UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGA

INFORME DE PRCTICAS PRE-PROFESIONALES I y II INSTITUTO DE

BIOTECNOLOGIA (IBT) UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

(Del 18 de Enero al 04 de Marzo del 2016)

APLICACIN DE TCNICAS DE CULTIVO in vitro EN LA

MICROPROPAGACIN DE ORQUDEAS (Cattleya maxima y Phalaenopsis),
ESTEVIA (Stevia Rebaudiana) Y YUCA (Manihot esculenta) EN EL
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA, LIMA - PER

Jimnez Revilla, Romina

ASESOR:

Juan Loli Capa Robles

Nuevo Chimbote, Per

2017
 INDICE

I. INTRODUCCION ........................................................................................................ 4
II. OBJETIVOS ................................................................................................................ 7
2.1. Objetivo general..................................................................................................... 7
2.2. Objetivos especficos .............................................................................................. 7
III. DESCRIPCIN GENERAL DEL CENTRO DE PRCTICAS ....................................... 8
3.1. GENERALIDADES DEL CENTRO DE PRCTICAS .............................................. 8
3.2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 8
3.3. UBICACIN GEOGRFICA ................................................................................. 9
3.4. MISIN................................................................................................................ 9
3.5. REA DE INVESTIGACIN DE CULTIVO DE TEJIDOS: ................................... 10
IV. INSTALACIONES DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS ...................... 11
4.1. Funciones y actividades a realizar en las reas del laboratorio .................................... 12
4.1.1. rea de preparacin....................................................................................... 12
4.1.2. rea de esterilizacin .................................................................................... 20
4.1.3. rea de siembra ............................................................................................ 21
4.1.4. rea de incubacin ........................................................................................ 22
4.1.5. Invernadero de propagacin............................................................................ 24
V. DESARROLLO DE PRCTICAS ................................................................................ 25
5.1. Micropropagacin de orqudeas (Orchidaceae) ........................................................ 29
5.1.1. Etapa 0: Seleccin y preparacin de la planta madre/donante........................... 30
5.1.2. Etapa 1: Establecimiento de cultivo axnico. ................................................. 31
5.1.3. Etapa 2: Introduccin del material in vitro..................................................... 32
5.1.4. Etapa 3: Multiplicacin ............................................................................... 33
5.1.5. Etapa 4: Enraizamiento y aclimatacin ......................................................... 35
5.2. Micropropagacin de estevia (Stevia rebaudiana Bertoni) ......................................... 37
5.2.1. Etapa 0: Seleccin y preparacin de la planta madre/donante........................... 37
5.2.2. Etapa 1: Establecimiento de cultivo axnico. ................................................. 38
5.2.3. Etapa 2: Introduccin del material in vitro..................................................... 39
 5.2.4. Etapa 3: Multiplicacin ............................................................................... 40
5.2.5. Etapa 4: Enraizamiento y aclimatacin ......................................................... 40
5.3. Micropropagacin de yuca .................................................................................... 42
5.3.1. Etapa 0: Seleccin y preparacin de la planta madre ....................................... 42
5.3.2. Etapa 1: Establecimiento de cultivo axnico. ................................................. 43
5.3.3. Etapa 2: Introduccin del material in vitro..................................................... 44
VI. CONCLUSIONES ................................................................................................... 46
VII. RECOMENDACIONES ........................................................................................... 47
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................ 48
IX. ANEXOS ............................................................................................................... 53
Anexo 1. Preparacin de antibiticos................................................................................. 53
Anexo 2. Preparacin de soluciones para ajustar el pH ........................................................ 54
Anexo 3. Multiplicacin de papa (Solanum tuberosum) ....................................................... 55
I. INTRODUCCION

La biotecnologa es utilizada para resolver problemas en la produccin agrcola, las tcnicas

de cultivo de tejidos han contribuido no solo a un mejor entendimiento de los procesos de
diferenciacin celular, sino a un mejor aprovechamiento de dichos procesos en la explotacin
de recursos vegetales. Las tcnicas de cultivo in vitro pueden utilizarse para diversos
propsitos como son: mejoramiento gentico, obtencin de plantas libres de virus y otros
patgenos, conservacin de germoplasma, y micropropagacin (Roca & Mroginski, 1993).

El concepto de cultivo de tejidos o propagacin in vitro abarca tanto el cultivo asptico de

tejidos, como de clulas u rganos. Esta tcnica consiste en cultivar un inculo con
potencialidad de diferenciacin bajo condiciones aspticas, en presencia de un medio de
composicin qumica definida, incubada en condiciones ambientales controladas, con la
finalidad de obtener plantas genticamente idnticas, denominada clones, a partir de un
fragmento (explante) de la planta madre (Abdelnour & Escalante, 1994).

La propagacin sexual es una produccin a partir de los gametos femeninos y masculinos,

que a travs del proceso de polinizacin-fecundacin, se da la formacin de la semilla, la
cual da origen a una nueva planta, es decir, que la propagacin se hace por medio de semillas;
mientras que la propagacin asexual de plantas es una produccin a partir de partes
vegetativas, donde se utilizan tejidos vegetales que conserven la potencialidad de
multiplicacin y diferenciacin celular para generar nuevos tallos y races a partir de cmulos
celulares presentes en diversos rganos. Este tipo de propagacin tiene esencialmente tres
variantes, que son: 1) la micropropagacin a partir de tejidos vegetales en cultivo in vitro; 2)
la propagacin a partir de bulbos, rizomas, estolones, tubrculos o segmentos (esquejes) de
las plantas que conserven la potencialidad de enraizar, y 3) la propagacin por injertos de
segmentos de la planta sobre tallos de plantas receptivas ms resistentes (Vzquez, Orozco
& Snchez, 1997).

4
La micropropagacin es una tcnica para la propagacin vegetativa de las plantas, donde el
cultivo in vitro se convierte en una herramienta muy til en los programas de mejoramiento,
ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir
de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicacin ilimitada. En la actualidad, la
micropropagacin se practica con xito en especies hortcolas, ornamentales y leosas
(Thorpe, 1980).

Las plantas ornamentales, a pesar de no ser un producto bsico como son las frutas u
hortalizas, revisten gran importancia cultural, ambiental, social y econmica. La orqudea
(Orchidaceae), gracias a sus flores exticas, es una de las plantas de mayor demanda entre
las ornamentales, y es adems, una flor representativa y conocida en el territorio peruano.
Sin embargo, a muchas especies se les ha restado importancia en su conservacin y
propagacin como es el caso de Cattleya rex y Phalaenopsis, las cuales han sufrido maltrato
en su nicho ecolgico e incluso se le ha confundido con otras especies del mismo gnero, y
por las condiciones anteriormente mencionadas, se les considera como especies en va de
extincin (Chadwick, 2001)

La micropropagacin de las orqudeas es de inters productivo comercial, se ha demostrado

que tiene una gran eficiencia en su germinacin y desarrollo a partir de semillas o tejidos
vegetativos. Con esto, se puede mantener una produccin continua de ejemplares de calidad,
para reducir en cierta medida el saqueo de especies de sus poblaciones naturales (Lee & Lee,
1991). La micropropagacin de las orqudeas se puede dividir en dos grupos importantes,
basados en el objetivo de trabajo y la fuente del explante: micropropagacin sexual y
micropropagacin asexual; siendo la micropropagacin sexual, que se realiza por medio de
semillas, la cual asegura la variabilidad del material gentico (Kuan & Gonzlez, 1993).

La micropropagacin, adems es utilizada en plantas con potencial industrial, tal como la

Stevia rebaudiana Bertoni (estevia), debido a que contiene glucsidos diterpenos, que le
confieren propiedades edulcorantes. Adems, la planta tiene propiedades medicinales y es
usada como anticancergena, antidepresiva, antiviral, antimicrobiana, y para el control de la
hipertensin y la obesidad, que son motivo de estudios recientes (Oviedo et al., 2015).

5
La propagacin sexual de stevia es difcil debido a los bajos porcentajes de germinacin,
dificultad para cosechar la semilla y los altos grados de variabilidad gentica.
Alternativamente, se realiza la propagacin por mtodos asexuales, a travs de esquejes o
brotes laterales; pero el nmero de plntulas es limitado y hay problemas de transmisin de
enfermedades, lo que probablemente afecta la concentracin de los compuestos de mayor
inters. Por ello se realizan estudios usando nuevas estrategias de propagacin de esta especie
(Toffler & Orio, 1981).

El aumento sostenido de la demanda de alimentos podra llegar a ser tan grande, que las
tecnologas tradicionales aplicadas en la agricultura, no sern suficientes para la produccin
de alimentos, es por ello, que las nuevas tecnologas, incluido el cultivo de tejidos constituye
un medio para aumentar la productividad agrcola y garantizar la disponibilidad de alimentos
(Tewolde, Rojas & Chavarra, 2008).

Segn la Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin (FAO, 2000), la yuca
(Manihot esculenta) es considerada la cuarta fuente de energa ms importante de las regiones
tropicales del mundo, nicamente antecedida por el maz, la caa de azcar y el arroz, por lo
que es un cultivo importante por la diversidad de sus usos, ya que sus races y hojas pueden
ser utilizadas para el consumo humano o animal, as mismo de esta se pueden obtener
almidn y alcohol que pueden ser utilizados en la industria (Ceballos, 2002).

Sin embargo, la productividad del cultivo es seriamente afectada cuando se utiliza

reiteradamente el mismo material de siembra o se encuentra infectado por plagas y
enfermedades sistmicas producidas por hongos, bacterias y virus. Una alternativa en la
propagacin y conservacin de germoplasma de yuca es la utilizacin de diversas tcnicas
desarrolladas por el cultivo de tejidos, tal como el cultivo de meristemas y tratamientos de
termoterapia de estacas, termoterapia in vitro para la erradicacin de numerosas bacterias y
virus (Wasswa, Alicai & Mukasa, 2011).

