin
la densidad del gel, el tamao del
poro y, la forma y el tamao de la
Rango eficiente de separacin de
fragmentos de ADN lineal (kb)
5 - 60
1 20
0.8 10
0.5 - 7
partcula. Para una macromolcula
biolgica grande, es la carga neta
sobre la molcula la cual es
importante, as que para una
molcula tal como una protena la
cual posee muchos grupos ionizables
diferentes con diferentes valores de
pK, carga y por lo tanto movilidad
electrofortica, esta fuertemente
dependiente del pH, pero esto es
menos cierto para cidos nucleicos
donde muchos grupos ionizables
tienen valores de pK muy similares.
La fuerza inica del medio determina
el potencial electrocintico, el cual
reduce la carga neta en la molcula
para la carga efectiva y en la prctica
se encuentra que la movilidad de la
molcula es aproximadamente
inversamente proporcional a la raz
cuadrada de la fuerza inica. La baja
fuerza inica resulta en una alta
movilidad electrofortica pero las
zonas ms definidas son obtenidas
en buffer de alta fuerza inica. La
fuerza inica ms alta, la
conductividad ms intensa y puesto
que la cantidad de calor generado es
proporcional al flujo de corriente, a
menos que el aparato este enfriado
constantemente, la temperatura se
incrementar. Este cambio
incrementa la tasa de difusin,
provocando un incremento en la
movilidad inica (ascendiendo a
cerca de 2.4% por grado Centgrado)
y resulta en una cada de la
viscosidad del medio.
 En el caso de los cidos
nucleicos, el tamao es el factor
principal el cual determina la
composicin escogida para la matriz
del gel, siendo el tamao del poro del
gel de gran importancia (Tabla 1).
Los oligonucletidos pequeos, los
fragmentos de restriccin y especies
Separacin de fragmentos de ADN
Los fragmentos de ADN tienen
una tasa constante de carga/longitud,
debido a la carga neta negativa del
esqueleto de fosfato. Por lo tanto, el
ADN migra hacia el electrodo positivo
(nodo). La movilidad electrofortica
durante la electroforesis depende
principalmente de los siguientes
parmetros (Tabla 2).
La naturaleza de la carga elctrica
determinara la direccin de
migracin. Mientras, la magnitud
de la carga, determinara la
velocidad relativa.
La carga aunque inicialmente
debido a los efectos de ionizacin
mediada por el pH del
amortiguador (o solucin con
sales), ser apreciablemente
modificada por otras
caractersticas de la composicin
del amortiguador.
La superficie cargada de una
partcula cargada en suspensin
esta rodeada por una capa de
iones opuestamente cargados,
provenientes de la solucin.
Hay una capa fija e inmvil de
iones absorbidos sobre la
superficie y,
Una capa mvil y difusa la cual
se hace ms mvil conforme la
distancia desde la superficie
del coloide se incrementa.
pequeas de ADN y ARN son
usualmente examinados en geles de
poliacrilamida, mientras que los geles
de agarosa son universalmente
empleados para los cidos nucleicos
grandes.
La carga desarrollada por la
molcula es debida a su naturaleza
qumica y al pH del amortiguador, y
es conocido como el potencial
electroqumico. En la prctica, este es
reducido cuando la concentracin de
sal es incrementada, debido al efecto
de neutralizacin parcial de la capa
absorbida de iones. La carga
resultante neta es conocida como el
potencial zeta y es el factor
determinante en la movilidad
electrofortica. El efecto combinado
de la capa fija y mvil de iones
tambin incrementa el tamao de la
partcula y reduce an ms su
movilidad.
La movilidad electrofortica de
un ion esta relacionado inversamente
a la fuerza inica del amortiguador en
lugar de su concentracin molar. La
fuerza inica de un amortiguador es
la mitad de la suma del producto de la
concentracin molar y el cuadrado de
la valencia de todos los iones
presentes en la solucin. El factor de
un medio es necesario porque solo la
mitad de los iones totales presentes
en el amortiguador tienen una carga
opuesta al del coloide y son capaces
de modificar su carga.
1
ct 2
2
La tasa de movimiento de una
partcula cargada esta tambin
relacionada al gradiente de voltaje
aplicado a travs del medio de
separacin, el cual es indicado en
volts por centmetro (la distancia
entre los electrodos). La corriente
genera calor, la cual es causa de un
incremento en la conductividad de la
solucin electroltica y esto promueve
el incremento de la corriente. Esta
