6.

1 Herramientas y tcnicas biotecnolgicas

Los carpinteros requieren herramientas como martillos, destornilladores y sierras;
los cirujanos requieren escalpelos, frceps y agujas para coser; y los mecnicos
requieren elevadores, llaves inglesas y bombas. Estas personas usan sus
implementos para modificar, deconstruir o construir un sistema con el que estn
trabajando. Al igual que cualquier otro tcnico, los bilogos moleculares usan
herramientas para completar un proyecto. Las herramientas en sus laboratorios
pueden ayudarlos a investigar desrdenes genticos, alterando la composicin
gentica de los organismos para que produzcan productos tiles como la
insulina o analicen la evidencia del ADN en una investigacin criminal. Una
diferencia clave entre las herramientas que utiliza un bilogo molecular y las de
un electricista o un ingeniero informtico, por ejemplo, es que, en muchos casos,
las herramientas del bilogo molecular son organismos biolgicos vivos o
molculas biolgicas. Las herramientas de biologa molecular son dinmicas y,
segn el entorno en el que se encuentren, se comportan de forma acorde.
Usando estas herramientas, los bilogos moleculares pueden cortar, unir y
replicar el ADN. Esto hace posible que los bilogos moleculares traten
secuencias de ADN especficas como mdulos y las muevan a voluntad desde
una molcula de ADN a otra, formando ADN recombinante. En la tecnologa
del ADN recombinante, los bilogos moleculares usan herramientas y procesos
que les permiten analizar y alterar genes y sus respectivas protenas. Esta
investigacin ha llevado a nuevos y emocionantes avances en biotecnologa.
ADN recombinante: fragmento de ADN compuesto por secuencias procedentes
de al menos dos fuentes diferentes.
Endonucleasas de restriccin
Una herramienta comnmente utilizada en biologa molecular es la
endonucleasa de restriccin. Las endonucleasas de restriccin, tambin
conocidas como enzimas de restriccin, son tijeras moleculares que pueden
cortar ADN de doble cadena en una secuencia especfica de pares de bases.
Cada tipo de enzima de restriccin reconoce una secuencia caracterstica de
nucletidos que se conoce como su sitio de reconocimiento. Los bilogos
moleculares pueden usar estas enzimas para cortar el ADN de una manera
predecible y precisa. La mayora de los sitios de reconocimiento tienen de
cuatro a ocho pares de bases de largo y generalmente se caracterizan por una
secuencia palindrmica complementaria (Tabla 1). Por ejemplo, la enzima de Comentado [CZ1]: Una secuencia palindrmica, o
restriccin EcoRI se une a la siguiente secuencia de pares de bases: palndromo, es una secuencia de cido nucleico
(ADN o ARN) que es lo mismo si se lee de 5' (5-
prima) a 3' (3-prima) en un filamento o de 5' a 3' en
el filamento complementario, con el cual forma
Es palindrmica porque ambas cadenas tienen la misma secuencia de bases una doble hlice.
cuando se leen en la direccin de 5 'a 3'.
EcoRI escanea una molcula de ADN y solo se detiene cuando puede unirse a
su sitio de reconocimiento. Una vez unido, interrumpe, mediante una reaccin
de hidrlisis, el enlace fosfodister entre los nucletidos de guanina y adenina
en cada cadena. Posteriormente, se rompen los enlaces de hidrgeno de los
pares de bases complementarios entre los cortes (Figura 1). El resultado es un
corte dentro de una hebra de ADN, produciendo dos fragmentos de ADN
donde una vez hubo solo uno.

Endonucleasas de restriccin: enzimas que pueden dividir el ADN de doble

cadena en fragmentos en secuencias especficas; tambin conocido como
enzimas de restriccin.

Sitio de reconocimiento: una secuencia especfica dentro del ADN de doble

hebra, generalmente palindrmica y que consta de cuatro a ocho nucletidos,
que una endonucleasa de restriccin reconoce y escinde (cortar).