6
El presente informe est basado en una serie de experiencias y conocimientos adquiridos
durante el desarrollo de las prcticas pre-profesionales I y II, en el que se plasma la
descripcin de las reas del laboratorio y los procedimientos realizados en el Instituto de
Biotecnologa - Laboratorio de Cultivo de tejidos, para el desarrollo de tcnicas de cultivo in
vitro en la micropropagacin de orqudeas (Cattleya maxima y Phalaenopsis), estevia (Stevia
Rebaudiana) y yuca (Manihot esculenta).

II. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

- Ampliar los conocimientos en las tcnicas de cultivo in vitro en la micropropagacin
de orqudeas (Cattleya maxima y Phalaenopsis), estevia (Stevia Rebaudiana) y yuca
(Manihot esculenta), en el Instituto de Biotecnologa de la Universidad Nacional
Agraria La Molina, Lima Per.

2.2. Objetivos especficos

- Identificar las reas y sus respectivas funciones del laboratorio de cultivo de tejidos
del IBT.
- Conocer el manejo de los diversos equipos necesarios para el desarrollo de la
micropropagacin.
- Definir las etapas para la micropropagacin de cultivos in vitro.
- Participar en las actividades que el centro de prcticas realice para el adecuado
desarrollo de las tcnicas de cultivo de tejidos.

7
III. DESCRIPCIN GENERAL DEL CENTRO DE PRCTICAS

3.1. GENERALIDADES DEL CENTRO DE PRCTICAS

El Instituto de Biotecnologa (IBT) de la Universidad Nacional Agraria La Molina
est a la vanguardia de la investigacin a nivel nacional y es un referente para el
desarrollo productivo del pas.

El IBT inici sus actividades en 1998, con la participacin de docentes de las

Facultades de Agronoma, Ciencias, Ciencias Forestales, Industrias Alimentarias y
Zootecnia.

La biotecnologa es un enfoque multidisciplinario por ello involucra varias

disciplinas y ciencias con la participacin de investigadores de diferentes
especialidades, esto es de suma importancia para conseguir los objetivos trazados
por el instituto. Hay muchas definiciones para describir la biotecnologa. En
trminos generales biotecnologa es el uso de organismos vivos o de compuestos
obtenidos de organismos vivos para lograr productos de valor para el hombre.

3.2. OBJETIVOS
- Contribuir a mejorar la productividad y sostenibilidad de los sistemas de
produccin, mediante la investigacin, con un enfoque integral adems de la
capacitacin de los futuros lderes en el rea de Biotecnologa.
- Lograr el mayor valor agregado local en los productos agropecuarios y forestales
mediante la generacin y adaptacin de tecnologas.
- Contribuir al incremento del valor de los recursos naturales mediante la
realizacin de estudios, inventarios y desarrollo de productos de la biodiversidad.
- Desarrollar un trabajo multidisciplinario con profesores de las facultades de
Agronoma, Forestales, Industrias Alimentarias, Ciencias y Zootecnia, en las
Tcnicas Biotecnolgicas.
- Optimizar la eficiencia institucional a nivel nacional mediante un enfoque
descentralizado de la investigacin en cooperacin con otras instituciones
nacionales e internacionales.

8
3.3. UBICACIN GEOGRFICA
El Instituto de Biotecnologa (IBT) se encuentra en la Universidad Nacional
Agraria La Molina (UNALM), ubicada en Av. La Molina s/n La Molina

Figura 1. Mapa Geogrfico de la universidad Nacional Agraria La Molina.

(Google Maps., s.f)

3.4. MISIN
El Instituto de Biotecnologa como parte de la Universidad Nacional Agraria La
Molina, tiene la misin de desarrollar programas multidisciplinarios de educacin
para estudiantes universitarios, profesionales, agricultores e industriales, quienes
impulsarn la biotecnologa y ocuparn posiciones lderes dentro de la industria e
instituciones acadmicas.

El Instituto realiza investigaciones en el campo de cultivo de tejidos, ingeniera

gentica, biologa molecular y celular, y otros campos afines en colaboracin con
los programas de investigacin de la UNALM y otras instituciones pblicas y
privadas nacionales e internacionales.

9
 Misin de Investigacin

- Misin de Transferencia de Tecnologa y Produccin.

- Misin de Informacin.
- Misin de Alianzas Estratgicas.
- Misin de Defensa de los Recursos Naturales.
- Misin de Defensa del Medio Ambiente.
- Misin de Proteccin de Invenciones Biotecnolgicas

3.5. REA DE INVESTIGACIN DE CULTIVO DE TEJIDOS:

El rea de cultivo de tejidos tiene como objetivos primordiales el desarrollo de
tcnicas de micropropagacin, variacin somaclonal, embriognesis somtica,
rescate de embriones inmaduros, mutaciones in vitro y conservacin in vitro a corto
plazo.

Tcnica: "In vitro"

El cultivo de tejidos "in vitro" consiste en la aplicacin de una serie de tcnicas que
permita lograr el mantenimiento y crecimiento de clulas y tejidos en un sustrato
donde se reproducen las condiciones necesarias para el normal desarrollo de una
planta en condiciones aspticas (Doods & Roberts, 1982)

Ventajas:

- Mantiene la identidad gentica del material propagado sin introducir

ninguna variabilidad gentica
- Propagacin clonal rpida (floricultura, fruticultura, plantas medicinales,
silvicultura)
- Eliminacin de virus (cultivo de meristemas) hibridacin o fusin somtica
(fusin de protoplastos).

10
IV. INSTALACIONES DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS

Segn Roca & Mroginski (1993) un laboratorio de cultivo de tejidos debe disponer
de un rea destinada al establecimiento, crecimiento y multiplicacin de las plantas
producidas; estas reas son especialmente necesarias en los laboratorios de
investigacion y desarrollo, y en los de produccin comercial.

El laboratorio de cultivo de tejidos del Instituto de Biotecnologa es un espacio

diseado de tal manera que permite la investigacin aplicada al desarrollo de
tecnologas utilizadas en el cultivo de tejidos, y una produccin comercial de las
plntulas de diferentes cultivos, generalmente de orqudeas (Phalaenopsis y
Cattleya) y estevia (Stevia rebaudiana) adems, yuca (Manihot esculenta), papa
(Solanum tuberosum), ajo (Allium sativum), quinua (Chenopodium quinoa), bamb
(Bambusa vulgaris), arndanos (Vaccinium myrtillus), rosas, entre otros; las cuales
son previamente seleccionadas por una caracterstica especfica y/o un valor
agregado; y donde es posible controlar y asegurar la asepsia durante todo el proceso
de multiplicacin in vitro.

En el laboratorio de cultivo de tejidos del IBT se han establecido reas separadas

para las diferentes actividades que se desarrollan en el mismo. A continuacin se
presentan las reas o secciones (Figura 2).

CUBICULO
REA
SALA DE REA DE ADMINISTRATIVA
INCUBACIN 2 PREPARACIN
REA DE
SIEMBRA
HA

SALA DE
INCUBACIN 1 REA DE INDUSTRIAS
ESTERILIZACIN ALIMENTARIA
S

Puerta Ruta de ingreso / Salida de

Pasadizo
salida emergencia

Figura 2. reas del laboratorio de cultivo de tejidos.

11
4.1. Funciones y actividades a realizar en las reas del laboratorio

4.1.1. rea de preparacin

El rea de preparacin est destinada a la preparacin de soluciones diversas, de los
medios de cultivo, as como el acondicionamiento previo del material vegetal
destinado a cultivo in vitro.

Esta rea cuenta con balanzas analticas y potencimetros, de acuerdo a Berthoul &
Berrios (1987), que afirman que la precisin de las balanzas analticas deben ser de
orden 0.0001g y la precisin del potencimetro debe ser 1/10.

El rea de preparacin de medios est equipada con una refrigeradora para

almacenar los productos qumicos y soluciones utilizadas en los medios de cultivo;
agitadores magnticos, hornos microondas para la gelificacin del agar, mesas de
trabajo para la preparacin de medios y para la dosificacin de stos en los frascos
de vidrio (Figura 3.A); y una cmara de incubacin utilizada con fines de
investigacin. Tambin incluyen vitrinas y estanteras para el almacenar materiales
de vidrio y plstico.

En esta rea tambin se encuentra una zona de lavado, el cual cuenta con un lavadero
grande (de acero inoxidable), resistente a cidos y alclisis, con agua corriente fra,
que permite realizar la limpieza de los frascos con medios usados, los cuales son
desechados en una bolsa plstica (Figura 3.B).

A B

Figura 3. rea de preparacin. A) rea de preparacin de medios de cultivo.

B)Zona de Lavado.

12
4.1.1.1. Preparacin de medio de cultivo
Los medios de cultivo utilizados para cultivo de tejidos consisten en sales
inorgnicas, vitaminas, inositol, hormonas (generalmente auxinas y/o citoquininas)
y una fuente de carbohidratos (generalmente sacarosa); los medios semi slidos
tambin contienen un agente de gelatinizacin (Instituto Iberoamericano de
Cooperacin para la Agricultura (IICA), 1993).

Por otro lado, a pesar de las condiciones de esterilidad y buen manejo, es posible la
presencia de bacterias en el medio; el uso de antibiticos puede proporcionar una
ayuda en el mantenimiento temporal de las plntulas. Los antibiticos ms utilizados
son: Rifanpicina, y cefotaxima. Su preparacin esta detallada en el Anexo 1. Es
necesario establecer los procedimientos de desinfeccin precisos para evitar el
abuso de antibiticos que daan la estabilidad gentica de la planta y alteran los
niveles de resistencia de las bacterias (Toledo, Espinoza & Golmirzale, 1998).

Son numeroso los medios de cultivo que se utilizan, con variaciones dentro de los
parmetros sealados; el ms utilizado es el medio MS (Murashige & Skoog, 1962).
En el laboratorio de cultivo de tejidos se utiliza el medio MS (Murashige & Skoog,
1962), el cual se prepar diluyendo la solucin Stock de macronutrientes,
micronutrientes y vitaminas.