elevacin en la temperatura causar
algo de evaporacin del amortiguador
en el cual contuvo cantidades
pequeas en el medio de separacin
resultando en un incremento en su
concentracin. Esto afectar el
potencial zeta del coloide y la
conductividad del amortiguador. Por
causa de estos efectos es necesario
controlar la temperatura del sistema
de algn modo y seleccionar entre el
Tabla 2. Factores principales que afectan la tasa de migracin del ADN en geles de agarosa
Factores Principales
1. Tamao molecular del ADN
2. Concentracin de agarosa
3. Concentracin de ADN
4. Voltaje aplicado
5. Direccin del campo aplicado
6. Composicin de bases y temperatura
7. Composicin del amortiguador de electroforesis
8. Presencia de agentes intercalantes*
*Factor a considerar solo con el uso de agentes intercalantes durante la preparacin del gel.
Corriente, Voltaje y Potencia
Durante la electroforesis, la
corriente (medido en miliamperes), el
voltaje (medido en volts), o la
potencia (medido en watts) se lleva a
cabo de manera constante.
Usualmente la resistencia de la
agarosa se incrementa durante un
corrimiento en gel. Cuando corre a
corriente constante, el voltaje se
incrementa en compense para el
incremento en resistencia. Esto
resulta en un incremento en la
potencia producida por el sistema,
causando calentamiento al gel. Si el
uso de un voltaje fijo o una corriente
fija.
Un problema adicional con
algunos medios de separacin es el
fenmeno de electroendosmosis en el
cual, el mismo amortiguador se
mueve debido a un efecto
electrofortico y por lo tanto oculta el
movimiento de los solutos hasta
cierto punto. La electroendosmosis es
causada por la presencia de grupos
cargados sobre la superficie de algn
medio de separacin y estos inducen
una carga opuesta en la solucin
amortiguadora.
gel se calienta demasiado, las
bandas pueden ser distorsionadas.
La fuerza del campo elctrico
depende en el voltaje y la longitud del
gel. A voltajes bajos, la tasa de
migracin del ADN lineal es
directamente proporcional al voltaje
aplicado.
Tipos de interaccin reversible
Los cidos nucleicos
interactan con un rango amplio de
especies qumicas que incluye el
agua, iones metlicos y sus
complejos, pequeas molculas
orgnicas, y protenas. Hay tres
maneras principales de interaccin,
los cuales son significativamente
diferentes (vase diapositiva 4):
(a) vinculado a lo largo del exterior
de la hlice a travs de
interacciones las cuales son
generalmente no especficos y
son electrostticos principalmente
en origen;
(b) interacciones vinculadas al surco
las cuales involucra interacciones
directas de la molcula unida con
la orilla de las pares de bases en
cualquiera de los surcos de los
cidos nucleicos; y
(c) la intercalacin de sistemas de
anillos aromticos planares o
aproximadamente planares entre
las pares de bases.
Los primeros dos modos de
unin no requieren un cambio
conformacional de los cidos
nucleicos, pero pueden inducir
transiciones estructurales en la
formacin de complejos. La
intercalacin requiere cambios en los
ngulos de torsin de la cadena
azcar-fosfato para la separacin de
pares de bases adyacentes para una
distancia (tpicamente cerca de 3.4 )
suficiente para permitir la insercin
del sistema de anillos intercalantes.
Esto puede estar acompaado por
otros cambios en los parmetros de
la hlice tales como desenrollado,
curveado, etc.
Interacciones Electrostticas
Externas
Los cidos nucleicos son
polielectroltos altamente cargados
cuyos grupos fosfato aninicos
afectan fuertemente su estructura e
interacciones. Se ha demostrado que
iones simples, tales como aquellos de
metales alcalinos, asociado con
cidos nucleicos en gran parte como
una funcin de la densidad de carga
del polmero. En el ADN-B, por
ejemplo, si la molcula es modelada
como una lnea de cargas igualmente
espaciadas hay una carga aninica
por 1.7 de distancia (dos cargas por
par de bases y aproximadamente
diez pares de bases por vuelta de la
doble hlice). Si el espacio de la
carga lineal es menor de 7
aproximadamente, la molcula se
hace inestable. La conformacin de
polmeros con carga que estn ms
estrechamente espaciadas, deben de
esta manera asociarse con
counteriones de la solucin para
alcanzar la estabilidad. La asociacin
de iones con los polielectroltos es
llamada condensacin de
counteriones y causa una condicin
