03/06/2015

INTERAES
Reaes Ag-Ac
ANTGENO-ANTICORPO

Testes Sorolgicos / Deteco, quantificao e

caracterizao de
Tcnicas de Imunodiagnstico anticorpos (Acs) ou de
antgenos (Ags) e seu uso
como ferramenta para
Prof. Helio Jos Montassier
pesquisa e diagnstico

IMUNODIAGNSTICO: Diagnstico laboratorial por Interao Ag-Ac: Conceito Inicial

meio de tcnicas imunolgicas

SERVE PARA PROCURAR (DETECTAR / IDENTIFICAR / uma associao bimolecular semelhante

MENSURAR):- Anticorpos ou Antgenos no organismo
interao de enzimas com seus substratos ou de
hormnios com seus receptores, com uma
vertebrado suspeito de estar infectado com um determinado
distino bem evidente o Ac no provoca nenhuma
agente infeccioso, usando-se tcnicas sorolgicas de alterao qumica irreversvel na molcula de Ag,
Precipitao, Aglutinao, Fixao de complemento, podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se
Neutralizao ou Imunoensaios com Acs ou Ags
dissociar nos seus 2 componentes; isto , Ag e Ac
livres /soluo/suspenso.
marcados que utilizam sinalizadores da interao Ag-Ac com
conjugados ligantes, como Imunofluorescncia,
Radioimunoensaio, Imunoenzimticos, Imunofluorimtricos e Ag + Ac AgAc (Imunecomplexos)
Quimioluminiscncia .

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RESPOSTA DE ANTICORPOS
INTERAES Ag-Ac
Reaes reversveis. Especificidade
Habilidade do Ac distinguir seu imungeno de outros Ag.

Ligaes no covalentes: Quantidade

N de clulas B x taxa de sntese do Ac x persistncia aps sua produo.
-Pontes de hidrognio
Isotipo
-Interaes hidrofbicas Determina a persistncia (meia vida in vivo diferente).
A composio determina a funo dos Ac e os locais onde so encontrados.
-Interaes de Van der Waals
Afinidade
-Ligaes inicas
Fora de ligao do Ag com o Ac, em um nico stio. Quanto maior a
afinidade entre Ac e Ag, menos Ac ser necessrio.
Avidez: fora total de ligao, nos dois stios.
Reaes Cruzadas:
a habilidade de uma populao de molculas de Acs reagirem com mais
de um Ag

Avidez x Afinidade Reatividade Cruzada entre Ag-Ac

a habilidade de um Ac reagir atravs de seu

partopo com mais que um determinante antignico.
a habilidade de uma populao de molculas de
Acs reagirem com mais de um Ag

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MTODOS SOROLGICOS MTODOS

1) Reagentes no marcados PRECIPITAO APLICAES

Reao de precipitao - Imunodifuso dupla
- Imunodifuso radial
Reao de aglutinao - Imunoeletroforese - Pesquisa
AGLUTINAO - Diagnstico
2) Reagentes marcados - Aglutinao direta e indireta - Soroepidemiologia
RIA - Inibio da aglutinao
ELISA - Teste de Coombs
Imunofluorescncia IMUNOENSAIOS
Western Blotting - RIA
Testes Imunocromatogrficos - ELISA
- Imunofluorescncia e Citometria de Fluxo
- Western Blotting
- Testes Imunocromatogrficos

PRECIPITAO X AGLUTINAO REAES DE PRECIPITAO

Precipitao: Interao entre Acs [IgG(*) e IgM(-)] e Ags solveis
Formao de complexos Ag/Ac. Ac precisa ser bivalente ou c/ valncia maior
Ag precisa ser bi ou polivalente
Aglutinao: A reao pode ser afetada pelo n de stios de ligao
o agrupamento de partculas antignicas aps a que cada Ac possui para seu Ag VALNCIA
interao com Acs especficos, usualmente por molculas
de Acs que se ligam a Ags na superfcie de partculas
adjacentes.

As reaes de precipitao e de aglutinao decorrem,

respectivamente da ligao entre o Ac e Ag solveis ou
particulados. PRECIPITADO

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importante levar-se em conta como ocorre a

ligao Ag-Ac em diferentes concentraes TCNICAS DE PRECIPITAO EM GEL
dos mesmos. Observe abaixo:
IMUNODIFUSO

IMUNODIFUSO DUPLA Radial & Double Immunodiffusion

As solues sofrem difuso e, quando o Ag e o Ac se

encontram em zona de equivalncia, se observa a reao pela
formao de uma linha de precipitao:
Pode ser visualizada ps lavagem do gel , para remoo das
protenas solveis, por colorao dos arcos de precipitao com
corante

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IMUNODIFUSO RADIAL IMUNOELETROFORESE

Permite a quantificao do
antgeno ou do anticorpo.
O processo continua at ser
atingida a zona de equivalncia,
com os complexos precipitando-
se em um anel (halo) em torno
do orifcio.
Pode-se fazer comparao de misturas complexas de Ag que so
separados em gel de agarose, pela aplicao de uma corrente eltrica.
As molculas migram para o plo negativo, distribuindo-se no gel de
acordo com os seus PM e cargas eltricas.
Uma canaleta recortada entre os poos e preenchida com Ac, que se
difunde.
Ag e Ac formam arcos de precipitao.

