ISOLASI DNA MENGGUNAKAN METODE FENA KLOROFORM DAN UJI

KUALITAS DNA

Makalah
Disusun untuk memenuhi tugas Matakuliah
Teknik Analisis Biologi Molekuler yang dibina oleh Dr. Umie Lestari, M.Si dan
Prof. Dr. agr. Mohammad Amin, M.Si

Kelompok 3 Offering G
1. Nindis Pristya (150342600086)
2. Nuurul Muchlishiin (150342607001)
3. Riza Eka Novita Sari (150342602425)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
PROGRAM STUDI S1 BIOLOGI
November 2017
A. Topik
Isolasi DNA Menggunakan Metode Fena Kloroform Dan Uji Kualitas Dna
B. Tujuan
Praktikum ini dilakukan dengan tujuan :
1. Mengisolasi DNA dari darah, dan memahami teknik pengisolasian DNA dari
darah.
2. Menguji kualitas DNA dari darah
C. Dasar Teori
Didalam inti sel suatu organisme, terdapat materi genetik. Materi genetik ini
harus mempunyai kemampuan untuk mengkode suatu informasi secara spesifik dan
menggandakan suatu informasi secara tepat (NCBI-Griffiths dkk: 2000). Contoh dari
materi genetic adalah DNA/RNA, gen dan kromosom. DNA dan RNA dimiliki oleh
organisme prokariotik, sedangkan eukariotik hanya memiliki RNA. DNA/RNA
adalah informasi genetik yang dibentuk oleh asam deoksiribonukleat untuk DNA atau
Ribosanukleat untuk RNA (Solomon dkk 2005: 38). DNA manusia dan hewan
biasanya diperoleh dari darah dan jaringan dalam. Namun DNA juga dapat diektraksi
darisemen, saliva, akar rambut, urine, dan gigi (Medical Genomics 2004: 1). Namun
demikian, bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah
karena bahan tersebut relatif mudah diperoleh (Siswanto et al,2016)
Isolasi DNA merupakan teknik ekstraksi DNA dari suatu sel sebagai tahap
awal suatu analisis genetik. Secara umum, tahap isolasi DNA dimulai dari
pengambilan sampel sel, pelisisan membran dan/atau dinding sel, ekstraksi DNA,
presipitasi DNA, pemurnian DNA, dan pengawetan DNA (Gaikwad,2010: 2).
Kualitas DNA dapat diketahui dengan proses elektrophoresis gel agarose,
menggunakan pewarna Ethidium Bromida, sedangkan kemurnian DNA dapat
diketahui berdasarkan hasil ba`gi nilai OD 260 terhadap nilai OD 280 yang terbaca
pada UV spektrophotometer (Sambrook, 1989).

D. Alat Bahan
 Alat :
Mikropipet Strier hot plat
Mikrotube Tank elektroforesis
Sentrifuge UV transluminator
Tabung sentrifuge Gloves
Nanodrop Masker
Kulkas Vorteks
Bahan:
1. Darah burung merpati 0,5% SDS 500 l
Columbidae sp 2 mm EDTA 20 l
2. Larutan 1 4. Kloroform
MgCl2 10 l 5. Fenol
KCl 10 l 6. Agarose 1 %
10 mm Tris Base 10 l 7. Buffer TBE (Buffer Tris-asam
3. Larutan 2 borat)
10 mm Tris Base 10 l 8. Loading Dye
KCl 10 l 0,4 bromofenol blue
MgCl 10 l 50% gliserol
0,5 M NaCl 500 l

Fungsi larutan
No. Alat/bahan Fungsi
1. Larutan 1
MgCl2 10 l
KCl 10 l Sebagai mendenaturasi protein
10 mm Tris Base 10 l Sebagai meresuspensi pelet sel bakteri
setelah pemanenan menggunakan sentrifus
5. Larutan 2
10 mm Tris Base 10 l Sebagai meresuspensi pelet sel bakteri
setelah pemanenan menggunakan sentrifus
KCl 10 l Sebagai mendenaturasi protein
MgCl 10 l Sebagai kofaktor yang berfungsi
menstimulasi aktivitas DNA polimerase.
 0,5 M NaCl 500 l Menstabilkan larutan sehingga
mempercepat reaksi yang akan terjadi pada
tahapan berikutnya
0,5% SDS 500 l untuk merusak lipid pada membran sel
sehingga leukosit hancur.
2 mm EDTA 20 l Berfungsi membentuk kompleks (chelate)
dengan ion logam, seperti Mg2+ yang
merupakan kofaktor DNAse. Selain itu
dalam larutan tersebut juga terdapat larutan
NaCl yang berfungsi untuk menstabilkan
larutan sehingga mempercepat reaksi-
reaksi yang akan terjadi pada tahapan
berikutnya.
11. KLOROFORM Sebagai emulsifier
12. ETANOL Sebagai penghilangkan kontaminan pada
DNA
13. BUFFER TE untuk menjaga agar DNA tidak rusak.
14. Buffer TBE (Buffer Tris-asam Menjaga integritas DNA
borat)
15. Loading Dye Sebagai penandai molekul DNA
dielektroforesis
0,4 bromofenol blue Sebagai tracking DNA berhenti
50% gliserol Penambah massa jenis DNA