de entropa desfavorable en la suma
de energa libre conformacional del
polmero en general. Esta condicin
desventajosa es ms de
consideracin ms que, por las
numerosas interacciones favorables
en el plegamiento del polmero (tal
como la doble hlice de ADN). Para
una conformacin especfica de cido
nucleico la densidad de carga y
tambin, la cantidad de counteriones
condensados es constante. Una
prediccin importante de la teora de
condensacin, la cual ha recibido
apoyo experimental, es que los
counteriones condensados por carga
de fosfato permanece constante,
mientras la concentracin de sal de la
solucin esta variando sobre un
rango bastante amplio.
La asociacin inicial de los
counteriones esta referida como una
condensacin, ya que los iones estn
asociados con la densidad de carga
general de los polielectroltos y no se
unen en sitios especficos, Los iones
retienen su esfera de agua interna de
hidratacin y se mueve rpidamente
a lo largo del esqueleto de azcar-
fosfato del ADN. Las capas de
hidratacin secundaria de ambas, el
polielectrolto y el counterion son
afectadas por esta interaccin. La
ecuacin de Poisson-Boltzmann,
aplicado a cidos nucleicos como
polianiones semejantes a una varilla,
predice un nmero similar de
counteriones fuertemente asociados.
S las cargas de los fosfatos del ADN
son eliminados, por ejemplo por
esterificacin de los grupos fosfato o
por sustitucin con la unin de
metiltransferasas, la molcula todava
puede formar una hlice doble
semejante a la forma B, pero como se
esperaba, no presenta la propiedades
dependientes de sal de ADN-B
normal. Con la estructura dplex de
forma B del ADN, la teora de
condensacin predice un promedio
de 0.76 counteriones monovalentes
(tales como Na+) condensados por
grupo fosfato y un total de 0.88
counteriones asociados por grupo
Tabla 3. Valores de pKa para las bases en nucletidos
Base (sitio de protonacin)
Adenina (N-1)
Citosina (N-3)
Guanina (N-7)
Guanina (N-1)
Timina (N-3)
Uracilo (N-3)
Estos datos se aproximaron a 20 C y concentracin cero de sal. Corresponden a prdida de un
protn para pKa > 9 y captura de un protn para pKa < 5.
Esta claro que todas las bases
estn sin carga en el rango fisiolgico
5< pH >9. Lo mismo es cierto para las
pentosas, donde la ribosa 2,3-diol
fosfato en condensacin adems las
interacciones del tipo Debye-Hckel.
La prediccin por otros mtodos
tericos llega a nmeros similares de
counteriones asociados.
Efecto del pH sobre las estructuras
de los polinucletidos
La razn de su carcter poli-
inico, es que los cidos nucleicos
son solubles en agua en cerca de 1
por ciento w/v de acuerdo al tamao y
son precipitados por la adicin de
alcohol. La solucin es totalmente
viscosa y los cidos nucleicos
grandes son fcilmente esquilados
por agitacin o pasndolo a travs de
una aguja fina.
El comportamiento cido-base
de un nucletido es su caracterstica
fsica ms importante. Ello determina
su carga, su estructura tautomrica, y
su capacidad de donar y aceptar
puentes de hidrgeno, la cual es la
caracterstica clave del
reconocimiento base:base. Los
valores de pKa para las cinco bases
en los principales nucletidos estn
enlistados enseguida (Tabla 3)
3-Nucletido 5-Nucletido
3.70 3.88
4.43 4.56
(3.5) (3.6)
9.84 10.00
--- 10.47
9.96 10.06
solo pierde un protn arriba de pH 12
mientras que los grupos hidrxilo
aislados ionizan solo arriba de pH 15.
Los fosfatos de nucletidos pierden
un protn a pH 1 y un segundo protn
(en el caso de monosteres) a pH 7.
Este patrn de equilibrio de protones
se muestra para AMP a travs de
todo el rango de pH (vase
diapositiva 5).
Objetivos:
Determinacin del comportamiento
del ADN durante el corrimiento
electrofortico en geles de agarosa,
sometindolo a 3 distintas soluciones:
TAE, TBE y NaOH, variando el pH de
dichas soluciones 8, 6 y 12,
respectivamente.
Determinacin cuantitativa de la
cantidad de ADN mediante el uso de
un marcador de peso molecular.
Hiptesis:
Al someter la muestra de ADN
extrado en tres soluciones diferentes
en concentracin y pH a
electroforesis, la migracin de la
muestra en las distintas soluciones va
a ser diferente. Ya que, a menor
concentracin de sal, la movilidad
electrofortica ser mayor con
respecto a las dems muestras
corridas en soluciones con mayor
concentracin de solutos disueltos.
Materiales y Mtodos