Figura 1

Escisin de la secuencia de ADN usando la enzima de restriccin

EcoRI:

(a) EcoRI escanea la molcula de ADN;

(b) EcoRI se une al sitio de reconocimiento;
(c) EcoRI interrumpe los enlaces fosfodister. Se producen dos
fragmentos con extremos complementarios.
Los extremos de los fragmentos de ADN producidos a partir de un corte por
diferentes endonucleasas de restriccin difieren, dependiendo de dnde se
rompen los enlaces de fosfodister en el sitio de reconocimiento. En el ejemplo
de la Tabla 1, EcoRI produce extremos pegajosos; es decir, ambos fragmentos
tienen nucletidos de ADN que ahora carecen de sus respectivas bases
complementarias. Estos salientes se producen porque EcoRI escinde entre la
guanina y el nucletido de adenina en cada cadena. Como A y G estn en
extremos opuestos del sitio de reconocimiento en cada uno de los filamentos
complementarios, el resultado es el saliente. Otra endonucleasa de restriccin,
SmaI, produce extremos romos, lo que significa que los extremos de los
fragmentos de la molcula de ADN estn emparejados por completo (Tabla 1).
Dado que SmaI corta entre los nucletidos de citosina y guanina y estos
nucletidos estn directamente opuestos entre s en sus cadenas
complementarias, el resultado es un corte romo sin saliente. Las endonucleasas
de restriccin que producen extremos adhesivos son una herramienta
generalmente ms til para los bilogos moleculares que las que producen
extremos romos. Los fragmentos del extremo adhesivo se pueden unir ms
fcilmente a otros fragmentos del extremo adhesivo que han sido producidos
por la misma endonucleasa de restriccin a travs del emparejamiento de
bases complementarias Aunque se necesita otra enzima para completar el
enlace fosfodister, las bases complementarias de cada fragmento son
capaces de formar enlaces de hidrgeno (recocido), lo que facilita la unin
inicial de los fragmentos.

Las endonucleasas de restriccin reconocen secuencias de cuatro pares de

bases a pares de ocho bases como su sitio de reconocimiento, dando como
resultado una frecuencia de cortes relativamente baja en comparacin con un
sitio de reconocimiento de dos pares de bases. Por ejemplo, la probabilidad de
encontrar una secuencia de seis pares de bases, como la de EcoRI, es 4 x 4 x 4
x 4 x 4 x 4, una vez cada 4096 nucletidos. La probabilidad de encontrar dos
bases especficas una al lado de la otra es de 4 x 4, una vez cada 16 nucletidos.
La disminucin en la ocurrencia de sitios de reconocimiento ms largos da como
resultado menos cortes. Esto es importante en la ingeniera gentica cuando un
bilogo molecular desea extraer un fragmento de ADN que incluye un gen
completo. Si los cortes son ms frecuentes, el gen en s mismo puede cortarse y
debera aislarse en varios fragmentos. Si el sitio de reconocimiento comprende
ocho pares de bases, su frecuencia es menor. Sin embargo, esto tambin puede
plantear un problema, ya que se produciran fragmentos mucho ms grandes
que los originalmente deseados despus de la digestin. Por lo general, las
enzimas de restriccin que se segmentan en los sitios de reconocimiento de seis
pares de bases dan como resultado una frecuencia de escisin que puede
usarse para muchas aplicaciones.

Extremos pegajosos: extremo del fragmento de una molcula de ADN con

proyecciones cortas de cadena simple, resultantes de la escisin por una
enzima de restriccin.

Extremos romos: extremos del fragmento de una molcula de ADN que estn
emparejados por completo a la base, resultantes de la escisin por una enzima
de restriccin.

Varias de las herramientas que utilizan los bilogos moleculares para manipular
el ADN son molculas biolgicas en s mismas. Las enzimas de restriccin son un
ejemplo porque estn aisladas y purificadas nicamente de bacterias. De
hecho, una de las funciones de las enzimas de restriccin en una bacteria es
proporcionar un sistema inmune crudo. Cuando un virus (conocido como
bacterifago) ataca una clula bacteriana, inyecta su ADN en la bacteria y
deja su capa de protena fuera de la pared celular. A medida que el ADN del
bacterifago se inyecta en una clula bacteriana, la endonucleasa de
restriccin de la bacteria comienza a explorar este ADN extrao, buscando sitios
de reconocimiento. Debido a que inevitablemente existen sitios de
reconocimiento en el ADN extrao, la endonucleasa de restriccin escinde el
ADN del bacterifago en fragmentos (Figura 2). El ADN del bacterifago est
inactivado. Los fragmentos no pueden ser transcritos o traducidos a nada til.
El propio genoma de la clula bacteriana est protegido y puede seguir
funcionando como una clula bacteriana, a diferencia de una fbrica de
produccin de bacterifagos.
 Figura 2

El ADN extrao que entra en las bacterias se digiere usando una enzima
de restriccin. Esto evita que el ADN extrao se apodere de la
maquinaria celular disponible en la bacteria para propagarse a s misma
y sus productos.