E. Cara Kerja
Teknik Isolasi DNA

Memasukkan 250 l sampel darah kedalam tube lalu menambahkan 250 l larutan 1
lalu aduk hingga homogen
 Maukkan 6 l NP40 lalu diaduk hingga homogen

Mensentrifuge larutan yang telah dicampur dengan kecepatan 2500 rpm selama 10
menit dengan suhu 4C

Membuang supernatant dan ditambahkan 100 l larutan 2 dan diaduk hingga pellet
larut

Menambahkan fenol 20 l setelah itu di vortexs lalu di sentrifuge pada kecepatan 1300
rpm selama 3 menit

Mengambil supernatant lalu dipindahkan dalam tube baru lalu ditambahkan kloroform
sebanyak 10 l lalu di vortex sampai warnanya seperti susu

Mensentrifuge campuran tersebut selama 2 menitdi suhu 4C dengan kecepakatan 1300

rpm

Mengambil supernatant lalu dipindahkan ke tube baru yang selanjutnya ditambahkan

kloroform sebanyak 20 l dan di vortexs sampai warnanya putih se[erti susu

Mensentrifuge kembali selama 3 menit di suhu 4C dengan kecepatan 1300 rpm

Mengambil supernatant di tube baru lalu ditambahkan 2x volume etanol (freezer 5 )

menit))
 Mensentrifuge pada kecepatan 1300 rpm selama 5 menit di suhu 4C

Membuang supernatant kemudian pellet dicuci dengan menambahkan 100 l etanol

70%

Mendentrifuge pada kecepatan 1300 rpmselama 5 menit di suhu 4C

Membuang supernatant lalu dikeringkan 1 jam

Melarutkan DNA dan 12,5 l buffer TE lalu disimpan pada freezer -20C

Hasil

Uji Kuantitatif dengan NanodropspektrofotometerUV-Vis

Menyalakan computer lalu ketik nanofrop spektrofotometer yang ada pada desktop
komputer

Membersihka area cuvet nanodrop spektrofotometer dengan 3 l akuades steril dan

tunggu selama 3 menit

Membersihkan area cuvet dengan kertas lensa hingga bersih

 Memilih opsi DNA yang akan diukur konsentrasi dan kemurniannya

Memasukkan 1 l buffer pelarut Dna lalu klik BLANK

Membersihkan area cuvet dengan kertas lensa hingga bersih

Memberi nama dan kode sampel

Memasukkan 1 l sampel pelarut Dna lalu klik MEASURE

Memilih area simpan file tersebut lalu klik SAVE

Menganalisis grafik yang dihasilkan

Membersihkan area cuvet dengan kertas lensa hingga bersih

Membersihka area cuvet nanodrop spektrofotometer dengan 3 l akuades steril dan

tunggu selama 3 menit

Hasil

Uji Kualitatif dengan elektroforesis gel agarosa

1,2 % gel agarosa dalam 1x buffer TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), tegangan65 volt.
 Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan 5 g/ml etidium bromida

visualisasi dibawah sinar UV transilluminator.

Keberhasilan dari isolasi DNA total ditunjukkan dengan adanya pita (band) yang jelas
dan utuh.

F. Data dan Analisis Data

Hasil Nanodropspektrofotometer

Sampel Nucleid Acid Unit A260 A280 260/280 260/280

Coa.c
Rb.3 Tikus 4,4 Mg/ l 0,089 0,024 3,68 0,17
Rb. 3 Merpati 48,9 Mg/ l 0,977 0,556 1,76 0,09