Extraccin de ADN

Material y Equipo
1 Rata cepa Wister 2 Pipetas de 5 ml y 1 Pipeta de 1 Estuche de diseccin
plstico
Agua destilada* 2 Vasos de precipitado (250 ml) 1 Mortero y pistilo
Etanol* 1 Varilla de vidrio 1 Centrifuga
Detergente lquido* 2 Probeta (50 y 100 ml) 1 Balanza
NaCl grado reactivo 2-12 Tubos para centrifugar 1 Refrigerador
*No se precisan cantidades, ya que se tendr en exceso (con respecto a lo que se utilizar) dicho material
para su incondicional disposicin. (vase Extraccin-Imgenes, imagen 1)

Procedimiento
1. Obtencin del hgado de la rata Busc y tom el hgado para efectuar la
extraccin, y se almacen otros tejidos (corazn,
msculo y rin) para una siguiente extraccin (en
caso de que no funcione la extraccin que se va a
efectuar).

2. Macerado del material (hgado) en el Durante el macerado se disgreg el tejido en

mortero. clulas, y a estas ltimas, se rompi su membrana
(vase Extraccin-Imgenes, imagen 2) celular para que queden expuestos los ncleos.

3. Adicionar 50 ml de agua destilada o Se aadi agua, hasta hacer una mezcla

embotellada. homogenea.
(vase Extraccin-Imgenes, imagen 3)

4. Colocar la mezcla en dos o ms tubos La centrifugacin permiti separar la fase acuosa

adecuados para centrifugar. (donde es soluble el ADN) y la fase orgnica
(donde hay tejido no disgregado, protenas y
restos celulares).

5. Centrifugar la mezcla (4500-5500 rpm, La centrifugacin a baja velocidad y poco tiempo,

durante 5 minutos). permiti obtener un ADN relativamente ms
integro.

6. Pipetear o decantar cuidadosamente la fase En esta fase se contena los fragmentos de ADN.
clara (acuosa) a un vaso de precipitado limpio Se evito tomar o decantar parte de la fase
y medir su volumen. orgnica.

7. Posteriormente adicionar un volumen igual La diferencia de concentracin de sales entre las

(con respecto a la muestra) de NaCl 2 M clulas y el medio acuoso es grande, lo que
(vase Extraccin-Imgenes, imagen 4) provoc el estallido de las clulas.
8. Adicionar un 1 ml de SDS 10%, mezclarlo Este paso permitir el aislamiento del ADN de las
(agitarlo vigorosamente) por lo menos 2 dems molculas.
minutos.
(vase Extraccin-Imgenes, imagen 5)

9. Usando 50 ml de etanol y con una pipeta, Generalmente se utilizan alcoholes para la

verterlo sobre la solucin de ADN. precipitacin de ADN. As que el alcohol permiti
(vase Extraccin-Imgenes, imagen 6) que pueda enrollarse el ADN a la varilla de vidrio
(en el paso siguiente), debido al cambio en la
concentracin de sales del medio, se adherir
entre s y a la varilla de vidrio.
10. Girar cuidadosamente (2 minutos) de un Esto permitir obtener (enrollado) al ADN en la
lado a otro la varilla de vidrio, justo debajo de varilla de vidrio, que tendr una consistencia
la frontera entre las dos fases. (vase viscosa y transparente.
Extraccin-Imgenes, imagen 7)

10-A. (alternativa) En caso de no lograr Es posible que el ADN durante el procedimiento

enrollar la hebra de ADN en la varilla, tomar de extraccin sea esquilado. Consecuentemente,
con la pipeta de plstico una alcuota de la solo habr fragmentos pequeos, los cuales son
interfase +. posibles de recolectar por medio de una pipeta y
almacenarlo en un tubo apropiado.

11. El ADN s resuspender en (100-200 l) El almacenamiento de ADN a 4 C merma la

agua destilada y almacenada a 4 C hasta su accin de las ADNasas. Se consider la utilizacin
utilizacin en un tubo de centrifuga ++. de EDTA (agente quelante) para el secuestro de
iones Mg++, cofactor utilizado por las ADNasas.
+
Considerar que al momento de la recoleccin de la muestra, este se encuentra en alcohol.
++
Para una visualizacin ms clara del ADN, se pueden usar algunos colorantes (p.ej. azul de metileno), los
cuales se unen a los fragmentos de ADN cargados.