- Preparacin de soluciones stock

Todas las soluciones fueron preparadas sobre un 70% de agua del volumen final
deseado, y sobre ella se fueron aadiendo uno por uno todos los componentes
hasta su completa disolucin. Posteriormente se ajustaron hasta el volumen final
con agua destilada y se almacenaron en refrigeracin.

Las cantidades utilizadas en el medio de cultivo son bastante pequeas, sera

bastante lento e impreciso tener que pesarlas cada vez que se prepara un medio,
es por ello que es una prctica habitual en el laboratorio, preparar soluciones
stock concentradas de los distintos componentes, agrupados de forma que no se
produzcan fenmenos de precipitacin.

13
Solucin Stock A: Macronutrientes

Se prepar una solucin 10X pesando cada uno de los macronutrientes (Tabla 1),
se disolvieron con una pequea cantidad de agua destilada y se afor a 1L de
solucin. Se agit y almacen en un frasco de vidrio a 4C.

Tabla 1. Macronutrientes para medio de cultivo MS.

Macronutrientes X(mg/L) X(gr/L) 10X(gr/L)

NH4NO3 1650 1.65 16.5

KNO3 1900 1.90 19
CaCl2.2H2O 440 0.440 4.4
CaCl2.6H2O* 655 0.655 6.55
MgSO4.7H2O 370 0.37 0.37
MgSO4* 180 0.18 1.80
KH2PO4 170 0.17 1.7

Solucin stock B: Micronutrientes:

Se prepar una solucin 50X pesando cada uno de los micronutrientes (Tabla 2),
se disolvieron en una pequea cantidad de agua destilada y se afor a 1L de
solucin. Se agit y almacen en un frasco de vidrio a 4C.

Tabla 2. Micronutrientes para medio de cultivo MS.

Micronutrientes X(mg/L) X(gr/L) 50X(gr/L)

MnSO4.4H2O 15.6 0.0156 0.78

MnSO4.H2O 11.8 0.0118 0.59
ZnSO4. 7H2O 8.6 0.0086 0.43
H3BO3 6.2 0.0062 0.31
KI 0.83 0.00083 0.0415
NaMoO4.2H2O 0.25 0.00025 0.0125
CuSO4.5H2O 0.025 0.000025 0.00125
CoCl2.6H2O 0.025 0.000025 0.00125

14
 Solucin stock C: Fe-EDTA

Se prepar una solucin 50X pesando cada uno de las fuentes de hierro (Tabla
3), se disolvieron en calentamiento con 200ml de agua destilada y se afor a 1L
de solucin. Se agit y almacen en un frasco de vidrio oscuro a 4C.

Tabla 3. Solucin de hierro para medio de cultivo MS

Fuente de X(mg/L) X(gr/L) 50X(gr/L)
Hierro
FeSO4.7H2O 27.8 0.0278 1.39
Na2EDTA.2H2O 37.3 0.0373 1.865

Solucin stock D: Vitaminas

Se prepar una solucin 100X pesando cada una de las vitaminas (Tabla 4),
disolvieron en 100ml de agua destilada, luego se agit y afor a 500 ml de
solucin. Se almacen en un frasco de vidrio a 4C.

Tabla 4. Stock de vitaminas para medio de cultivo MS

Vitaminas X(mg/L) 100X(mg/L)

Glicina 2 200
Ac. Nicotinico 0.5 50
Piridoxina 0.5 50
Tiamina 0.1 10
(Se disuelve en HCl)

- Reguladores de crecimiento hormonas

Existe una gran cantidad de tejidos que no crecen en un medio mnimo compuesto
de sales inorgnicas, fuente de carbono y vitaminas, sino que necesitan que se
suministre alguna sustancia reguladora de crecimiento (Roca &
Mroginski,1993).

15
Los reguladores del crecimiento son utilizados para el establecimiento y
crecimiento de los cultivos de tejidos vegetales, as como para la produccin de
metabolitos, stas se agrupan en varias categoras:

Auxinas:

En la preparacin de la solucin de auxinas, stas se disolvieron en 1 ml de

componente de solubilidad (Tabla 5). Una vez disueltas, se aadi lentamente el
agua destilada, procurando que las auxinas no precipitaran, hasta alcanzar el
volumen deseado, de acuerdo a la concentracin requerida por cada cultivo
vegetal. La adicin de auxinas en el medio de cultivo permite regular el
crecimiento, la divisin celular y la diferenciacin de races en los cultivos in
vitro (Davies, 1995).

Citoquininas:

En la preparacin de la solucin de citoquininas, stas se disolvieron en 1 ml de

componente de solubilidad (Tabla 5) y se calentaron lentamente para favorecer
la disolucin y posteriormente se agreg agua destilada hasta el volumen
deseado. La adicin de citoquininas en el medio de cultivo permite formar callos
en varias especies vegetales, aunque principalmente induce que regiones
meristemticas multicelulares se diferencien en estructuras organizadas
(Salisbury & Ross, 1994).

Segn Roca & Mroginski (1993), la proporcin entre auxinas y citoquininas

permite regular la organognesis o la desdiferenciacin, las auxinas en
concentraciones bajas estimulan la diferenciacin de races, las citoquininas en
concentraciones altas son las que favorecen el desarrollo de las yemas, inhiben
el enraizamiento; las auxinas en concentraciones medias y altas actan
sinrgicamente con las citoquininas para el desarrollo de cayos. El cido
giberlico, en niveles medios y altos, estimula la elongacin de entrenudos y
primordios foliares de meristemos. El 2,4-D como fuente de auxina, debe usarse

16
 solo para la induccin de cayos, puesto que tiende a suprimir la organognesis en
muchas plantas dicotiledneas.

Giberelinas:

La adicin de giberelinas permite regular varios procesos del crecimiento y

desarrollo como la germinacin de semillas, la elongacin de tallos, el desarrollo
de races y la floracin (Gray y Estelle, 1998).

Tabla 5. Caractersticas de los principales reguladores de crecimiento

utilizados en cultivo de tejidos.
Grupos Regulador de Abrevia Solubilidad
crecimiento tura
Auxinas cido 2,4- 2,4-D Etanol 95%
diclorofenoxiactico
cido 3-indolactico AIA 1 N NaOH - Etanol 95%
cido 3-indolbutrico AIB 1 N NaOH - Etanol 95%
cido naftalenactico ANA 1 N NaOH - Etanol 95%
Citoquininas 6-Bencilaminopurina BAP 1 N NaOH
2-isopenteniladenina 2-Ip 1 N NaOH
Kinetina Kin 1 N NaOH
Zeatina Z 1 N NaOH 1 N HCl
Giberelinas cido giberlico AG3 Etanol
Inhibitorios cido abcsico ABA 1 N NaOH

- Preparacin de medio MS (Murashige & Skoog, 1962):

La elaboracin de los medios de cultivo se realiza diluyendo las soluciones madre
previamente realizadas; adems, se aade la fuente de carbono, myo-inositol y el
agente gelificante (tabla 6), teniendo en cuenta las concentraciones de las
soluciones para calcular la cantidad a utilizar (cantidad preparada de
solucin/concentracin).

17
Muy pocos cultivos in vitro son auttrofos, por lo tanto es necesario agregar al
medio una fuente de carbono, la sacarosa (2% a 5%) es la ms utilizada, y se
puede reemplazar por glucosa y en menor medida por fructuosa, maltosa y
galactosa; sin embargo, son menos efectivas (Roca & Mroginski,1993). Adems,
la incorporacin de myo-inositol al medio, da como resultado un mejor
crecimiento de los callos y suspensiones celulares, ya que est involucrado en la
sntesis de fosfolpidos y por lo tanto de sistemas de membranas (Conger, 1987).

El carbn activado (0.1% a 5%) incorporado al medio, ha mostrado ser de utilidad

en los medios cultivo de diversos explantes, por su capacidad de absorber
metabolitos txicos (Roca & Mroginski,1993).

Tabla 6. Cantidad de componentes del medio de cultivo Basal MS

Componente Concentracin Cantidad a
utilizar para 1L
Sol. Macronutrientes 10 X 100ml
Sol. Micronutrientes 50 X 20ml
Sol. Fe-EDTA 50X 20ml
Glicina 100X 5ml
Ac. Nicotinico 100X 5ml
Piridoxina 100X 5ml
Tiamina 100X 5ml
Inositol - 100mg
Sacarosa - 30g
Agar - 7.2g

18
Descripcin de la preparacin de medios de cultivo

Para la obtencin de 1L de medio de cultivo MS (Murashige & Skoog, 1962)

se tomaron las cantidades de la tabla 6. En primer lugar se disolvieron las
soluciones stock de macronutrientes, micronutrientes, vitaminas y Fe-
EDTA en 700ml de agua destilada, luego se agreg la sacarosa, se agit hasta
disolver completamente y se afor a 1L de solucin. Posteriormente se ajust
el pH con soluciones de HCl y KOH preparadas previamente (Anexo 2),
hasta un rango de 5.7-5.8 (segn los requerimientos del cultivo).

Luego se aadi agar, se mezcl completamente y se calent en el

microondas durante 10 minutos, se agreg carbn activo y se realiz el
mismo procedimiento del agar. Se dosific en los recipientes de vidrio
limpios y se sellaron con papel aluminio para luego esterilizar en la autoclave
a 15 psi y 121C durante 20 minutos. Finalmente, los medios de cultivo
esterilizados se sellaron con parafilm para su almacenamiento.

Carbn activo (Opcional)

Figura 4. Descripcin preparacin medios de cultivo

19
4.1.2. rea de esterilizacin
En el laboratorio de cultivo de tejidos se realiza la esterilizacin con calor hmedo a
travs de la autoclave, los medios de cultivo son autoclavados a 15 psi y 121C durante
15-20 min. Los materiales de laboratorio (frascos de vidrio, pipetas, placas Petri, tubos
de ensayo, pinzas, papel, entre otros) se esterilizan en la estufa, mediante calor seco (aire
caliente) durante 2-4 horas a 180C.