(a) Un bacterifago inyecta su ADN en una bacteria husped. La

bacteria husped reconoce el ADN como extrao.
(b) EcoRI digiere ADN extrao en pequeos fragmentos, dejndolo
intil.

Las enzimas de restriccin se nombran de acuerdo con la bacteria de la que se

originan. Por ejemplo, la enzima de restriccin BamHI se nombra de la siguiente
manera:

B representa el gnero Bacillus

am representa la especie amyloliquefaciens

H representa la tensin

I significa que fue la primera endonucleasa aislada de esta cepa

Siguiendo el mismo patrn, la razn del nombre de la enzima de restriccin HindII

es el siguiente:

H representa el gnero Haemophilus

In representa la especie influenzae

D representa la tensin Rd

II significa que fue la segunda endonucleasa aislada de esta cepa

En trminos generales, la primera letra es la inicial del nombre del gnero del
organismo del cual se aisl la enzima. La segunda y tercera letras son
generalmente las letras iniciales del nombre de la especie. La cuarta letra indica
la tensin, mientras que los nmeros indican el orden de descubrimiento de esa
enzima particular de esa cepa de bacterias.

La presencia de enzimas de restriccin se sospech por primera vez a principios

de la dcada de 1960. Los cientficos notaron que cuando el ADN de una cepa
de E. coli se insertaba en una cepa diferente de E. coli, el ADN no sobreviva,
sino que se cortaba en pedazos. Pronto se descubrieron dos enzimas que
podran escindir el ADN al azar. Hamilton Smith en la Universidad John Hopkins
confirm la presencia de enzimas de restriccin especficas del sitio con el
descubrimiento accidental de HindII en 1970. En su investigacin, Smith
intentaba comprender cmo algunas bacterias se resisten a la invasin de virus.
Descubri que cuando el ADN extrao se insertaba en la bacteria del husped,
se degradaba rpidamente, pero el ADN de la propia bacteria permaneca
intacto. Hizo la hiptesis de que existe una enzima dentro de la bacteria
husped que es responsable de esta degradacin. La investigacin adicional
condujo al aislamiento de HindII. Smith comparti el Premio Nobel en 1978 por
su descubrimiento. Desde entonces, se han aislado ms de 2500 endonucleasas
de restriccin con especificidad para aproximadamente 200 sitios de destino
han sido aislados por organismos procarioticos. En la actualidad,
aproximadamente 200 de estas endonucleasas de restriccin estn disponibles
comercialmente para los bilogos moleculares para su uso en investigaciones
de laboratorio.

Metilasas
Las endonucleasas de restriccin deben ser capaces de distinguir entre el ADN
extrao y el material gentico de sus propias clulas; de lo contrario, el ADN de
una bacteria estara en peligro de ser escindido por su propio sistema inmune.
Las metilasas son enzimas especficas que se encuentran en procariotas y
eucariotas. En procariotas, modifican el sitio de reconocimiento de una
endonucleasa de restriccin respectiva colocando un grupo metilo en una de
las bases, evitando que la endonucleasa de restriccin corte el ADN en
fragmentos. coRI metilasa, por ejemplo, agrega un grupo metilo al segundo
nucletido de adenina en el sitio de reconocimiento de EcoRI (Figura 3),
evitando que EcoRI corte el ADN. Cuando se introduce ADN extrao en la
bacteria, no est metilado, lo que lo hace indefenso contra las enzimas de
restriccin de la bacteria. Las metilasas son herramientas importantes para un
bilogo molecular cuando se trabaja con organismos procariticos. Permiten
que el bilogo molecular proteja un fragmento de gen para que no se escinda
en una ubicacin no deseada.

Metilacin Eucaritica: El propsito de las metilasas en clulas eucariticas

difiere del de las clulas procariotas. Las metilasas en eucariotas estn
conectadas con el control de la transcripcin. Adems, aproximadamente el
2% del ARN ribosmico de mamfero se metila despus de su transcripcin.

Enzimas metilasas: que aaden un grupo metilo a uno de los nucletidos

encontrados en un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restriccin,
alterando su composicin qumica.

Figura 3

En un sitio EcoRI metilado, la

enzima de restriccin EcoRI ya
no es capaz de cortar.