(Para diagrama de flujo de la extraccin, vase Anexo 1)

Electroforesis de cidos nucleicos en geles de agarosa

Material y Equipo
Agua embotellada o destilada* 1 Micropipeta de 0.2-10 L
NaCl grado reactivo* 1 Caja de puntas para micropipeta
NaOH grado reactivo* 1 Vasos de precipitado**
Solucin TBE 10x (1 L) 1 Probeta**
Solucin TAE 10x (1 L) 1 Parrilla elctrica
Agarosa (40 gr) 1 Lmpara U.V.
1 Marcador de peso molecular (10 L) 1 pHmetro
Colorante de carga (50L) 1 Termmetro
Bromuro de etidio (1 L, 50 mg/ml) 1 Balanza**
1 Centrifuga**
Guantes de ltex (16 piezas) 1 Fuente de poder
1 Peine 1 Caja electrofortica
*No se precisan cantidades, ya que se tendr en exceso (con respecto a lo que se utilizar) dicho material
para su incondicional disposicin.
** Este equipo o material ya esta disponible.
Potente mutagnico, poco txico. Manejado solo por una persona autorizada del laboratorio.

Procedimiento
1. A) Material para la construccin de la fuente 1 Cable con clavija
de poder 2 Caimanes (pinzas)
B) Diseo de la fuente de poder 1 Transformador
(vase diapositiva 6) 1 Capacitor
4 Diodos rectificadores
1 Caja con switch y fusible
1 Tablilla para circuitos
1 Base de plstico
1 Cautin, soldadura de plomo-estao, etc.

2. A) Material de la caja electrofortica 2 Alambres de acero inoxidable

B) Diseo de la caja electrofortica 1 Caja plstico
(vase Diapositiva 7) Silicn

3. Preparacin de las soluciones para la Solucin amortiguadora TAE (pH 8): solucin
electroforesis: conductora baja en sales y amortiguadora de
Solucin TAE 1x: cambios en el pH de la solucin.
Tris-acetato 0.04 M
EDTA 0.001 M Solucin TBE: se preparar la solucin a pH 6
para tener condiciones cidas durante el
Solucin TBE 0.5x: corrimiento electrofortico.
Tris-borato 0.045 M
EDTA 0.001 M Solucin NaOH: Se prepar fresca para su
posterior utilizacin. La solucin se prepar a pH
Solucin NaOH 1x: alcalino para observar su efecto sobre la
NaOH 50mN muestra de ADN.
EDTA 1mM
Las soluciones no deben de incrementar
demasiado la concentracin de solutos
disueltos, evitando el sobre-calentamiento del
gel y su consecuente fundido.

4. Preparacin del gel de agarosa Se fundi 0.4 gr de agarosa en 25 ml de la

(vase Diapositiva 8 y 9) solucin amortiguadora (de acuerdo al ensayo),
para que tenga la misma fuerza inica y
determinada porosidad (concentracin del gel;
gel al 0.8 %).

5. Preparacin de la muestra a analizar Se prepar la muestra mezclndolo con un

(vase Diapositiva 10)
colorante de carga en gel. El colorante de carga
le dio a la muestra mayor densidad y adems
color, siendo posible observar tanto la
colocacin de la muestra en el pozo del gel,
como su migracin durante la electroforesis.

6. Colocacin de la muestra y del marcador de Utilizar una pipeta pasteur para colocar cada
referencia en un pozo dentro del gel de manera una de las muestras.
independiente.
7. Realizacin del corrimiento electrofortico
8. Medicin de temperatura y pH
9. Tincin con bromuro de etidio
10. Evaluacin cuantitativa
11. Evaluacin cualitativa
Para diagrama de flujo de electroforesis (vase Anexo 2).
Resultados
El procedimiento de extraccin se
efectu segn el protocolo. En la
solucin se generaron tres fases: fase
acuosa (alcohol), fase orgnica
(restos celulares y otras
biomolculas), y una interfase (cidos
nucleicos: ADN) (vase Diapositivas
13, 14 y 15).
La extraccin de ARN
probablemente fue efectuada, sin
embargo la inexorable contaminacin
con ARNasas, las cuales solo son
posibles de eliminar con sustancias
qumicas, degrad el ARN durante la
extraccin.
El ADN contenido en la interfase,
no logr ser enrollado con la varilla de
vidrio. Esto fue debido, a que la
molcula fue esquilada durante el
procedimiento de extraccin,
Colocar adecuadamente las terminales (+ y )
para que la muestra migre de () a (+) a lo largo
del gel. Condiciones: 65-68 Volts (5 V/cm), 60
mA, durante 1-1.5 horas; dependiendo de la
resolucin deseada.
Efectuar 3 mediciones durante el corrimiento
electrofortico (t=0, t=1/2 y t=1 hrs).
Hay que usar guantes durante el manejo del
bromuro de etidio (potente mutagnico), esta
sustancia es un agente intercalante y el
complejo ADN-Bromuro de etidio fluorece en la
regin del U.V.
Utilizando el marcador de peso molecular
(vase Diapositiva 11 y 12) como referencia, se
determinar la cantidad de ADN en el gel, as
como tambin su tamao y peso.
Se analizar y explicar la movilidad
electrofortica de la muestra en las distintas
soluciones.
generando fragmentos cortos de
ADN.
Debido a que no era posible
tomar la muestra por medio de la
varilla de vidrio, se utiliz una pipeta
pasteur para tomar tres alcuotas (1.5
mL) de la interfase, para su posterior
anlisis. Enseguida a las muestras se
les coloc 1 mL de EDTA 0.5 M para
evitar la degradacin con ADNasas.
Para demostrar la presencia de
cidos nucleicos en las alcuotas
tomadas, se verific por medio de
electroforesis en gel de agarosa
(empleando equipo moderno, vase
Diapositiva 16).
Condiciones de corrimiento
electrofortico: gel 0.6 %, 70 volts, 1
hora, 10 L de muestra + 1 L de sol.
de carga y 1 L de marcador.