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REAES DE AGLUTINAO AGLUTINAO DIRETA

Clulas ou partculas insolveis + Ac = Aglutinao
Ac + Ag multivalente particulado
Ttulo: maior diluio que ainda causa aglutinao
(semi-quantitativo) Exemplo: tipagem sangunea em lminas (sistema ABO)
1) Amostra de sangue na placa teste:
P-zona: excesso de Ac
Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga
eltrica (repulso)
Agregao visvel de
partculas = Eritrcitos, 2) Reagente (anticorpo anti A, B):
bactrias, fungos e ltex

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AGLUTINAO DIRETA AGLUTINAO DIRETA

4) Mistura-se:
5) Leitura do resultado:

3) Controle negativo:

Um resultado positivo indicado por uma aglutinao

visvel (aglomerao dos eritrcitos na placa teste), como
ilustrado acima.

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Hemaglutinao TESTE DE COOMBS

p/ determinao
de grupos
sanguneos A,
B e O. Ac antiimunoglobulinas (Robert
Coombs);
DHRN me produz IgG anti-Rh;
No aglutinam os eritrcitos;
Direto: Ac ligados aos
eritrcitos fetais;
Indireto: Ac anti-Rh no
aglutinantes no soro materno.
Permite detectar
incompatibilidades Rh, prevenindo
contra DHRN.

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Aglutinao / Hemaglutinao Aglutinao Passiva /Hemaglutinao

Teste de aglutinao quantitativa Definio teste de aglutinao feito com um

antgeno solvel adsorvido a uma partcula (por ex.
Ttulo: recproca da > diluio com resultado + Cels./hemcias ou partculas de ltex)
Efeito Prozona
(+)

(-)

Aplicaes
Medida de anticorpos para antgenos solveis
(por ex. Ags sols. do Toxoplasma gondii)

AGLUTINAO INDIRETA (PASSIVA) INIBIO DA AGLUTINAO

Ag solveis associados a outras superfcies Exemplo: presena de hCG na urina (gravidez)
(Partculas de ltex ou superfcie de hemcias)

Exemplo: Hemaglutinao Passiva para a Doena de

Resultado negativo:
Chagas:
(ausncia de hCG na
As hemcias so revestidas com Ag do T. cruzi (ligao urina).
covalente) e ento distribudas nos poos da placa. Ocorre aglutinao,
pois os anticorpos
O soro teste e os controles positivos e negativos, anti-hCG no so
devidamente diludos, so adicionados aos poos da bloqueados na
referida placa. incubao inicial,
porque no havia o
Se houver Ac especfico contra o Ag, as hemcias se hormnio na urina.
aglutinam e formam uma camada no fundo do poo. Livres, podem
Quando no existe Ac especfico, as clulas formam um aglutinar as partculas
boto no fundo do poo. revestidas de hCG.
Aglutinao Positiva
Negativa

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Aglutinao Bacteriana Aglutinao Bacteriana

-As infeces bacterianas frequentemente induzem a

produo de Acs sricos especficos para Ags de
superfcie das Bactrias.
-A presena de tais Acs pode ser detectada pelas
reaes de aglutinao bacteriana.
-Os ttulos dos Acs sricos de um indivduo suspeito
definido como a recproca da maior diluio do
soro que produz uma reao positiva de aglutinao.
-O ttulo aglutinante de um soro pode ser usado para
o diagnstico de infeces bacterianas.

IMUNOENSAIOS IMUNOFLUORESCNCIA (IFA)

Princpio da tcnica:
Reagentes marcados (enzimas,
fluorocromos, istopos) Anticorpos ou antgenos so conjugados (ligados de modo covalente)
a uma substncia (fluorocromo), que, quando excitada por
radiaes UV, emite luz no espectro visvel.
Tipos:
Assim, como a ligao Ag-Ac especfica, um anticorpo
- RIA conjugado pode ser usado para detectar um determinado antgeno e
vice-versa.
- ELISA
A reao feita em lminas de microscopia (um pouco mais finas
- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO que as comuns) e a observao tem lugar num microcpio com luz UV
(microscpio de fluorescncia).
- WESTERN BLOTTING
Principais fluorocromos: fluorescena (isotiocianato de fluorescena
- Testes Imunocromatogrficos FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina TRICT).
Tipos: direta, indireta ou saduche.

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REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA

APLICAO DA IMUNOFLUORESCNCIA REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA

IFA direta:
Deteco direta de microrganismos em secrees, na urina, nas fezes,
em cortes de tecidos etc. Tambm utilizada na fenotipagem de clulas
tumorais.