Ligasa de ADN
Si los genes pueden ser eliminados de la fuente de ADN, tambin debe haber
una forma de unirlos al ADN objetivo externo. Si se han generado dos fragmentos
de cidos nucleicos usando la misma enzima de restriccin, se atraern
naturalmente entre s en sus extremos adhesivos complementarios. Se formarn
enlaces de hidrgeno entre los pares de bases complementarios, pero esta no
es una disposicin estable. El enlace fosfodister entre las cadenas principales
de las cadenas dobles debe reformarse. La ADN ligasa es la enzima utilizada
para unir las hebras cortadas de ADN juntas. Usando una reaccin de
condensacin, la ADN ligasa expulsa una molcula de agua y reforma el enlace
fosfodister de la columna vertebral del ADN. Unirse a hebras con extremos
romos utilizando ADN ligasa es muy ineficiente. Los bilogos moleculares usan
T4 ADN ligasa, una enzima que se origin a partir del bacterifago T4, para unir
los extremos romos (Figura 4).

T4 ADN ligasa: una enzima utilizada para unir ADN romo o extremos adhesivos.

Figura 4

La ADN ligasa es capaz de unir

extremos adhesivos
complementarios producidos por la
misma enzima de restriccin a travs
de una reaccin de condensacin.

(a) Puntas adhesivas

complementarias
producidas por HindIII
(b) Los enlaces de hidrgeno
se forman entre las bases
complementarias. La ADN
ligasa reconstituye el
enlace fosfodister en
cadenas principales de
ADN.
(c) Si los fragmentos no son
complementarios,
entonces no se formarn
enlaces de hidrgeno.

Electroforesis en gel
Una vez que el gen deseado ha sido extirpado de su ADN fuente, debe
separarse del resto de fragmentos no deseados. Los fragmentos de ADN se
pueden separar usando el proceso de electroforesis en gel. La electroforesis en
gel aprovecha las propiedades qumicas y fsicas del ADN (Figura 5).
 Figura 5

En una configuracin de electroforesis en gel comn, el ADN se

carga en los pocillos en un extremo del gel y luego migra hacia el
electrodo positivo en el extremo opuesto. La velocidad de migracin
de los fragmentos vara con el tamao.

electroforesis en gel: separacin de molculas cargadas en funcin del tamao

mediante clasificacin a travs de una malla de gel

El ADN tiene una carga negativa. Cada nucletido posee un grupo fosfato
constituyente que lleva una carga neta de -1. Adems, la masa molar de cada
nucletido es relativamente consistente. La pequea diferencia en la masa
molar entre nucletidos es insignificante debido a la relacin de purinas a
pirimidinas en una molcula de ADN. Estas dos propiedades contribuyen a que
cada nucletido tenga la misma relacin de carga a masa. Por lo tanto, la
nica diferencia entre dos fragmentos de ADN que son de diferentes longitudes
es el nmero de nucletidos. Esta diferencia se puede explotar para separar
fragmentos de ADN de acuerdo con el tamao. La electroforesis en gel se
puede considerar como un tamiz molecular. El ADN que ha sido sometido a
digestin con endonucleasas de restriccin se escindir en fragmentos de
diferentes longitudes. Los fragmentos de ADN migran a travs del gel a una
velocidad que es inversamente proporcional al logaritmo de su tamao. Cuanto
ms corto es el fragmento, ms rpido se desplazar debido a su capacidad
para navegar a travs de los poros en el gel ms fcilmente que un fragmento
grande. Los fragmentos ms grandes se ven obstaculizados por su tamao. Una
situacin anloga sera un grupo de personas corriendo por un bosque en el
cual los rboles son equidistantes entre s. Si se obliga a 30 personas a tomarse
de la mano mientras corren por el bosque, les llevar mucho tiempo navegar
de un extremo a otro. Si a las personas se les permite correr en trillizos, viajarn
mucho ms rpido. Finalmente, una persona individual no tendr
absolutamente ningn problema para salir adelante. Por lo tanto, cuanto ms
larga sea una cadena de nucletidos, ms tiempo demorar la migracin. La
electroforesis en gel aprovecha la carga negativa del ADN. Una solucin que
contiene fragmentos de diferentes tamaos para separar se coloca en un pozo
(Figura 6). Un pozo es una depresin en un extremo del gel. El gel en s mismo es
generalmente una losa cuadrada o rectangular y consiste en un tampn que
contiene electrolitos y agarosa, o posiblemente poliacrilamida.