Hasil grafik tikus Hasil grafik merpati

 Hasil UV transmilator

Dari data diatas didapatkan hasil dimana untuk isolasi DNA darah tikus
kemurnian sebesar 3,68 l/Mg dan merpati sebesar 1,76 l/Mg yang mengindikasikan
sampel tersebut terkontaminasi.
Untuk hasil dari UV transmilator sendiri yaitu pita protein hanya terbaca pada
sumuran ke 2 dan dan 6. Sedangkan untuk sumuran milik kelompok kami tidak
terdeteksi pada sumuran
G. Pembahasan DNA
Pada uji kuantitatif dan kualitatif DNA digunakan dua sampel, yaitu darah
burung dan darah tikus. Pada praktikum ini digunkan sampel darah karena mudah
dalam mendapatkannya, dan sel darah yang digunakan adalah sel darah merah. Sel
darah merah mengandung inti atau nucleus. Menurut Andriani dan Fery (2013) DNA
dapat diisolasi dari setiap bagian mahkluk hidup yang mengandung nukleus/ inti
sel. Selain itu digunakan darah burung (unggas) dan tikus (mamalia), hal ini bertujuan
untuk membandingkan antara hasil isolasi dari kedua DNA hewan tersebut. Pada
mamalia eritrosit tidak berinti, sedangkan pada unggas dan unta, eritrosit berinti.
Eritrosit di dalam pembuluh darah tersusun bertumpuk seperti koin dan disebut
dengan istilah reuloux (Guyton, 1997).
Kedua sampel mulanya diisolasi untuk memperoleh DNA murninya untuk
kemudian di uji dan dianalisis. Setelah diperoleh DNA murni dari burung dan tikus,
selanjutnya di lakukan nanodrop spektrofotometer dengan panjang gelombang () =
260 untuk mengetahui kemurnian dari DNA kedua sampel. Berdasarkan analisis yang
telah dilakukan, hasil uji nanodrop spektofotometer dengan = 260, DNA tikus dan
DNA burung tidak diperoleh hasil. Hal ini terjadi karena kedua sampel
terkontaminasi oleh protein yan sangat banyak. Menurut () isolasi DNA hewan sering
kali terkontaminasi oleh protein, sedangkan DNA yang diisolasi dari tanaman tinggi
seringkali terkontaminasi oleh polisakarida, dan metabolit sekunder seperti tannin,
pigmen, alkaloid, dan flavonoid (Kusumawaty, 2014). Kontaminasi DNA oleh protein
yang tinggi disebabkan oleh kerusakan sampel darah yang akan digunakan hampir
mengalami aglutinasi. Selain itu dipotensikan karena pembuatan serta penambahan
larutan yang tidak sesuai dengan ketentuan sehingga tidak diperoleh DNA murni.

H. Kesimpulan
1. Sampel yang diperoleh tidak dapat terbaca karena kontaminasi tinggi oleh
protein.
2. Kerusakan sampel dapat mempengaruhi hasil dari isolasi DNA sehingga tidak
diperoleh hasil dari praktikum isolasi DNA yang disebabkan oleh kerusakan
 sampel, dan beberapa kesalahan praktikan terutama dalam penambahan
larutan.

Daftar Pustaka

Adriani, Nita L. dan Fery Prawira Gurusinga. 2013. Isolasi DNA Manusia (Epitelial
Mulut dan Darah) dan Teknik PCR dan Isolasi Protein Dari Darah,
Elektroforesis Agarose, dan SDS-PAGE. (online). (https://s3-us-west-
2.amazonaws.com). Diakses pada 29 November 2017.
Gaikwad, A.W. 2010. DNA extraction: comparison of methodologies. 6 hlm.(Online),
(http://www.nbpgr.ernet.in/Portals/6/DMX/GENOMIC_RESOURCES/DNA
%20extraction-Comparison%20of%20methodologies.pdf). Diakses 4 Desember
2017.
Guyton A. C., Hall J. E. 1997. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 9. Jakarta :
EGC. P.
Kusumawaty, Diah M.Si,. 2014. Isolasi DNA Skala Kecil (Buah, Daging, Darah,
Bakteri). UPI: Pendidikan Biologi.
Medical Genomics. 2004. What can be the source of DNA. 1 hlm. (online).
(http://www.medicalgenomics.co.uk/DNAsources.html.). Diakses 4 Desember
2017.
NCBI. 2000. Buku: An Introduction to Genetic Analysis. 7th ed. 1 hlm. (online).
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22104/).Diakses 4 Desember 2017.
Sambrook, J .E .F, Fritisch and T. Maniatis, 1989 . Molecular Cloning. A Laboratory
manual 2nd Ed . Cold Spring Harbor Laboratory Press . Analysis and Cloning
of Eukaryotic Genomic DNA, 9 .19 .
Siswanto, Jo Edy ., Berlian, Tiara ., Putricahya,Evira.,Lidya V. P, Yuniani,Luluk.
2016. Isolasi DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada Bayi
Penderita ROP: Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi dan Indeks Kemurnian.
Solomon, E. P., D. W. Martin, & L. R. Berg. 2005. Biology. 8th ed. Thomson
Corporation, Belmont, USA: 1379 hlm.