Segn Roca & Mroginski (1993), el rea de esterilizacin debe tener espacio para el
autoclave vertical u horizontal, el cual puede ser pequeo (olla de presin) o grande (de
carga frontal y enfriamiento lento y rpido), el laboratorio cuenta con dos autoclaves
verticales, una manual y otra semiautomtica; sin embargo en el laboratorio la segunda
es la ms utilizada por su fcil y rpido manejo.

Al igual que los procesos de desinfeccin, la esterilizacin trmica destruye a los

microorganismos en forma gradual a medida que aumenta la temperatura, el efecto final
de la esterilizacin por calor hmedo es la desnaturalizacin y coagulacin de las
protenas; mientras que la esterilizacin por calor seco (o desecacin en general) provoca
desnaturalizacin de protenas, lesiones por oxidacin y efectos txicos por niveles
elevados de electrolitos (Rutala, 1997).

Adems, en esta rea se encuentra un pequeo lavadero con agua fra y estanteras, que
permiten almacenar los frascos de vidrio limpios, despus de su lavado.

A B

Figura 5. rea de esterilizacin. A) Estantera para frascos de vidrio. B) Autoclaves.

20
4.1.3. rea de siembra
En esta rea del laboratorio de cultivo de tejidos se realiza la escisin, inoculacin y
transferencia de los explantes a los medios de cultivo, este trabajo demanda un alto nivel
de asepsia, es por ello que se encuentran instaladas cinco cmaras de flujo laminar, stos
equipos son necesarios debido a que permiten mantener las condiciones de esterilidad
durante las operaciones de inoculacin, por medio de un filtro de alta eficacia en
filtracin de partculas (denominado HEPA), que filtra el aire del rea (de afuera) y
expulsa una presin de aire positiva hacia adentro de la cmara, dejando estril el espacio
de trabajo.

El filtro HEPA (el cual no debe ser tocado debido a su fragilidad) permite que el aire que
suavemente circula a travs de la cmara sea estril. Esto permite al tcnico abrir
libremente la cmara y realizar las transferencias de manera razonablemente segura. Sin
embargo, antes de iniciar las labores es necesario limpiar las superficies de la cmara
(mesa y paredes interiores), para esto se utiliza alcohol de 70 y todo lo que ingresa a la
cmara es necesario desinfectarlo de la misma manera.; adems, nunca debe colocarse
frascos de cultivo u otros frente del rea de trabajo ya que esto interrumpe el flujo de
aire estril, se utilizan las 3/4 partes ms internas de la cmara para trabajar y los
mecheros se coloca cerca de donde se abren los frascos de cultivo, de manera que no
tengan que permanecer abiertos por mucho tiempo. Estas prcticas le ayudarn a reducir
la contaminacin en los cultivos (Abdelnour & Escalante, 1994).

El operario es una fuente alta de contaminacin, por lo tanto durante su manejo debe
utilizar mascarilla, y no tocar el material vegetal directamente con las manos. Para ello
se utilizan pinzas y bisturs, los cuales son flameados con etanol cada vez que se utiliza.

El laboratorio de cultivo de tejidos cuenta con un filtro electrosttico que se encuentra

ubicado en el techo a la salida del aire acondicionado. Los filtros electrostticos crean
su propia carga de electricidad al unirse una malla de nylon con la malla de aluminio
formando un campo magntico, segn el principio de la electrosttica y esto hace que el
polvo sea retenido con ms eficiencia (Mafla et al., 2007).

21
El laboratorio cumple con los requerimientos de ser un rea con superficies fciles de
limpiar y desinfectar; adems cuenta con regulacin de temperatura a 20C a travs de
una unidad de aire acondicionado, con la finalidad de contribuir con la asepsia dentro de
esta rea.

Esta rea cuenta con microscopios estereoscpicos y estanteras metlicas para el

almacenamiento de materiales estriles que son utilizados durante las operaciones de
inoculacin, tal como los medios de cultivo, instrumentos de diseccin (pinzas, bistures,
agujas de diseccin, tijeras, entre otros), frascos de alcohol, mecheros, bandejas de
aluminio, papel, marcadores y parafilm.

En este ambiente tambin se realiza el sellado de los medios de cultivo esterilizados, los
cuales son almacenados en estanteras metlicas por una semana para poder utilizarse,
siempre y cuando no presenten algn tipo de contaminacin.

Figura 6. Cmaras de flujo laminar en el rea de siembra.

4.1.4. rea de incubacin

El laboratorio cuenta con dos reas de incubacin, las condiciones ambientales ptimas
cambian segn cada especie de cultivo, por lo tanto se debe tener en cuenta las
variaciones de temperatura, intensidad luminosa, humedad relativa y fotoperiodo.

22
En esta rea, la temperatura y la humedad relativa se registran mediante
higrotermgrafos. La temperatura se controla mediante un sistema de refrigeracin de
aire acondicionado, teniendo en cuenta que la temperatura promedio de un cuarto de
incubacin vara alrededor de 25C (2C).

Los cuartos cuentan con un total de 10 estanteras metlicas, cada estantera est
constituida por 4 pisos y cada piso permite la ubicacin frascos o tubos de ensayo
(Figura 7.A). Cada piso de la estantera contiene una plataforma con perforaciones para
facilitar una mejor aireacin y la altura entre cada piso es de 40 cm aproximadamente,
permitiendo una buena iluminacin a travs de lmparas fluorescentes.

A B

Figura 7. rea de incubacin. A) Estanteras metlicas con cultivos in vitro.

B)Cultivo in vitro de Solanum tuberosum (papa)

La humedad relativa es controlada por deshumificadores, que condensan la humedad

para mantener la temperatura; la humedad relativa vara entre 60-70%. Si la humedad
relativa decae bajo 50%, se producir una prdida de agua en los medios de cultivo y
la concentracin de sales minerales aumentar, en detrimento de los medios de cultivo;
en cambio, si la humedad relativa es alta (80-100%) habr posibilidad de ingreso de
contaminantes en los envases de cultivo (Toledo et al., 1998).

23
 La fuente de luz est dada por lmparas fluorescentes, tienen una buena calidad de luz,
distribuyen la luz uniformemente y emiten menos calor que las lmparas
incandescentes. Los cultivos en su mayora requieren de iluminacin que vara desde
500 a 3000 lux (Toledo et al., 1998). El fotoperiodo es controlado por cmaras de
crecimiento, los cuales regulan la intensidad lumnica (da/noche), la temperatura
diferenciada con fotoperiodo (da/noche) con rango de temperatura de trabajo de 4C
45C (luces apagadas) y 12C 45C (luces encendidas).

Los cultivos son incubados en cuartos apropiados, que proporcionan un buen control
de temperatura (20-28C), iluminacin (variable, segn las necesidades del cultivo) y
de humedad relativa (70%-80%).

4.1.5. Invernadero de propagacin

Es un rea externa al laboratorio, en donde las plantas regeneradas en el rea de
incubacin son aclimatadas y luego trasplantadas en macetas, bandejas o camas
apropiadas. Despus del trasplante las plantas son sometidas a un acondicionamiento
gradual a las condiciones de campo, lo cual se logra utilizando cmaras hmedas de
plstico (tneles).

En el invernadero del IBT, se utilizan tneles de 100 cm de ancho y 50 cm de alto, unidos

a la superficie del terreno, los cuales separan por completo el ambiente exterior de los
almcigos con los cultivos, as el volumen de aire queda encerrado en l y cada vez que
se requiere aeracin, fcilmente los tneles se pueden transportar de forma manual.

Segn Tognoni y Alpi (1999), los cultivos dentro de tneles llegan a altas temperaturas
y existe una alta condensacin de humedad; por lo tanto se pueden utilizar solo durante
ciertos periodos de desarrollo de las plantas y por muy poco tiempo.

A B

24
 Figura 8. Invernadero del IBT. A) Entrada al invernadero. B) Interior del
invernadero

V.

VI. DESARROLLO DE PRCTICAS

El proceso de micropropagacin de plantas, presenta cinco etapas principales:

- Etapa 0: Seleccin y preparacin de la planta madre/donante

Las plantas madres constituyen el material vegetal de partida y es donde se

recolectan los tejidos vegetales y, por tanto, deben ser seleccionadas
cuidadosamente. La planta madre es seleccionada por caractersticas fenotpicas
especiales y con un buen estado de crecimiento activo, es decir, vigoroso y sano.
Para obtener los explantes se mantiene a la planta madre durante unas semanas o
varios meses en el invernadero bajo condiciones controladas de luz, temperatura y
humedad (Fuster, 2014).

Segn Fuster (2014), la condicin de la planta madre influye en el enraizado de los

esquejes, por lo que hay que tener en cuenta algunas recomendaciones:

Elegir siempre ejemplares sanos, pues las plagas o enfermedades pueden

transmitirse fcilmente en las tcnicas de propagacin vegetativa.
Desechar el material que presente algn tipo de herida, ya que podra verse
atacado por hongos.
Seleccionar el material de plantas jvenes. ya que tienen ms probabilidad de
enraizar, especialmente cuando se encuentran en plena etapa de crecimiento.

25
 Regar las plantas progenitoras unas horas antes de la recoleccin de los
esquejes, para que los tejidos estn turgentes, en especial si se van a realizar
esquejes foliares.

- Etapa 1: Establecimiento de cultivo axnico.

Esta etapa consiste en la eleccin del explante (parte separada del vegetal ya sea
clulas, protoplastos, tejidos u rgano) y la desinfeccin del mismo para iniciar un
cultivo axnico (Roca & Mroginski, 1993).

Los contaminantes ms comunes son los hongos y las bacterias, pueden reducir
los coeficientes de multiplicacin, inhibir el enraizamiento y ocasionar la muerte
de la planta (Leifert, Morris, & Waites, 1994).

Antes de extraer los explantes se hace una desinfeccin de los fragmentos de planta
madre para eliminar los contaminantes externos. Los desinfectantes ms
comnmente utilizados son el hipoclorito de sodio (NaClO), hipoclorito de calcio
(CaClO), perxido de hidrgeno (H2O2), etanol y bicloruro de mercurio (HgCl2).
Terminado el tiempo de desinfeccin se realizan varios enjuagues con agua
destilada estril en cmara de flujo laminar, para eliminar los restos de los agentes
qumicos.