La solucin de ADN que contiene fragmentos a separar se mezcla con un

colorante de carga que contiene glicerol. El colorante de carga permite la
visualizacin de la solucin de ADN. El glicerol es una molcula pesada que
hace que la solucin de ADN se hunda en el pozo. El gel se carga mientras est
sumergido en una bandeja que contiene una solucin electroltica llamada
tampn. Usando corriente continua, se coloca una carga negativa en un
extremo del gel donde estn los pocillos, y se coloca una carga positiva en el
extremo opuesto del gel. La solucin de electrolito transporta la corriente a
travs del gel. El ADN cargado negativamente migrar hacia el electrodo
cargado positivamente, y los fragmentos ms cortos migrarn ms rpido que
los fragmentos ms largos, logrando la separacin. Las molculas pequeas que
se encuentran dentro del colorante de carga migran por delante de todos los
fragmentos de ADN. Dado que las molculas pequeas se pueden visualizar, la
corriente elctrica se puede apagar antes de que lleguen al final del gel.

agarosa: polisacrido formador de gel que se encuentra en algunos tipos de

algas que se utilizan para formar una malla de gel para la electroforesis.

poliacrilamida: polmero artificial utilizado para formar una malla de gel para
electroforesis
 Figura 6

Todos los fragmentos mantienen la misma relacin de carga a masa y

experimentan resistencia del gel. Los fragmentos ms pequeos
experimentan menos resistencia y viajan ms lejos que los fragmentos ms
grandes. Un marcador molecular se ejecuta al costado para determinar el
tamao de los fragmentos.

bromuro de etidio: una molcula plana cancergena que se inserta entre los
peldaos de la escalera del ADN y fluoresce bajo luz ultravioleta

fluorescencias: brilla bajo luz UV debido a la excitacin de los electrones de

una molcula

Una vez que se completa la electroforesis en gel, los fragmentos de ADN se

hacen visibles mediante la tincin del gel (Figura 7). El conjunto de fragmentos
generados con una enzima de restriccin particular produce un patrn de
bandas caracterstico para ese ADN. La mancha ms comnmente utilizada es
el bromuro de etidio (Figura 8). El bromuro de etidio es una molcula plana que
emite fluorescencia bajo luz ultravioleta (UV) y puede insertarse entre los
peldaos de la escalera de ADN. Cuando el gel se somete a luz ultravioleta, las
bandas de ADN se visualizan porque el bromuro de etidio se inserta entre los
nucletidos. El tamao de los fragmentos se determina utilizando un marcador
molecular como estndar. El marcador molecular, que contiene fragmentos de
tamao conocido, se ejecuta en las mismas condiciones (en el mismo gel) que
el ADN digerido. El investigador puede trazar el registro de los tamaos de
fragmentos conocidos frente a la distancia recorrida desde los pozos. El grfico
resultante se puede usar para determinar el tamao de los fragmentos
desconocidos a travs de la interpolacin. Adems de poder estimar el tamao
de un fragmento deseado, un investigador puede comparar tamaos de
fragmentos de diferentes fuentes y tambin puede extirpar el fragmento
deseado del gel. Una vez que se ha cortado la regin del gel que contiene el
fragmento deseado, la regin se puede purificar para un uso posterior. La
electroforesis en gel no se limita a la separacin de cidos nucleicos, sino que
tambin se aplica comnmente a las protenas. Las protenas generalmente se
usan en geles de poliacrilamida, que tienen poros ms pequeos, porque las
protenas generalmente son de menor tamao que los cidos nucleicos.

Figura 7

Ejemplo de patrn de bandas

de ADN producido por la
digestin de ADN usando
enzimas de restriccin y luego
la separacin de fragmentos
de ADN por electroforesis en
gel