Posteriormente se coloc en una
solucin con bromuro de etidio (0.5
mg/mL), para que se intercale en el
ADN y formar un complejo, el cul es
detectado a 254 nm (vase
Diapositiva 17). El fotografiado del
gel fue realizado con un sistema foto-
documentador (Geldoc de Bio-Rad).
La fotografa evidencia la
presencia de ADN en una alcuota. La
muestra presenta tamaos desde
>10,000 pb hasta 500 pb, pero la
muestra se concentra ms a partir de
las 2500 pb.
La presencia en forma de barrido
de la muestra, es debido a que el
ADN ha estado sometido a un
continuo proceso de degradacin,
generando ADNs de tamaos de
graduales.
Esta muestra fue sometida a
las distintas condiciones impuestas
durante la electroforesis.
Para llevar a cabo la
electroforesis, fue necesario disear y
construir la fuente de poder y la caja
electrofortica.
El diseo de la fuente, fue
hecho en base a las dimensiones de
la caja electrofortica y a las
dimensiones del gel.
La fuente tuvo una salida de
65-68 volts de manera constante (la
fluctuacin del voltaje fue debido a las
variaciones en la toma de corriente),
funcionando adecuadamente para la
finalidad realizada.
La caja electrofortica, aunque
era de plstico con dimensiones de
11.5 cm x 8.5 cm, y con dos alambres
de acero inoxidable como electrodos
en los extremos, funcion
apropiadamente para llevar a cabo
los corrimientos electroforticos.
Los corrimientos
electroforticos se llevaron a cabo
bajo las mismas condiciones de
electroforesis:
Tiempo de corrimiento (1 hr)
Voltaje constante (68 volts)
Volumen de muestra (10 L)
Volumen de solucin de carga (1 L)
Concentracin del gel (0.6%)
Dimensiones del gel (10 cm x 6.6 cm
x 0.5 cm)
Temperatura inicial (21 C)
Volumen del marcador de peso
molecular (1 L)
En el primer corrimiento
electrofortico, con la solucin 1xTAE
a pH 8, al igual que con la muestra
donde se verific la presencia de
ADN, fue corrida bajo las mismas
condiciones y, por lo tanto, migr
igual la muestra, eficientemente.
El pH no vari durante el
corrimiento electrofortico, y la
temperatura a t=1/2 hr fue 25 C, y a
t=1 hr fue 31 C (vase Diapositiva
18)
En el segundo corrimiento
electrofortico, con la solucin TBE a
pH 6. La muestra de ADN sometida a
condiciones cidas present cambios
en la movilidad electrofortica,
migrando con mayor dificultad como
se puede apreciar en el esquema
(vase Diapositiva 19).
El pH no vari durante el
corrimiento electrofortico, y la
temperatura a t=1/2 hr fue 25.5 C, y
a t=1 hr fue 33 C.
En el tercer corrimiento
electrofortico, con la solucin de
NaOH a pH 12. La muestra sometida
a condiciones alcalinas fue muy
adversa, ya que durante el
corrimiento electrofortico la
temperatura se elev
considerablemente hasta los 51 C a
la t=1/2 hr de haber transcurrido la
electroforesis; el pH no se midi. A
t=1 hr la temperatura era de 64 C.
As que, al momento de revelar el gel
para observar la distancia que haba
migrado la muestra, se observ que
haba poco ADN en gel y que haba
migrado muy poco la muestra que
estaba embebida en el gel (vase
Diapositiva 20).
Las distancias que recorrieron la
muestra en cada una de las
soluciones fueron:
TAE 4.6 cm
TBE 4 cm
NaOH 1.5 cm
Para efectuar la evaluacin
cuantitativa (la cual es subjetiva,
debido a que no se utiliz un software
para determinarlo), se contrasta la
intensidad de la muestra con respecto
al marcador de referencia.
De acuerdo a la intensidad y
contenido de ADN en las bandas del
marcador, obtuvimos 190 ng de ADN
en todo el gel. Ya que por cada L de
marcador hay 0.1 g de ADN. Para la
muestra corrida en solucin TAE.
Para las dems soluciones se ve
mermada la concentracin de ADN,
en especial en la sol. de NaOH.
Discusin
En el proceso de extraccin de
ADN, la muestra fue esquilada
durante el procedimiento,
probablemente fue debido a la
temperatura ambiental y al manejo de
la muestra. Los fragmentos de ADN