A B

Figura 9. Establecimiento de los cultivo axnico. A) Desinfectantes.

B) Establecimiento de yuca (Manihot esculenta Crantz)

- Etapa 2: Introduccin del material in vitro

26
 La solucin bsica ampliamente usada en diversos cultivos es el medio MS
(Murashige & Skoog, 1962), suplementado con hormonas de crecimiento
requeridos para cada medio de cultivo, se ajusta el pH y se esterilizan. Finalmente,
los medios de cultivo son trasladados al rea de siembra, para sellarlos y
almacenarlos durante unas semanas antes de su uso.

La siembra de los explantes requiere de altas condiciones de asepsia, es por ello

que este proceso se lleva a cabo en una cmara de flujo laminar, y es necesario
adoptar algunas precauciones durante su realizacin. Antes de comenzar la
actividad, los materiales utilizados como soporte y las pinzas, son esterilizados
(Abdelnour & Escalante, 1994).

Los cultivos son mantenidos en el cuarto de incubacin con condiciones

controladas de luz y temperatura. En un perodo de una semana o quince das,
comienza el proceso de germinacin o regeneracin de nuevos tejidos vegetales,
iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

A B

Figura 10. Etapa de introduccin in vitro. A) Materiales utilizados. B) Proceso de

introduccin in vitro.

- Etapa 3: Multiplicacin

27
 En esta etapa el objetivo es alcanzar un nivel de multiplicacin ptimo sin perder
la estabilidad gentica del cultivo. Para esta etapa el explante ya ha crecido y se ha
desarrollado en un grupo de microesquejes provenientes directamente del
explante. Esta masa de brotes se divide y se transplanta a un medio fresco. Este
proceso es denominado subdivisin, subcultivo o repique, y se repite
cuantas veces sea necesario (Espinal et al., 2008).

Para realizar el repique es necesario tener listos los frascos con medios y materiales
adecuados estriles, se traspasa los plantines y se coloca por separado, para que
posteriormente pueda desarrollarse la planta sin problemas. Finalmente se vuelven
a sellar los frascos y son trasladados nuevamente a sala de incubacin.

- Etapa 4: Enraizamiento y aclimatacin

Cuando las plantas han desarrollado varias hojas y un buen sistema radicular, es
posible transferirlas a un medio exterior (invernadero). Los pasos para transferir y
aclimatar las vitroplantas a condiciones externas son los siguientes:
Retirar las tapas de plstico o papel aluminio que tengan los frascos.
Retirar con mucho cuidado los plantines, tratando de no daar las races de
las plantas.
Lavar las races con abundante agua para eliminar el medio de cultivo y agar
de las races de las vitroplantas.
Sumergir las plantas completas en una solucin diluida de fungicidas durante
10 minutos.
El sustrato en el que se siembran las plntulas es estril y luego se trasfieren
a la cmara de aclimatacin (tnel) que esta acondicionado para proporcionar
una alta humedad y evitar su deshidratacin.

28
 Figura 11.Preparacin de sustrato para plantines

6.1. Micropropagacin de orqudeas (Orchidaceae)

En el laboratorio de cultivo de tejidos se utiliza tcnicas de cultivo in vitro para
germinar las semillas de orqudeas de los gneros Cattleya maxima y
Phalaenopsis. Esta tcnica es comnmente utilizada debido a que las semillas de
orqudeas no pueden germinar en un sustrato comn y su supervivencia depende
de la relacin simbitica que realizan con los hongos micorrzicos (Lecoufle,
2006).

Segn Arditti (1992), existen dos tipos bsicos de germinacin in vitro:

simbitica y no simbitica. En la germinacin simbitica, las semillas se
siembran con una pequea porcin del hongo micorriza apropiado, que coloniza
a las semillas en proceso de germinacin y se origina una relacin simbitica con
el protocormo, ya que le proporciona los nutrientes necesarios para germinar y
desarrollarse hasta que se vuelva autotrfico; sin embargo, el principal problema
es que se ha realizado poca investigacin sobre la relacin del hongo micorriza
con las orqudeas tropicales, y por lo tanto no se dispone del hongo micorriza
apropiado.

En el laboratorio de cultivo de tejidos se realiza la germinacin asimbitica,

utilizando medio MS (Murashige & Skoog, 1962), el cual es un medio complejo

29
con nutrientes orgnicos, inorgnicos y azcares en cantidades adecuadas para la
orqudea, ya que debe suplir los nutrientes que le brinda el hongo micorriza.

6.1.1. Etapa 0: Seleccin y preparacin de la planta madre/donante

La familia Orquidceae pertenece a la clase monocotiledneae que se
caracterizan por una gran diversidad de flores, colores y aromas, adems de las
interacciones ecolgicas que presentan con los agentes polinizadores y con
hongos con los cuales forman micorrizas (Lecoufle, 2006). Las orqudeas
constituyen la familia ms grande de las Angiospermas y por lo tanto la ms
diversa. El nmero de especies flucta entre 17 000 y 35 000 especies conocidas,
las cuales se agrupan en 650 a 900 gneros (Kuan & Gonzlez, 1993).
En el laboratorio de cultivo de tejidos, se realiza la micropropagacin de
orqudeas de los gneros Cattleya maxima y Phalaenopsis. Las plantas
madre/donantes reciben un cuidado especial en el invernadero, donde las
condiciones son favorables permitiendo un rpido crecimiento y abundante
floracin, para ello se consideran los siguientes factores ambientales y nutritivos:
Temperatura diurna de 13 C a 32 C y temperaturas nocturnas de 10 C a 21
C
En invernadero absorbe una gran cantidad de luz sin lesionar la planta, es
decir, reciben la luz necesaria para que las orqudeas crezcan y se tengan un
buen desarrollo.
Las plantas estn colocadas de manera ordenada y separada, lo que permite
una buena aireacin mediante movimientos constantes de aire a su alrededor.
Se utiliza musgo (facilitar aireacin y drenaje) y carbn (absorbe impurezas y
residuos de fertilizantes), los cuales son sustratos orgnicos y se
descomponen, es por ello que requiere ser cambiado cada dos semanas.

A B 30
 Figura 12. Orqudeas en invernadero del IBT. A) Phalaenopsis. B) Cattleya
mxima

6.1.2. Etapa 1: Establecimiento de cultivo axnico.

En esta etapa se seleccionaron las semillas de cpsula verde, de acuerdo a
Hartmann et al., (1997), quienes afirmaron que las semillas de orqudea se
pueden sembrar cuando la semilla se encuentra en el estado intermedio entre la
fertilizacin y la maduracin de la cpsula. En la tabla 7 que se da a continuacin
se indican los perodos de tiempo entre la fertilizacin y la madurez de diversas
especies de orqudeas.

Tabla 7. Periodo de tiempo entre la

fertilizacin y madurez de orqudeas.

Calanthe 4 meses
Cattleya 11 meses
Coelogyne 13 meses
Dendrobium 12 meses
Epidendrum 4 meses
Miltoniopsis 9 meses.
Odontoglossum 7 meses
Phalaenopsis 6 meses.

Desinfeccin de semillas de cpsula verde

Una vez seleccionadas las semillas de cpsula verde, con la ayuda de un

bistur, los restos de flor fueron removidos cuidadosamente.
Se utiliz un cepillo de dientes suave para sacudir los restos de polvo.
Se enjuagaron las cpsulas con agua corriente.

31
 Las cpsulas se sumergieron por 10 minutos en una solucin de hipoclorito
de sodio al 1% a la que se ha aadi una gota de detergente (Figura 13)
Se transfirieron las cpsulas sumergidas en la solucin a la cmara de flujo
laminar.
Se utilizaron pinzas para retirar las cpsulas de la solucin y se sumergieron
en alcohol al 100%
Cada semilla se flame hasta evaporar completamente el alcohol. Se repiti
este paso dos veces.

Figura 13. Desinfeccin de capsula en hipoclorito de sodio al 1%

6.1.3. Etapa 2: Introduccin del material in vitro

El establecimiento de los cultivos in vitro se realiz por la siembra de semillas
en un medio nutritivo slido de MS (Murashige & Skoog, 1962) modificado
(Tabla 8), sobre la cual se distribuyeron las semillas de forma uniforme, bajo un
procedimiento ya establecido:

Para la extraccin de la semilla, las cpsulas fueron transferidas a una placa

petri (esterilizada), sobre la cual se realizaron cortes longitudinalmente en la
mitad de la cpsula (Figura 14), con la ayuda de un bistur (Se utiliz una
hoja de bistur nueva en cada cpsula para prevenir la propagacin de virus.
Se tom la mitad de la cpsula con las pinzas y golpe ligeramente sobre el
medio para discernir las semillas. Se repiti este paso hasta sembrar todas

32
 las semillas y las semillas inmaduras fueron extradas de la cpsula con la
esptula.
Se aadieron unas gotas de agua en cada frasco para que las semillas se
separen y se distribuyan sobre el medio de cultivo (Tabla 8).
Los frascos fueron cubiertos con papel aluminio y sellados con parafilm.
Se llevaron a la sala de incubacin a una temperatura de 24 2 C, con un
fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad y con una intensidad
luminosa de 2500-3000 lux provista por fluorescentes de luz blanca.

Tabla 8. Medio MS modificado para introduccin in vitro de orqudeas.

Sales MS Completo
Vitaminas MS Completo
Myo-inositol 100mg
Peptona 1g
Carbn activado 2g
Sacarosa 30g
pH 5.5

Figura 14. Cortes longitudinales de la

cpsula.

6.1.4. Etapa 3: Multiplicacin

Durante la germinacin el embrin se hincha, rompiendo eventualmente la testa;
luego se agranda para formar una estructura en forma de cono denominada
protocormo. Bajo condiciones naturales el embrin permanece en este estado,
consumiendo sus reservas lipdicas, hasta ser infectado por el hongo micorrtico

33
apropiado, despus de la infeccin aparecen las primeras hojas en el pice del
protocormo y luego aparecen las races (Arditti, 1992).