Plsmidos
Como se discuti, una secuencia deseada de nucletidos a partir de ADN
fuente se puede cortar del genoma, separar y hibridar en otra molcula de
ADN. En algunos casos, los fragmentos de genes se extirpan con el objetivo de
tener el gen expresado como una protena til. Sin embargo, para que un gen
se exprese, se requiere maquinaria celular. Las bacterias a menudo
proporcionan la maquinaria necesaria. El gen de la insulina, por ejemplo, ha sido
aislado y ahora puede ser expresado por clulas bacterianas. La insulina es una
protena producida por el pncreas que controla los niveles de azcar en la
sangre. Usando la tecnologa de la ingeniera gentica, el gen de la insulina
humana se inserta en las clulas bacterianas que expresan el gen y construyen
la protena insulina. Un gran porcentaje de personas con diabetes se han
beneficiado del suministro de insulina producida por las bacterias.
Originalmente, estos pacientes dependan de la insulina que se extraa de los
animales, lo que puede provocar reacciones alrgicas. Las bacterias pueden
expresar genes extraos insertados en plsmidos (Figura 9). Los plsmidos son
pequeas molculas circulares de ADN de doble cadena que carecen de una
cubierta de protena que existe de forma natural en el citoplasma de muchas
cepas de bacterias. Los plsmidos son independientes del cromosoma de la
clula bacteriana y varan en tamao de 1000 a 200 000 pares de bases.
Usando las enzimas y los ribosomas que alberga la clula bacteriana, el ADN
contenido en los plsmidos se puede replicar y expresar. La clula bacteriana
se beneficia de la presencia de plsmidos. Los plsmidos a menudo portan
genes que expresan protenas capaces de conferir resistencia a los antibiticos
(Figura 10). Tambin protegen a las bacterias al portar genes de resistencia a los
metales pesados txicos, como el mercurio, el plomo o el cadmio. Adems,
algunas bacterias llevan plsmidos que poseen genes que permiten a las
bacterias descomponer herbicidas, ciertos productos qumicos industriales o los
componentes del petrleo. La relacin entre las bacterias y los plsmidos es
endosimbitica; tanto la bacteria como el plsmido se benefician de la
disposicin mutua.

plsmidos: pequeas piezas circulares de ADN que pueden salir y entrar en las
clulas bacterianas.

Figura 9

El ADN cromosmico y el
plsmido coexisten en una
relacin endosimbitica.
 Figura 10

El plsmido pBR322 genticamente modificado tiene dos genes

que confieren resistencia a los antibiticos. Un gen confiere
resistencia a tetraciclina (tetr) y otro gen codifica resistencia a
ampicilina (ampr). Los plsmidos tambin contienen un origen de
replicacin (ori), una regin que dirige la replicacin del plsmido.
Los plsmidos contienen sitios de reconocimiento para enzimas de
restriccin. Se muestran algunos de los sitios de reconocimiento de
enzimas de restriccin.

Plsmidos: Invitados benficos

Los cientficos japoneses fueron los primeros en descubrir plsmidos que llevan
genes para la resistencia a mltiples frmacos. La bacteria Shigella, que causa
disentera, desarroll resistencia a hasta cuatro antibiticos, incluyendo
tetraciclina, estreptomicina, cloranfenicol y las sulfonamidas. La resistencia a
mltiples frmacos se debi a un plsmido dentro de la bacteria que portaban
genes para resistencia y podan pasar naturalmente de bacteria a bacteria.

Nmero de copia: nmero de copias de un plsmido particular encontrado en

una clula bacteriana

Los plsmidos tambin poseen un nmero de copia caracterstico. Cuanto

mayor sea el nmero de copias, mayor ser el nmero de plsmidos individuales
en una clula bacteriana husped. Si existen ms copias de un plsmido, se
sintetizar ms protena debido al mayor nmero de copias de genes que lleva
el plsmido. La cantidad de copias juega un papel en la manifestacin
fenotpica de un gen. Por ejemplo, mientras ms copias de un gen de resistencia
a antibiticos haya, mayor ser la resistencia al antibitico.

Las endonucleasas de restriccin se usan para unir un gen extrao en un

plsmido. Los plsmidos artificiales han sido diseados para contener una regin
nica que puede ser cortada por muchas enzimas de restriccin. Los sitios de
reconocimiento de muchas enzimas de restriccin se han colocado muy juntos
en esta rea y no se encuentran en ningn otro lugar en la secuencia de ADN
del plsmido. Este sitio se llama sitio de clonacin mltiple. Los sitios de
reconocimiento estn presentes solo una vez en el plsmido y, por lo tanto, la
enzima de restriccin solo puede hacer un corte en el ADN. No tendra ningn
valor para un bilogo molecular si el plsmido fuera cortado en muchos
fragmentos por la misma enzima de restriccin. Un corte da como resultado que
el plsmido circular se vuelva lineal. Si el gen extrao se ha escindido usando la
misma enzima de restriccin, poseer los mismos extremos complementarios
que el plsmido linealizado. Cuando se colocan juntos, los fragmentos
pegajosos se recocern. Entonces el gen extrao se convertir
permanentemente en parte del plsmido despus de que se restablezcan los
enlaces fosfodister (Figura 11). Por ejemplo, si el fragmento de ADN extrao
deseado se escinde fuera de su ADN fuente con EcoRI, entonces el plsmido
circular se corta en el sitio de clonacin mltiple por digestin con la misma
enzima de restriccin (en este caso, EcoRI). El fragmento deseado y los
fragmentos de plsmido se ponen en proximidad colocndolos en la misma
solucin, donde se hibridan debido a los extremos adhesivos complementarios
producidos por la digestin con la misma enzima. A continuacin, se agrega
ADN ligasa para volver a formar los enlaces fosfodister entre los fragmentos, lo
que resulta una vez ms en una pieza circular de ADN que ahora porta el
fragmento del gen extrao. El plsmido ahora es ADN recombinante, una
combinacin del ADN plasmdico original y el ADN extrao. El plsmido ahora
se puede introducir en una clula bacteriana, donde se replica para formar
muchas copias dentro de la clula. El gen ha sido clonado porque, a medida
que el plsmido se replica, se producen muchas copias del ADN recombinante,
cada una de las cuales incluye una copia del gen original insertado.