obtenidos de la extraccin son
molculas lineales.
En la electroforesis, la utilizacin de
agarosa es para permitir una
separacin en todos los ensayos de
manera uniforme y evitar considerar
otras variables inherentes a la
constitucin del agar-agar, ya que
presenta contaminacin por
protenas, carbohidratos y otras
molculas.
a voltajes bajos, la tasa de migracin
de los fragmentos ADN lineal es
proporcional al voltaje aplicado. Sin
embargo, como la fuerza del campo
elctrico es incrementado, la
movilidad de los fragmentos de alto
peso molecular de ADN incrementa
diferencialmente. As que para
obtener una resolucin mxima, hay
que establecer las condiciones de
separacin, para lo cual hay algunas
normas fsicas que necesitan
reiterarse: La fuerza de conduccin
en la electroforesis es el producto de
la carga (carga neta) de una
sustancia y el campo elctrico E,
medido en V/cm. Para la velocidad de
migracin de una sustancia y en cm/s
esto significa: v = ( x E) / R
As un campo definido de fuerza
es necesario para una migracin
electrofortica.
 En resumen, para resolver
fragmentos de ADN mayores de 2 kb
en tamao, los geles de agarosa
deben ser corridos a 5 V/cm.
El comportamiento electrofortico
del ADN en geles de agarosa no es
afectado significativamente por la
composicin de bases del ADN o por
la temperatura a la cual el gel es
corrido. En los geles de agarosa, la
relativa movilidad electrofortica de
los fragmentos de ADN de diferentes
tamaos no cambia entre los 4 C y
los 30 C. En general, los geles de
agarosa son corridos a temperatura
ambiente.
La movilidad electrofortica de
ADN esta afectado por la
composicin y fuerza inica del
amortiguador o solucin de
electroforesis. En la ausencia de
iones, la conductancia es mnima y el
ADN migra muy lentamente. En
amortiguadores de alta fuerza inica,
la conductancia elctrica es muy
eficiente y se generan cantidades
significativas de calor. En el peor de
los casos, el gel es fundido y el ADN
se desnaturaliza, como en el caso de
la muestra corrida en la sol. de NaOH
(vase Diapositiva 21).
Los solutos disueltos en solucin
afectan tambin la movilidad
electrofortica, ya que estos
interaccionan de manera reversible
con el ADN. As que a mayor
concentracin de sales, ms iones
interaccionarn con la molcula, y
consecuentemente la movilidad
electrofortica disminuir. Cuando la
concentracin es menor de sales
disueltas, pocos iones
interaccionarn con el ADN,
permitiendo una mayor movilidad
electrofortica.
Pero hay que considerar la
variable de la [sales], mencionado
anteriormente. As que para tener una
movilidad electrofortica mxima, hay
que considerar el equilibrio entre el
voltaje aplicado, la concentracin de
sales y, las dimensiones tanto de la
caja como del gel. Y en la variable de
la concentracin de sales hay que
tener una concentracin suficiente de
sales para tener una fuerza inica
suficientemente fuerte que permita
resolver las molculas a separar, pero
no demasiada, ya que los iones se
unen al ADN hacindola una
molcula ms voluminosa para pasar
a travs del gel de agarosa.
Ahora, considerando las
dimensiones de la caja electrofortica
y del gel. El voltaje aplicado esta en
funcin de la longitud de un electrodo
y otro. La corriente / (mA) debe ser
proporcional al grosor por el ancho de
la caja electrofortica. Y la potencia
es proporcional al volumen del gel.
Debido a que en la caja
electrofortica no se puede controlar
la temperatura, entonces es una
variable durante la electroforesis. Y
hay dos procesos de transferencia de
calor que ocurren en la caja
electrofortica: para la transferencia
de calor por conduccin se debe al
movimiento vibracional de los tomos
y al libre movimiento de electrones. Y
transferencia de calor por conveccin
es de dos tipos, natural y forzada.
La conveccin natural se presenta
cuando hay movimiento de las
molculas ocasionadas nicamente
por los cambios de densidad y