Figura 15. Formacin de protocormos de orqudeas

A las cuatro semanas de la siembra, se realiz la multiplicacin, la cual se di

por hijuelos, ya que es monocotilednea, siguiendo la siguiente metodologa:
Con pinzas estriles se traspasaron los protocormos y se separaron al menos
a medio centmetro de distancia en los medios de cultivo MS (Murashige &
Skoog, 1962) modificado para la germinacin de orqudeas (Tabla 9).
Los frascos se sellaron y se llevaron nuevamente a la sala de incubacin. Se
revis constantemente para verificar que se encuentren sin contaminantes.

Tabla 9. Medio MS modificado para germinacin de orqudeas.

Sales MS 1/2x
Myo-inositol 100mg
Tiamina 1mg
Peptona 0.5g
Carbn activado 2g
Sacarosa 20g

34
 pH 5.5

6.1.5. Etapa 4: Enraizamiento y aclimatacin

Las plntulas fueron transplantadas cuando empezaron a aparecer hojas y
llenaron el frasco, se removieron los restos de protocormos, y fueron transferidas
a nuevos frascos con medio de cultivo MS (Murashige & Skoog, 1962)
modificado para crecimiento de orqudeas (Tabla 10).

Tabla 10. Medio MS modificado para crecimiento de orqudeas.

Sales MS Completo
Myo-inositol 100mg
Tiamina 1mg
Carbn activado 2g
Sacarosa 20g
pH 5.5

Segn Pedroza (2009), el uso de carbn activado en los medios de cultivo

favorece un mayor desarrollo del sistema radical en las orqudeas, porque el
oscurecimiento del medio de cultivo favorece la formacin de un mayor nmero
de races geotrpicas. Por otra parte, Pierik (1990) seala que el uso de carbn
activado como componente del medio de cultivo en algunos casos tiene un efecto
inhibidor, debido a que permite absorber diferentes sustancias tales como
hormonas vegetales y reguladores de crecimiento, adems de diversos
compuestos orgnicos e inorgnicos, contenidos tanto en el medio de cultivo
como liberados por las mismas plantas; en este caso, en los medios de cultivo no
se utilizaron hormonas de crecimiento, es por ello que el carbn activado
favoreci a la introduccin, germinacin y crecimiento de las orqudeas.

35
 Figura 16. Plntulas de orqudeas.

Una vez que las plantas se desarrollaron en los medios de cultivo in vitro y
desarrollaron completamente sus races, se trasplantaron al invernadero,
mediante la siguiente metodologa para transplantar y aclimatar las vitroplantas
de orqudeas:
Se retiraron las tapas de papel aluminio de los frascos
Los plantines fueron retirados con mucho cuidado, tratando de no daar las
races
Las races fueron lavadas con abundante agua corriente para eliminar los
restos del medio de cultivo y fueron sumergidos en una solucin diluida de
fungicidas
Los plantines se colocaron en almcigos con musgo (sustrato estril) (Figura
17.A) y se cubrieron con los tneles de plstico, con la finalidad de mantener
la humedad alta posible para evitar la deshidratacin y muerte de la plantas.
Una vez que las plantas se adaptaron a las nuevas condiciones de menor
humedad y mayor intensidad lumnica, se traspasaron a las macetas (Figura
17.B).

A B

Figura 17. Aclimatacin de orqudeas. A) Almcigos de plantines de orqudeas.

B) Traspaso de plantines a macetas.

36
6.2. Micropropagacin de estevia (Stevia rebaudiana Bertoni)
La estevia es una planta que puede propagarse por todos los sistemas de
reproduccin habituales, no obstante, la reproduccin sexual presenta ciertas
desventajas que pueden afectar de forma negativa la eficiencia del cultivo
(Surez & Salgado, 2008).

El bajo porcentaje de germinacin de sus semillas y el bajo nmero de esquejes

que se obtienen en los procesos de propagacin vegetativa son factores limitantes
para su cultivo a gran escala. La micropropagacin puede proveer grandes
cantidades de plantas genticamente uniformes; en este contexto, la propagacin
clonal in vitro de estevia ha sido descrita usando explantes como hojas,
segmentos internodales y pices; en estos procesos se ha descrito la formacin
de estructuras callosas en las plntulas micropropagadas y periodos de subcultivo
mayores a tres semanas (Sairkar et al., 2009)

En el laboratorio de cultivo de tejidos se produce masivamente plantas de estevia

en condiciones in vitro mediante el cultivo de explantes a partir de yemas axilares
y apicales.

6.2.1. Etapa 0: Seleccin y preparacin de la planta madre/donante

Stevia rebaudiana Bertoni es una planta perenne, semi-arbustiva perteneciente a
la familia Asteraceae, originaria del noreste paraguayo, en los lmites con Brasil,
donde crece en estado silvestre, sus hojas contienen edulcorantes, estevisidos y
rebaudisidos, que se estima poseen un poder endulzante que vara de 100 a 400
veces mayor que la sacarosa (Soto & Del Val, 2002).

Las plantas madre reciben un cuidado especial en el invernadero (Figura 18),

donde las condiciones son favorables permitiendo un rpido desarrollo y
crecimiento, para ello se consideran los siguientes factores ambientales y
nutritivos:
La temperatura del invernadero se encuentra en el rango ideal para la estevia,
la cual est entre 15C - 30C, con un promedio de 24C.

37
 En invernadero absorbe una gran cantidad de luz sin lesionar la planta, es
decir, reciben la luz necesaria para su crecimiento y un buen desarrollo.
Se realizan riegos diarios por aspersin
La estevia es una planta de tierra cida, es por ello que se utiliza abono
orgnico con pH inferior a 7, tal como la turba, para ello se mezclaron dos
partes de turba y una de arena en las macetas.
Se realiza podas para estimular el brote de yemas axilares que darn lugar a
ramas tempranas, consiste en cortar el pice o yema terminal de la plntula,
dejando como mnimo tres o cuatro pares de hoja.
Las plantas estn colocadas de manera ordenada y separada, lo que permite
una buena aireacin mediante movimientos constantes de aire a su alrededor.
Se realiza una ciudadosa seleccin de las plantas ms vigorosas y lo ms
dulces posibles.

Figura 18. Estevia en el invernadero.

6.2.2. Etapa 1: Establecimiento de cultivo axnico.

Los explantes fueron colectados a partir de plantas en estado de desarrollo
vegetativo del invernadero, se seleccionaron esquejes (segmentos de brotes
jvenes) de 1.0-2.0 cm con yemas apicales y axilares.
Desinfeccin de explantes
Los explantes se enjuagaron con abundante agua corriente, fueron desinfectados
superficialmente con 1% hipoclorito de sodio por 15 minutos. Se transfirieron
los explantes sumergidos en la solucin a la cmara de flujo laminar y se
enjuagaron tres veces con agua estril.

38
6.2.3. Etapa 2: Introduccin del material in vitro
En condiciones aspticas los explantes se cortaron en segmentos de
aproximadamente 1 cm y se colocaron 10 explantes en cada recipiente con el
medio MS (Murashige y Skoog, 1962) modificado para introduccin in vitro de
estevia (Tabla 11). Previo a la esterilizacin en autoclave, el pH se ajust a 5.8.
Posteriormente, se incubaron durante 28 das a 26 1C con fotoperiodo de 16
horas de luz y 8 horas de oscuridad, tomando en cuenta que despus de 2 semanas
se cambi a un medio fresco de la misma formulacin.
Tabla 11. Medio MS modificado para introduccin in vitro de estevia
Sales MS Completo
Vitaminas MS Completo
Myo-inositol 100mg
Sulfato de adenina 20mg
AIA 0.005mg
Sacarosa 30g

Romero et al. (2005), para la induccin a callognesis usaron diferentes

combinaciones de fitorreguladores: BAP 2.5 y 3.0 mg/ml y ,4-D en intervalos de
1.0 y 1.5 mg/ml; y para la induccin a brote usaron diferentes combinaciones de
ANA en concentraciones de 0.5 y 1.0 mg/ml y 2,4-D en concentraciones de 1.0
y 1.5 mg/ml. Sin embargo, en el laboratorio de cultivo de tejidos se utiliz la
auxina AIA y sulfato de adenina.
La composicin de los medios de cultivo es importante en el proceso de
regeneracin de brotes por organognesis, el sulfato de adenina tiene un rol
importante en la regeneracin de brotes de algunos cultivos, debido a que tiene
actividad de citoquinina. La adenina estimula los procesos de embriognesis
somtica y callognesis, incrementa el crecimiento de pices meristemticos,

39
induce la proliferacin de brotes axilares y promueve la formacin de yemas
adventicias formadas indirectamente desde callos o directamente desde el
explante (George, Hall & Geert-Jan, 2008). Es por ello, que en la etapa de
multiplicacin de estevia, tambin es posible utilizar un medio de cultivo con la
misma composicin que para la introduccin in vitro.

6.2.4. Etapa 3: Multiplicacin

Despus de la etapa de induccin, los explantes con brotes que crecieron de las
yemas apicales (figura 19) fueron subcultivados en el medio de cultivo MS
(Murashige & Skoog, 1962) utilizado en la etapa 2 (Tabla 11). Los cultivos
fueron mantenidos en el cuarto de incubacin a 26 1C con fotoperiodo de 16
horas de luz y 8 horas de oscuridad.

Figura 19. Brotes de Stevia (Stevia rebaudiana).

Romero et al. (2005) afirman que la adenina y la adenosina tienen actividad

citoquinina, y se aaden al medio de cultivo con el fin de mejorar el crecimiento
o reforzar la respuesta que normalmente se atribuyen a la accin de la citoquinina.

6.2.5. Etapa 4: Enraizamiento y aclimatacin

Los tallos multiplicados fueron subcultivados en un medio de cultivo MS
(Murashige & Skoog, 1962) modificado para crecimiento de estevia (Tabla 12),
suplementado con auxinas ANA y AIA para favorecer al enraizamiento y el
crecimiento.

