REACCIN ENZIMTICA EN MEDIO HOMOGNEO Y EN MICELAS
INVERSAS DE AOT. EFECTO DEL CONFINAMIENTO
E. SETIEN, J. J. SILBER, N. M. CORREA, F. MOYANO
Departamento de Qumica, Universidad Nacional de Ro Cuarto, Ro Cuarto, Crdoba, CP 5800, Argentina.
fmoyano@exa.unrc.edu.ar
INTRODUCCIN
Las micelas inversas son agregados que se obtienen
disolviendo molculas de surfactantes en un solvente
orgnico no polar. Su estructura es tal que los grupos
cabezas polares del surfactante constituyen el corazn
polar del agregado mientras que las colas
hidrocarbonadas se extienden hacia la solucin orgnica
no polar. Dentro de los surfactantes capaces de formar
micelas inversas se destacan el aninico dioctil
sulfosuccinato de sodio (AOT).1 La cantidad de solvente
polar disuelta en una micela inversa se la define con el
parmetro Ws = [Solvente Polar]/[Surfactante]. Desde
hace unos aos2 se ha comenzado ha encapsular
solventes polares tales como: dimetil sulfoxido (DMSO),
etilen glicol (EG), formamida (FA), glicerol (Gly),
propilen glicol (PG), dimetilformamida (DMF),
dimetilacetamida (DMA).
Estos sistemas organizados son llamados micelas
inversas no acuosas. El solvente polar, es acomodado en
el centro polar del agregado donde se forma una gota o
"laguna polar", de forma esfrica rodeada por el
surfactante. De esta manera, las micelas inversas ofrecen
la posibilidad de disolver diferentes enzimas en su
corazn polar y/o modificar el microambiente (mezcla de
solventes polares) con lo cual traer aparejado un cambio
en la actividad cataltica y/o estabilidad de las mismas.3
Por tal motivo, estudiar reacciones qumicas enzimticas
en las micelas inversas como medios de reaccin y
determinar los parmetros cinticos de inters (eficiencia
cataltica, Kcat/ KM) reviste de gran importancia para
poder potenciar aplicaciones en la catlisis micelar.4
Al disolver el sustrato en micelas inversas, el mismo
puede repartirse entre las micelas y el solvente orgnico
polar. Con lo cual, existe una particin que modifica la
concentracin efectiva del sustrato que debe ser tenida en
cuenta para determinar los parmetros cinticos de
inters. Adems, para poder comprar la eficiencia
cataltica de las micelas con el medio homogneo, es
necesario determinar la particin del sustrato sin la
presencia del surfactante. Es decir, determinar la
particin del solvente o mezcla de solvente encapsulado
con el solvente orgnico no polar.
Se mostrarn los resultados obtenidos de la reaccin
enzimtica tanto en medio homogneo como medio
micelar, determinando la eficiencia cataltica de ambos
medios de reaccin.
METODOLOGA
Todos los solventes utilizados (dimetil sulfoxido,
DMSO y heptano, Hp) son de calidad HPLC, Sintorgan.
El agua utilizada es ultrapura y se la obtuvo de un equipo
Labonco 90901-01. El sustrato de estudio es el Benzoil-
Tirosina-p-nitroanilida (Bz-Try-pNA) compradas en
Sigma-Aldrich. El surfactante utilizado fue el 1,4-bis (2-
etilexil) sulfosuccinato de sodio (AOT). Se lo seco al
vaco, con P 2 O 5 en un desecador durante dos das. La
enzima utilizada es la -Chymiotrypsin obtenida de
pncreas bovino, Sigma y se obtuvo comercialmente.
Las experiencias de absorcin fueron realizadas en un
UV-visible: Hewlett- Packard HP 8453 a 25,0 C. El
paso ptico utilizado en las experiencias de absorcin fue
de 1 cm.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Se estudio la siguiente reaccin de hidrlisis
enzimtica, empleando la enzima -chymiotrypsin (-
CT) y el sustrato benzoil-Tirosina-p-nitroanilida (Bz-
Try-p-Na) en diferentes medio. Se trabajo en medio
homogneo y en micelas inversas de AOT.
O O
C C NH2
NH
-CT NH
HO CH2 CH C NH NO2 HO CH2 CH C OH +
O
H2O-DMSO
O NO2
Bz-Try-pNA pNA
a) Estudio en medio homogneo
Como la solubilidad del sustrato en DMSO es
elevada, se trabajo con diferentes composiciones de
mezclas de agua-DMSO (20%, 30%, 50%), con el fin de
determinar cual es el rol que cumple el solvente orgnico
polar en la catlisis enzimtica.