forzada cuando externamente s esta
"forzando" el movimiento del fluido. Y
los dos fenmenos de transferencia
de calor se presentan durante la
electroforesis.
Tanto la temperatura, como las
dems variables afectan la migracin
de la muestra y por lo tanto la
distancia recorrida por la muestra en
cada una de las soluciones es
distinta. La distancia d desplazada
por una zona de la muestra durante la
electroforesis en gel, es proporcional
al tiempo (t) y el gradiente de voltaje
g (en V cm-1), as que puede ser
calculado por
uit
d ugt
k principalmente a la disposicin de
donde i es la densidad de corriente
elctrica (A cm-2) y k es la
conductividad especfica (-1 cm-1).
Esto permite que u sea calculado, as
que, s u0 para las especies de
muestra particular es conocido,
puede entonces ser calculado. S D0
es conocido o medido, entonces D
puede tambin ser calculado.
Durante la migracin
electrofortica, la forma de una zona
de muestra esta dada por la variacin
en la concentracin c con el
desplazamiento x a lo largo del eje de
movimiento. Con una distribucin
Gaussiana de las molculas de
muestra, la forma esta caracterizada
por cm, la concentracin mxima y la
anchura de la zona (2w) a media
altura (i.e., c = cm/2). El volumen de
carga v aplicado por unidad de rea
de seccin transversal del gel, es
igual a la altura de la columna de
solucin de la muestra que contiene
la carga (m g del ARN del peso
equivalente de carga M), as que el
rea integrada de la zona es m/r2M.
Conclusiones
El procedimiento de extraccin es
fcil, accesible y rpido de
realizar.
ADN de alto peso molecular
puede ser obtenido de la muestra
mediante el procedimiento
descrito en este protocolo.
Para realizar una electroforesis es
difcil, muy cara y laboriosa
llevarla a cabo, debido
los reactivos.
El empleo de una fuente de poder
(comprada o construida en casa)
facilita la realizacin de la
electroforesis. Adems de que es
fcil su construccin y accesible
las piezas necesarias.
La construccin de una caja
electrofortica es sumamente fcil
y accesible, ya que con una caja
de plstico es suficiente.
Para realizar una electroforesis es
necesario considerar: la
concentracin de sales, el tamao
de la caja electrofortica, el
tamao del gel, el voltaje aplicado,
y el tamao de la muestra que se
busca resolver, principalmente.
Para interpretar los geles, es
necesario tener conocimiento de
cmo interacta el gel, la solucin
de electroforesis, el campo
elctrico ejercido sobre la muestra
a analizar.
 Wilson K., and Walker J. M. 1994.
Para determinar con presicin la Principles and Techniques of Practical
cantidad de ADN en gel, puede Biochemistry, Fourth edition,
ser por medio de dos mtodos: Cambridge University Press.
densitometra o empleando un
software en el que empleando el
marcador de peso molecular
determine con exactitud la
cantidad de ADN embebido en el
gel, ya que la cantidad de ADN es
proprocional a la luminosidad
apreciada en el gel.
Literatura citada:

Blackburn, G. Michael and Gait, J.

Michael. Nucleic Acids in Chemistry
and Biology, 1992, Oxford University
Press.

Brown, T.A. Essencial Molecular

Biology: A Practical Approach, 1991,
vol. I, Oxford University Press.

Cantor and Schimmel, Biophysical

Chemistry: The Behavior of Biological
Macromolecules, Part III.

Clark, John M., Switzer, Robert L.

Experimental Biochemistry, 1977, W.
H. Freeman.

Holme, David J., Peck, Hazel. Analytical

Biochemistry, 1993, Second Edition,
Longman Scientific & Technical, UK.

Rickwood, D., Hames, B. D. Gel

Electrophoresis of Nucleic Acid: A
Practical Approach, 1990, Second
edition, Oxford University Press.

Saenger, Wolfram. Principles of Nucleic

Acid Structure, 1984,
Springer-Verlag.

Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T.

1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, second edition. Cold Spring
Harbor Laboratory Press.