40
 Tabla 12. Medio MS modificado para crecimiento de estevia.
Sales MS 1/2x
Myo-inositol 100mg
Tiamina 1mg
ANA 20mg
AIA 30mg
Sacarosa 20g
pH 5.5

Los tallos enraizados in vitro y que desarrollaron sus races, se trasplantaron al

invernadero, mediante la siguiente metodologa para trasplantar y aclimatar las
vitroplantas de estevia:
Se retiraron las tapas de papel aluminio de los frascos
Los plantines fueron retirados con mucho cuidado, tratando de no daar las
races
Las races fueron lavadas con agua corriente para eliminar los restos del
medio de cultivo
Los plantines se colocaron en almcigos con turba (sustrato estril) (Figura
20.A) y se cubrieron con los tneles de plstico, con la finalidad de mantener
alta la humedad y evitar la deshidratacin de la plantas (Figura 20.B).
Una vez que las plantas se adaptaron a las nuevas condiciones de menor
humedad y mayor intensidad lumnica, se traspasaron a las macetas.

Figura 20. Aclimatacin de estevia. A) Almcigos de estevia. B) Tneles de

plstico.

41
6.3. Micropropagacin de yuca
Los agricultores han perpetuado el cultivo de la yuca mediante la propagacin
vegetativa utilizando semillas asexuales (estacas o pedazos de tallos) en
plantaciones repetidas lo que constituye un riesgo, debido a que es posible
diseminar plagas y enfermedades, principalmente organismos sistmicos (virus
y micoplasmas), constituyendo una de las principales limitantes en los
rendimientos y la expansin del cultivo (Albarrn & Fuchs, 2003).

Se puede propagar tambin, de forma sexual a partir de semilla verdadera

(semilla sexual botnica), pero esta tiene el inconveniente de segregacin, ya que
esta especie es heterocigtica y algama (Ceballos, 2002).

En el laboratorio de cultivo de tejidos se aplicacin de las tcnicas de cultivo in

vitro, que se basa en el aislamiento de una porcin de tejido de la planta, la cual
es cultivada bajo condiciones aspticas, en un medio de cultivo de composicin
definida, esta ofrece mltiples ventajas, entre ellas, se recupera el vigor y la
productividad de las plantas, y a su vez, contribuye a la produccin de semilla de
alta calidad, libre de virus y de cualquier otro patgeno (Albarrn & Fuchs,
2003).

6.3.1. Etapa 0: Seleccin y preparacin de la planta madre

Los esquejes utilizados en el proyecto fueron obtenidos de una plntula de Yuca
(Manihot esculenta), ubicada en el rea de Races y tuberosas de la Universidad
Nacional Agraria La Molina.

Las plantas madre no se encontraba dentro de un invernadero, pero era una planta
vigorosa y sana que estaba en condiciones favorables para su desarrollo y
crecimiento, considerando los siguientes factores ambientales y nutritivos:
Sustrato con un pH entre 6 y 7, que contaba con un buen drenaje.
La planta se encontraba libre de enfermedades y plagas, tal como araas,
mariquitas, cochinillas, insectos de caparazn marrn, entre otros.

42
 La plntula no se poda, slo se cortan las hojas basales que poco a poco se
desecan, para evitar que se conviertan en vehculo de enfermedades
parasitarias.

Figura 21. Plntula de yuca

6.3.2. Etapa 1: Establecimiento de cultivo axnico.

La recoleccin de explantes se realiz cortando en la parte area de la planta
segmentos de tallo de aproximadamente 20 cm de largo con yemas axilares, a los
segmentos de tallos se les eliminaron las hojas (Buechsel, 2012) (Figura 22.A).
Desinfeccin de explantes
Los tallos con yemas axilares se colocaron en hipoclorito de sodio 4% y tween
20 durante 40 minutos (Figura 22.B) y se enjuagaron con agua destilada.
En la cabina de flujo laminar, con el uso de pinzas estriles, se sumergieron los
tallos en hipoclorito de sodio 4% durante 10 minutos y se enjuagaron con agua
destilada estril.

43
 A B

Figura 22. Establecimiento de cultivo axnico de yuca. A) Explantes.

B) Desinfeccin de explantes.

6.3.3. Etapa 2: Introduccin del material in vitro

Se realiz la introduccin in vitro, una vez que el medio de cultivo fue madurado
por 3 das (es decir que no presentaba contaminantes y estaba apto para su uso).
Con el uso de pinzas y bistures estriles se cort el tallo en pequeas divisiones
y se extrajeron las yemas. Estas se sembraron sobre los puentes del medio de
cultivo lquido MS (Murashige y Skoog, 1962) modificado para introduccin in
vitro de yuca. Finalmente cada tubo de ensayo, se sell y se coloc en el cuarto
de incubacin a una temperatura de 22 C, con un rango de humedad relativa de
70% a 80%. La intensidad de la luz fue de 1800 Lux con un fotoperodo de 16
horas luz procendente de lmparas fluorescentes de 75 W y ocho horas de
oscuridad.

Tabla 13. Medio MS modificado para introduccin de yuca.

Sales MS Completo
Vitaminas MS Completo
Myo-inositol 100mg
BAP 0.040mg
Sacarosa 20g
pH 5.8

44
Figura 23. Introduccin in vitro de yuca. A) Extraccin de yemas. B) Siembra
en puentes de medio de cultivo.

No se realiz la Etapa 3 y 4, debido a la falta de tiempo, pero se pudieron observar

los primeros resultados, no se present ningn medio contaminado a la semana
de la introduccin in vitro y cada yema comenz a presentar pequeos brotes.

Figura 24. Resultados de introduccin in vitro de yuca.

45
VII. CONCLUSIONES
- Se logr ampliar los conocimientos en las tcnicas de cultivo in vitro en la
micropropagacin de orqudeas (Cattleya maxima y Phalaenopsis), estevia y
yuca, en el Instituto de Biotecnologa de la Universidad Nacional Agraria La
Molina, Lima Per.

- Se identificaron las reas de preparacin, esterilizacin, siembra, incubacin, con

sus respectivas funciones del laboratorio de cultivo de tejidos del IBT.

- Se conocieron las caractersticas, funciones y tcnicas de manejo de los equipos

en cada rea, que son importantes para el desarrollo de la micropropagacin.

- Se realizaron las etapas para la micropropagacin de cultivos in vitro, lo cual

permiti conocer la base cientfica de las metodologas utilizadas en el
laboratorio de cultivo de tejidos.

- Se particip en las actividades realizadas en el laboratorio de cultivo de tejidos

en el laboratorio y en el invernadero, lo cual permiti un adecuado desarrollo de
las tcnicas de cultivo de tejidos.

46
VIII. RECOMENDACIONES

- Segn Kopowitz & Thornhill (1994), una alternativa para la conservacin de

germoplasma de orqudeas ha sido el almacenamiento de las semillas a
temperaturas bajo cero, entre -40 y 10C; la posibilidad de congelar y
descongelar semillas de orqudeas sin que estas pierdan su viabilidad ha sido
repetidamente demostrada con muchas orqudeas, casi todos los estudios
demuestran que las semillas pueden germinar luego del almacenamiento a
temperaturas bajo cero.

- En el laboratorio de cultivo de tejidos, para la micropropagacin de orqudeas se

realiza la germinacin asimbitica, recomendara realizar investigaciones de la
relacin entre las orqudeas y los hongos micorriza, realizar un estudio gentico
stos organismos simbiontes. Adems, es posible aislar hongos micorriza a partir
de la raz de orqudea (Mungua, Gomez & Olalde, 2008), con la finalidad de
establecer un medio de cultivo enriquecido y mejorar la estrategia de propagacin
de las orqudeas convencional.

- Actualmente, existen investigaciones sobre sistemas de propagacin masiva de

stevia, a travs de sistemas de inmersin temporal mediante RITA y sistemas de
inmersin permanente en biorreactor de burbujeo (Etienne & Berthouly, 2002);
recomendara implementar un sistema de inmersin en la micropropagacin, con
la finalidad de automatizar y optimizar el proceso de produccin de plntulas de
stevia.

47
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Abdelnour, A. & Escalante, V. (1994). Conceptos bsicos de cultivo de tejidos
vegetales. 1ra ed. Costa Rica: Centro Agronmico de Investigaciones y
Enseanza, pp.38.

Albarrn, J., & Fuchs, M. (2003). Seminarios CENIAP. Recuperado el 09 de

Febrero de 2016, de Propagacin clonal rpida de variedades comerciales
de yuca mediante tcnicas biotecnolgicas.:
www.ceniap.gov.ve/ceniaphoy/articulos/n3/texto/albaran.htm

Arditti J. (1992). Fundamentals of orchid biology. 1ra ed. New York: John Wiley
& Sons.

Berthoul, M. & Berrios, A. (1987). Tecnologa del cultivo de tejidos de caf (coffea
arabica). 1era Ed. Costa Rica., pp.8-15.

Buechsel, C. (2012). Establecimiento in vitro de yuca (variedad valencia)

mediante domos meristemticos y evaluacin de tres medios de cultivo
para la produccin de brotes. Zamorano, Honduras: Departamento de
ciencia y produccin agropecuaria .

Ceballos, H. (2002). La yuca en Colombia y el Mundo: Nuevas perspectivas para

un cultivo milenario. En: La yuca en el tercer milenio: Sistemas modernos
de produccin, procesamiento, utilizacin y comercializacin. Publicacin
CIAT. Cali, Colombia, pp. 1-13.

Chadwick, A. (2001). Cattleya quadricolor, stepchild of the Mountain

Marshes. Orchids, the American Orchid Society Magazine, pp. 1156-1161.

Conger, B. (1987). Cloning agricultural plants via in vitro techniques. 1ra ed.
Florida: CRC Press, pp.273. 5-166.

Davies P. (1995) Plant hormones: physiology, biochemistry, and molecular

biology. Kluwer Academic Publishers, London, pp. 67

48
Doods, J. & Roberts, L. (1982). Experiments in plant tissue culture. 1ra ed.
Cambridge: Cambridge University Press, pp.78-82.