Sitio de clonacin mltiple: regin en el plsmido que se ha diseado para

contener sitios de reconocimiento de una serie de endonucleasas de restriccin

Figura 11

Un gen extrao se introduce en un plsmido. El plsmido es ahora un

ejemplo de ADN recombinante, que se puede introducir en una
clula bacteriana para producir numerosas copias del gen.
clonado: un fragmento de ADN que se ha introducido en una clula extraa,
lo que da como resultado copias exactas del fragmento de ADN original que
se realiza cuando la clula extraa se replica y se divide.

Transformacin
Debido al pequeo tamao de los plsmidos, las bacterias pueden tomarlos
bajo condiciones especficas. La introduccin de ADN de otra fuente se conoce
como transformacin, y una bacteria que ha tomado un plsmido extrao se
denomina transformacin. Por lo tanto, los plsmidos se pueden usar como
vectores para transportar un gen deseado en una clula husped.

Si una bacteria absorbe fcilmente ADN extrao, se describe como una clula
competente. La mayora de las bacterias no son naturalmente competentes,
pero pueden inducirse qumicamente en el laboratorio para que lo hagan con
la ayuda del cloruro de calcio. El cloruro de calcio es una sal que se ioniza en
Ca2+ y Cl- . Las clulas bacterianas se suspenden en una solucin de cloruro de
calcio a 0 C. La membrana bacteriana contiene fosfatos expuestos que estn
cargados negativamente. Los iones de calcio con carga positiva estabilizan las
cargas negativas de los fosfatos. Adems, la baja temperatura "congela" la
membrana celular, que es fluida, lo que la hace ms rgida. Ahora que la
membrana celular se ha estabilizado tanto fsica como qumicamente, el ADN
del plsmido se introduce en la solucin. Los fosfatos cargados negativamente
del ADN tambin se estabilizan mediante los cationes de calcio (Figura 12). En
este punto, toda la solucin se somete a un tratamiento de choque trmico
rpido de 42 C que dura aproximadamente 90 segundos y crea un borrador.
El entorno exterior de la celda ahora est a una temperatura ligeramente ms
alta que el interior de la celda. El borrador resultante barre los plsmidos en la
clula bacteriana a travs de los poros en su membrana. Finalmente, las clulas
bacterianas pueden recuperarse de la experiencia. Se incuban en una
suspensin de medios nutrientes a una temperatura de 37 C. El cultivo selectivo
es un mtodo que puede usarse para aislar las clulas con ADN recombinante
(Investigacin 5.4.1 en el Captulo 5) (Figura 13). Los vectores usados para la
clonacin llevan un gen de resistencia a antibiticos. Por lo tanto, si la
transformacin es un xito, la bacteria podr crecer en los medios que
contienen el antibitico. Si no se observa crecimiento, las bacterias no se
transformaron y fueron eliminadas por el antibitico.

Transformacin: introduccin de ADN extrao, generalmente por un plsmido o

virus, en una clula bacteriana.

Vectores: vehculos por los cuales el ADN puede ser introducido en las clulas
del husped.

Clula husped: una clula que ha tomado un plsmido o virus extrao y cuya
maquinaria celular se utiliza para expresar el ADN extrao.

Clula competente: una clula que absorbe fcilmente ADN extrao.

Figura 12

Los iones calcio neutralizan la carga negativa del grupo fosfato en el ADN
del plsmido y en los fosfolpidos encontrados en la membrana celular,
minimizando el efecto repelente de las cargas similares. El ADN puede
ingresar a la clula bacteriana ms fcilmente.