La Figura 1 muestra los perfiles de los espectros de
absorcin y el avance de la reaccin en la mezcla 20% de
agua-DMSO. De la Figura1 puede observarse que existe
un punto isosbestico a = 345 nm evidenciando la
ausencia de intermediarios o productos de
descomposicin en la reaccin. La banda que aparece a
= 386 nm es la correspondiente al producto de hidrlisis
p-NA. Se emple el mtodo de la velocidad inicial y el
modelo de Michaelis-Menten para determinar la
eficiencia cataltica (K cat / K M ), en la mezcla. En la Tabla
1, se muestran los datos de la eficiencia cataltica
corregida (K cat / K M ) corr por la particin del sustrato entre
el solvente polar (agua-DMSO) y el solvente orgnico no
polar (heptano). Dicha eficiencia corregida permite ser Si bien los datos cinticos pueden ser tratados
comparada con la que se determinar en las micelas mediante el mecanismo de Michaelis-Menten, es preciso
inversas de AOT. hacer notar que existe un equilibrio de particin del
sustrato (Bz-Try-p-NA) entre la micela y el solvente
externo no polar que modifica la concentracin efectiva
Tiempo(seg)
0
del sustrato en la reaccin y debe ser tenida en cuenta.
0,25 180
360 k1 kcat
540

0,20
720
1080
E + S E- S E + P
1260
1440
k-1
Absorbancia

1800
2160
0,15 2340 Kp
[p-NA]
0,10 SHeptano
Se determin la constante de particin para ambos
0,05
sistemas y se aplic el mtodo de las velocidades
iniciales. Mediante los datos experimentales obtenidos al
0,00
250 300 350 400 450 500 variar la concentracin de los sustratos en los distintos
(nm)
medios estudiados, se determin la constante de
velocidad cataltica (kcat), la constante de Michaelis -
Figura 1. Espectros de absorcin de la Bz-Try-p-NA con Menten (KM) y la eficiencia cataltica de la enzima (kcat
el balance de la reaccin. [-CT] = 1x10-6 M. [Bz-Try-p- / KM). Similar a lo realizado en medio homogneo, se
NA] = 1x 10-5 M. vali de la constante de particin para determinar
correctamente la eficiencia cataltica de la enzima (kcat /
Tabla 1. Eficiencia cataltica K cat / K M de la enzima en KM) corr . La misma se muestra en la Tabla 1.
medio homogneo y en micelas inversas de agua- A diferencia de lo que ocurre en medio homogneo,
DMSO/AOT/heptano. a,b valores de kp correspondiente fue posible determinar la eficiencia cataltica al 50 % de
al medio homogneo y medio micelar, respectivamente. mezcla. Ms an, este valor obtenido es similar al
% Kp (K cat / (K cat / K M ) corr obtenido cuando se encapsula agua-DMSO al 20% en
agua- K M ) corr en medio micelas inversas AOT. Al parecer, la enzima no estara
DMSO en medio micelar inhibida por la presencia del DMSO. Es posible pensar,
homogneo que la enzima anclada en la interfaz, sensa el agua de
hidratacin de la interfaz y no al DMSO. Este ltimo se
20 4.79a 1.04x106 2.63 x 104 encontrara alejado de la interfaz, posiblemente en el
10.59b corazn polar.
30 12.48a 2908 ---
b CONCLUSIONES
50 20.29 ND 6.20 x 104
Se puede observar claramente que a medida que Un incremento en DMSO en la mezcla agua-
aumento la concentracin de DMSO en la mezcla, la DMSO en medio homogneo inhibe la enzima.
reaccin se va haciendo cada vez ms lenta. Es ms, llega No se observa inhibicin de la enzima cuando se
un porcentaje de mezcla que no se observan cambios encapsula agua-DMSO en diferentes proporciones.
significativos en los espectros de absorcin durante el Se observa una solvatacin preferencial de la
periodo de 24 hs (ND). Una posible explicacin es que al enzima en la interfaz de micelas inversas de agua-
aumentar la concentracin de DMSO, el solvente DMSO/AOT/heptano.
compite con el agua por solvatar sitios activos hasta REFERENCIAS
llegar un punto en que inhibe la actividad cataltica de la
enzima. 1- M. A. Biasutti, E. B. Abuin, J. J.Silber , N. M.
Con el objetivo de evaluar la eficiencia cataltica de Correa, E. A. Lissi, Adv. Colloid Interface Sci, 136,
la enzima y el rol del DMSO en medios confinados, se 1, (2008)
estudio la reaccin de hidrlisis en micelas inversas de 2- N. M. Correa, J. J. Silber, R. E. Riter, N. E. Levinger,
agua-DMSO/AOT/heptano. Chem. Rev., 112, 4569, (2012)
b) Estudio en micelas inversas de agua- 3- F. Moyano, R. D. Falcone, J. C. Mejuto, J. J. Silber,
DMSO/AOT/heptano N. M. Correa, Chem.-Eur. J., 16, 8887. ,(2010).
Se estudio la reaccin de hidrlisis encapsulando 4- A. Kumar, P. Venkatesu, Chem. Rev., 112 (7), 4283,
agua-DMSO, en condiciones idnticas a las del medio (2012).
homogneo. Es decir, encapsulando mezclas de agua-
DMSO de 20% y 50% en micelas inversas de AOT.