Espinal, D., Delvalle, W., Cifuentes, E. & Ramia, N. (2008). Propagacin in vitro
de Stevia rebaudiana B. a partir de segmentos nodales. Latin America
Journals. 47(2), pp 11-18.

Etienne, H. & Berthouly, M. (2002). Temporary inmersion system in plant

micropropagation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 69, pp. 215-231.

Fuster, M. (2014). Produccin de plantas y tepes en vivero. 1ra ed. Madrid: Bubok
publishing.

George, E., Hall, M. & Geert-Jan, D. (2008). Plant Growth Regulators II:
Cytokinins, their Analogues and Antagonists. 1ra ed. Springer, pp. 205-
226.

Google. (s.f.). [Mapa Geogrfico de la universidad Nacional Agraria La Molina,

Lima, Per en Google Maps]. Recuperado el 20 de Julio, 2016, de:
https://www.google.com.pe/maps/place/Agrarian+University+of+La+Mol
ina/@-12.0841786,-
76.9544935,14.75z/data=!4m5!3m4!1s0x9105c71de6ce7161:0xf97cacf6f
3970bcc!8m2!3d-12.0828754!4d-76.9455815?hl=en&hl=en

Hartmann, T., Kester, D., Davies, F. & Geneve, R. (1997). Plant propagation. 1ra
ed. Upper Saddle River: Prentice Hall International.

Instituto Iberoamericano de Cooperacin para la Agricultura (IICA)

(1993). Agricultura, Biotecnologa y propiedad intelectual. San Jos:
Surez, F., pp.32-36.

Kopowitz, H. & Thornhill, A. (1994) Gene Banking and Orchid Seeds. American
Orchid Society Bulletin. 64(2), pp. 1383-1386

49
Kuan, C. & Gonzlez, L. (1993). Introduccin al cultivo y manejo de las
orqudeas. San Jos, Costa Rica.: Instituto Nacional de Aprendizaje, pp.47-
76.

Lecoufle, M. 2006. Orqudeas. 1ra ed. Barcelona: Omega. pp. 160.

Lee, J. & Lee, H. (1991). Micropropagacin de orqudeas a partir de semillas.

Boletn informativo de FIRA XXIV, 2, pp.15-30.

Leifert, C., Morris, E., & Waites, M. (1994). Ecology of microbial saprophytes
and pathogens in tissue and field grown plant: Reasons for contaminations
problems in vitro. Critical Reviews in Plant Sciences, 13(2), pp.139-183.

Mafla, G., Roa, J., Aranzales, E., & Debouck, G. (2007). Manual de
procedimientos para la conservacin in vitro del germoplasma del gnero
Manihot. CIAT.

Mungua, P., Gomez, S. & Olalde, V. (2008). Aislamiento de hongos micorricicos

de raz de orqudeas originarias del soconusco, Chiapas. Licenciatura.
Universidad Autnoma de Quertaro.

Murashige, T. & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, pp. 473-
497.

Nitsch, J. & Nitsch, C. (1957). Auxin-Dependent Growth of Excised Helianthus

tuberosus Tissues. II. Organic Nitrogenous Compounds. American Journal
of Botany, 44(6), pp.550-564.

Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin (FAO) (2000). La

economa mundial de la yuca: hechos, tendencias y perspectivas. Italia,
pp.60.

Oviedo, D., Alvarenga, S., Evangelista, S., Seplveda, G. & Rodrguez, M. (2015).
Micropropagacin de Stevia rebaudiana Bertoni, un Cultivo Promisorio

50
 para Mxico. Sociedad mexicana de Biotecnologa y Bioingeniera, 19(2),
pp.14-27.

Pedroza, J. (2009). Efecto del carbn activado, cido indolactico (AIA) y bencil
amino purina (BAP) en el desarrollo de protocormos de Epidendrum
elongatum Jacq bajo condiciones in vitro. Revista Colombiana de
Biotecnologa, 11(1), pp.17-32.

Pierik, R. (1990). Cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid: Mundi

Prensa.

Roca, W. & Mroginski, L. (1993). Cultivo de tejidos en la agricultura:

fundamentos y aplicaciones. 1ra ed. Cali: CIAT, pp.128-138.

Romero, C., Ros, A., Cabrera, S., Rosas, M., Carbajal, J. & Martnez, A. (2005).
Cultivo in vitro de Stevia rebaudiana B. Licenciatura. Universidad
Autnoma de Puebla. Puebla, Mxico.

Rutala W. (1997). Disinfection, sterilization and waste disposal. Baltimore:

Williams and Wilkins. California, pp.539-93.

Sairkar, P.; Chandravanshi, M.; Shukla, N.; & Mehrotra, N. (2009) Mass
production of an economically important medicinal plant Stevia
rebaudiana using in vitro propagation techniques. Journal of Medicinal
Plants Research. 3(4):266-270

Salisbury, F. & Ross, C. (1994) Fisiologa Vegetal. Grupo Editorial Iberoamrica

S.A., Mxico, 759 p.

Soto, A. & Del Val, S. (2002). Extraccin de los principios edulcorantes de la

Stevia rebaudiana. Revista de Ciencias Agrarias y Tecnologa de los
Alimentos, 20(1), pp.5-9

Surez, I. & Salgado, J. (2008). Propagacin in vitro de stevia rebaudiana bert.

(Asteraceae-eupatorieae) a travs de organognesis. International

51
 Information System for the Agricultural Science and Technology, pp.40-
48.

Tewolde, A., Rojas, E. & Chavarra, A. (2008). La agrobiotecnologia en America

Latina y el Caribe. Edicin 2. San Jose: Instituto Interamericano
Cooperacin para la Agricultura (IICA), pp.10-20.

Thorpe, T. (1980). Organogenesis in vitro: structural, physiological, and

biochemical aspects. International Review of Cytology, 11, pp.71-111.

Toffler, F. & Orio, A. (1981). Acceni sulla piata tropicale Kaa-he-e ou dolce.
Sciences des Aliments, 4, pp. 225-230.

Tognoni, F. & Alpi, A. (1999). Cultivo en invernadero: Actual orientacin

cientfica y tcnica. 3ra ed. Madrid: Cerisola C., pp.15-30.

Toledo, J., Espinoza, N. & Golmirzale, A. (1998). Cultivo de tejidos: Manejo de

plntulas in vitro en la produccin de semilla de papa. 1era ed. Lima:
Centro internacional de la papa, pp.2-10.

Vzquez, C.; Orozco, A. & Snchez, M. (1997). La reproduccin de las plantas:

semillas y meristemos. 1ra ed. Mxico D.F.: Fondo de cultura econmica.

Wasswa, P., Alicai, A. & Mukasa, S. (2011). Optimisation of in vitro techniques

for cassava brown streak virus elimination from infected cassava clones.
African Crop Science Journal. 18(4).

52
X. ANEXOS

Anexo 1. Preparacin de antibiticos

Metodologa de Toledo et al. (1998):

Rifampicina (Rimactan 300)

- Cortar pequeos crculos de papel filtro (10 mm x 10 mm).

- Colocarlos en una placa petri y esterilizarlos.
- En la cmara de flujo laminar, colocar con una pinza cuidadosamente los crculos
sobre la superficie de placas petri estriles, ligeramente separados unos de otros.
- Disolver una cpsula de Rimactan (300 mg) en 150 ml de agua destilada y
esterilizar con ltros de 0.22 m.
- Colocar 3 gotas en cada crculo.
- Dejar secar el antibitico en la cmara de ujo laminar.
- Conservar los crculos en placas petri, cubiertas y cerradas con parafilm a 4C.

Cefotaxima Sdica (Clafofian)

- Cortar pequeos crculos de papel ltro (5 mm x 5 mm).

- Colocarlos en una placa petri y esterilizarlos.
- En la cmara de flujo laminar, colocar con una pinza cuidadosamente los crculos
sobre la supercie de placas petri estriles, ligeramente separados unos de otros.
- Preparar una solucin del antibitico disolviendo 1g Claforan en 25 ml de agua
destilada estril en un frasco erlenmayer y esterilizar con filtros de 0.22 m
- En la cmara de flujo laminar, colocar una gota de aproximadamente 0.03 ml en
cada crculo.
- Dejar secar el antibitico en la cmara de flujo laminar.
- Conservarlos en placas petri, cubiertos y cerrados con paralm y mantener a 4C.

53
Anexo 2. Preparacin de soluciones para ajustar el pH

Metodologa de Toledo et al. (1998):

Solucin para bajar el pH - cido clorhdrico 1N (HCl)

- Colocar en un vaso 91.4 ml de agua destilada.

- Es necesario utilizar mascarilla y guantes para protegerse de los vapores cidos, al
momento de extraer con una pipeta cido clorhdrico (8.6 ml) comercial
- Homogeneizar y conservar en un frasco de boca ancha cerrado a temperatura
ambiente.
Solucin para elevar el pH - Hidrxido de potasio 1N (KOH)

- Colocar en un vaso 50 ml de agua destilada.

- Aadir 5.6 g de KOH y disolver bien.
- Aforar a 100 ml con agua destilada y conservar en un frasco de boca ancha cerrado
a temperatura ambiente.
Usos

De acuerdo al pH del medio, aadir gota a gota las soluciones hasta llegar al pH
requerido.

54
Anexo 3. Multiplicacin de papa (Solanum tuberosum)

La multiplicacin se realiz por microesquejes, ya que es dicotilednea. Con pinzas

y bistures estriles se cortan los esquejes a lo largo del tallo de las plntulas in vitro,
eliminando el pice del tallo y la raz, luego se traspas a medios de cultivo MS
(Murashige & Skoog, 1962) modificado para la multiplicacin de papa (Solanum
tuberosum). Los esquejes de cultivan durante 15 a 23C y 16 horas de fotoperiodo.

A B

Figura 25. Multiplicacin de papa (Solanum tuberosum). A) Brotes de plntulas

de papa. B) Multiplicacin a travs de esquejes.

55