Figura 13

El xito de una transformacin puede evaluarse usando un recubrimiento

selectivo. Tambin se deberan realizar controles positivos y negativos para
aumentar la validez del experimento.
Tambin es necesario verificar que el gen extrao realmente exista en las
bacterias transformadas. Las bacterias pueden exhibir resistencia a los
antibiticos tomando el plsmido que no ha podido insertar el fragmento del
gen extrao. Se seleccionan colonias de bacterias que se han transformado. Las
colonias individuales se retiran de la placa y se dejan proliferar en medios
lquidos hasta que se pueden cosechar suficientes clulas bacterianas para
extraer una cantidad adecuada de ADN plasmdico. El ADN del plsmido
extrado se somete a una digestin con enzimas de restriccin para liberar el
fragmento clonado del vector. Si se observa el patrn esperado de bandas en
el gel, entonces esa colonia contiene un plsmido de ADN recombinante. El
mtodo del cloruro de calcio es el mtodo clsico de transformacin de clulas.
Hoy en da, tambin se utilizan electroporadores, cmaras que someten a la
bacteria a una descarga elctrica. La descarga elctrica afloja la estructura de
las paredes celulares y permite la entrada de ADN extrao. Las clulas vegetales
plantean un desafo mayor para los bilogos moleculares debido a su pared
celular rgida. Las "armas de genes" elctricas modernas se usan para "disparar"
ADN a travs de la pared celular y la membrana. El proyectil inicial es una gota
de agua, que se carga y dispara a travs de un tubo a travs de una descarga
elctrica. Las gotas de agua golpean una hoja de soporte que contiene el ADN
envuelto en partculas de oro. La fuerza del impacto hace que el ADN sea
impulsado hacia las clulas objetivo, donde es capaz de penetrar las paredes
celulares y las membranas celulares.

Resumen
Tabla 2 Herramientas clave de la biologa molecular

Herramienta uso ejemplo

endonucleasa enzima
de restriccin bacteriana que
escinde
secuencias de
ADN en un sitio de
reconocimiento
especfico

Metilasa enzimas
bacterianas que
agregan un grupo
metilo a los sitios
de
reconocimiento
para proteger el
ADN de la escisin
por la enzima de
restriccin
 enzima que une
fragmentos
complementarios
ADN ligasa mediante la
reconstitucin del
enlace
fosfodister de la
cadena principal
del ADN
electroforesis en proceso
gel mediante el cual
los fragmentos de
ADN de
diferentes
longitudes se
separan por
corriente
elctrica, carga
negativa de ADN
y proporcin de
carga constante
a masa
plsmido ADN circular plsmido que contiene sitio de
pequeo que clonacin mltiple, gen resistente a
tiene la ampicilina y otros sitios de enzimas de
capacidad de restriccin.
entrar y replicarse
en clulas
bacterianas y,
por lo tanto,
puede usarse
como un vector
para introducir
nuevos genes en
una clula
bacteriana.
Los principales pasos en la clonacin del ADN
La Figura 14 muestra los siguientes pasos en la clonacin de ADN:

1. Generacin de fragmentos de ADN usando endonucleasas de restriccin

Deben usarse endonucleasas de restriccin apropiadas para asegurar que el

gen del fragmento en cuestin se elimina por completo del ADN fuente.

Se puede usar ms de una endonucleasa de restriccin a la vez.

2. Construccin de una molcula de ADN recombinante

El fragmento del gen objetivo est ligado a un vector de ADN (los plsmidos
son un ejemplo) y ahora es ADN recombinante.
 El vector puede replicarse de forma autnoma en un organismo hospedador
apropiado.

3. Introduccin en una clula anfitriona

Las clulas huspedes bacterianos se pueden manipular para absorber

el ADN recombinante usando electroporadores, pistolas gnicas o
protocolos de transformacin clsicos, como el cloruro de calcio.
Una vez que la bacteria toma el ADN recombinante, se denomina
transformacin.

4. Seleccin

Las clulas que se han transformado con xito con el ADN recombinante
deben aislarse.

Las clulas deseadas normalmente se seleccionan qumicamente por la

presencia de un marcador (por ejemplo, resistencia a antibiticos) en el
vector.

El crecimiento de colonias en los medios que contienen el producto qumico

indica una transformacin exitosa del vector de ADN recombinante.

Las colonias individuales se aslan de los medios que contienen el producto

qumico y se cultivan en cultivo para producir copias mltiples (clones) del
ADN recombinante incorporado.
Figura

14 Los pasos claves en la clonacin