IFA indireta:
Diagnstico sorolgico de vrias doenas infecciosas como a Doena
de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenas auto-
imunes.

uma tcnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescncia mais

intensa) e especificidade.

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REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA

Vantagens: limiar de deteco; especfica; reprodutvel;

simples execuo; determinao de classes e subclasses de
anticorpos
Desvantagens: microscpio de fluorescncia; diminuio da
fluorescncia sob irradiao; subjetividade na leitura;
ausncia de automao

CITOMETRIA DE FLUXO CITOMETRIA DE FLUXO / APLICAES:

Ferramenta que detecta e quantifica clulas individuais marcadas

por fluorocromos, passando em uma corrente atravs de um
feixe de Laser. Identificao e separao de clulas baseadas na disperso de luz e
Separa as clulas por fluorescncia ativada. fluorescncia sob feixe de laser
Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. Estudo de populaes de leuccitos luz dispersa tamanho e
um teste qualitativo e quantitativo. forma da clula
Identificao de populaes e/ou subpopulaes de linfcitos T e B
APLICAES FACS (fluorescence-activated cell sorter) separao de uma nica
Tipo de populao/subpop. de linfcitos/ clula
leuccitos;
Quantidade, tamanho, granulosidade;
Isolamento de populaes celulares;
Monitoramento Cels TCD4 / CD8 - HIV

Barrientos et al., 2000

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CITOMETRIA DE FLUXO Esquema de CITOMETRIA DE FLUXO PREPARO

Funcionamento da Tcnica DA AMOSTRA

CITOMETRIA DE FLUXO PREPARO

CITOMETRIA DE FLUXO RESULTADOS
DA AMOSTRA

Gating strategy to define lymphocyte subsets. (i) Histogram (univariate) plot of CD3 expression;
this one-dimensional graph corresponds to a typical bar chart and is called histogram in flow
cytometry. (ii) Pseudocolor plot of CD3 versus CD4. This display gives a better view on the
distribution of CD3 expression than the histogram, in particular for **CD3 low expressing cells; note
both axes are logarithmic, unlike the linear axes of scatter plots in Figure 2. (iii) Cartoon detailing
interpretation of quadrant gates of (ii). CD3+CD4+ cells are displayed in the top right quadrant (46.2%
of lymphocytes). CD, cluster of differentiation.

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IMUNOHISTOQUMICA / IMUNOCITOQUMICA
TESTE DE IMUNOPEROXIDASE

Deteco e localizao de antgenos celulares/teciduais

Anticorpos conjugados com enzimas converso de substrato
incolor em produto colorido (deposio pode ser observada
diretamente ao microscpio ptico)
Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -
Galactosidase e Glicose Oxidase
Mtodo direto Acs primrios conjugados (deteco de antgenos)
Mtodo indireto Acs secundrios conjugados (deteco de
antgenos ou anticorpos)
Desvantagens: atividade enzimtica endgena, armazenamento
inadequado dos conjugados

Como so detectados / mensurados os nveis Ensaio Imunoadsorvente

de Anticorpos em Fluidos Biolgicos? Ligado Enzima - ELISA
O teste detecta, identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um
dos dois conjugados com enzimas.

Fosfatase alcalina
Peroxidase
TCNICAS DE ELISA B-galactosidase

O produto final corado surge por ao da enzima que converte

um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato
alterado pela enzima induz mudana de cor de uma substncia
indicadora).
A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, atravs
de leitura em fotocolormetro.
Principais tipos de ELISA: indireto, sanduche, competio e
captura.

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TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

Para que o ELISA usado:-

-Mensurar os nveis de Acs especficos contra um

determinado Ag e/ou microrganismo.
-Detectar / Identificar vrus (Ags)
-Mensurar hormnios
-Mensurar marcadores de reaes inflamatrias
(citocinas, protenas de fase aguda) PLACA
UTILIZADA

ELISA Indireto
COMPETITIVE ELISA Ab Detection

ELISA Direto ou Sanduche

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COMPETITIVE ELISA Ag Detection TESTES DE ELISA

Aplicaes do ELISA:
(-) Testes de rotina em Laboratrios Clnicos e
de Pesquisa

Vantagens:
Teste de alta sensibilidade
Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
Seguros e de baixo custo
(+)

RADIOIMUNOENSAIO - RIA WESTERN BLOTTING

Marcaes:
I125: emite raios gama
Eletroforese de
H3: raios beta protenas.
Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)
Identifica
Desvantagem a manipulao de istopo radioativo.
Aplicaes:
antgenos ou
Triagem vrus da hepatite B em doadores de sangue, Hormnios, anticorpos.
protenas sricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

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WESTERN BLOTTING WESTERN BLOTTING

TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA / TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA /

IMUNOMIGRAO RPIDA IMUNOMIGRAO RPIDA

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