Problema de DNA recombinante

A) Vocs foram aceitos numa empresa farmacutica e como primeira atividade,

tinham que produzir a protena da motivao recombinante, para aplicao em
jovens universitrios. O gene j estava clonado em um vetor, mas vocs
precisam passar para um vetor de expresso bacteriano. Em anexo, voc vai
encontrar tanto o mapa de restrio do vetor a ser utilizado (note que ele tem
dois promotores) como do DNA recombinante que contm o inserto (cDNA da
motivao) que voc precisa. Apresentem ao seu chefe:

1. O passo a passo da estratgia de clonagem usada; Ateno, mostre tambm os

detalhes das extremidades geradas pelas enzimas de restrio utilizadas (use
duas cores, uma para o vetor e outra para o inserto).

2. A estratgia de deteco da orientao de clonagem do fragmento

3. A escolha do promotor correto

4. Como poderia ser obtida a protena no final?

DNA recombinante: cDNA da motivao clonado no stio BamHI do vetor

pSVXLv44.

pSVXLv44

Mapa de restrio do inserto (cDNA da motivao):

cDNA total: 5.000 pb stio de restrio para a enzima Eco RI, os nmeros em pb
representam os fragmentos gerados pelo uso da enzima EcoRI

300 3.000 900 800 pb

5 3

Novo vetor a ser utilizado:

2
 Para responder a esta questo, devero ler o captulo referente a Tcnicas de
DNA recombinante.

Objetivos:

Ao trmino do estudo os alunos devero ser capazes de:

1. Conceituar DNA recombinante

DNA recombinante uma sequncia de DNA artificial que resulta da combinao de

diferentes sequncias de DNAs.

2. Conceituar vetor, no sentido da biologia molecular.

Pequena molcula de DNA capaz de autorreplicao, ele que transporta o inserto

de DNA para o interior de uma clula hospedeira, onde ele poder ser replicado.

3. Caracterizar diferentes tipos de vetores.

Existem diferentes tipos de vetores, alguns deles so: os plasmdeos, que so

pequenas molculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessrios para a sua
replicao e pelo menos um gene que confere resistncia a antibitico; o bacterifago
, um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular, que um vrus
de clulas bacterianas; cosmdeos, que so plasmdeos que contm um fragmento de
DNA do fago que inclui o stio cos. Alm de Cromossomos artificiais bacterianos e de
leveduras.

4. Conceituar enzimas de restrio, explicar onde e como atual.

As enzimas de restrio, reconhecem uma sequncia especficas de 4 a 8 pares de

base na hlice dupla do DNA e cortam ambas as fitas da hlice, em lugares
determinados. H 2 tipos distintos de clivagens: os cortes ocorrem simetricamente na
sequncia especfica, gerando extremidades cegas, ou os cortes so feitos
simetricamente, porm, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas.

5. Explicar qual a caracterstica do sitio de restrio.

Os stios de restrio precisam possuir uma sequncia de reconhecimento

palindrmica, a seqncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar,
quando lida na direo oposta, e os stios de clivagem so simetricamente posicionados.

6. Explicar os princpios de uma eletroforese em gel de agarose para DNA.

3
 A eletroforese em gel separa as molculas de DNA de acordo com sua migrao em
um gel. As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor
massa iro migrar mais rapidamente que as de maior massa.

7. Explique como selecionar os plasmdeos recombinantes pela triagem de

colnias branca e azul?

Os vetores que utilizam essa estratgia de triagem possuem um gene que codifica
resistncia ampicilina e um gene, lacZ', que codifica uma parte da enzima -
galactosidase. Esses mutantes s podem sintetizar uma galactosidase funcional
quando possuem um plasmdeo, como que tem a sequncia codificadora da parte da
subunidade faltante. Dessa forma, a seleo das colnias contendo plasmdeos
recombinantes feita em um meio slido contendo ampicilina e X-gal, um anlogo da
lactose que, quando degradado por uma -galactosidase ativa, produz um composto
que confere colnia uma colorao azul escura. Os plasmdeos, tambm necessitam
da presena de um anlogo da lactose no suscetvel degradao pela -
galactosidase, que utilizado como indutor da transcrio do gene lacZ', o qual
adicionado ao meio de cultura. Assim, as colnias transformantes que receberam o vetor
selvagem (no clivado) produziro uma -galactosidase ativa e tero colorao azul. As
bactrias transformantes que receberam plasmdeos recombinantes tero o gene lacZ'
interrompido pelo inserto, sero incapazes de sintetizar uma -galactosidase ativa e
sero brancas.

8. Diferenciar colnia de placa de lise.

Placa de lise rea clara, circular que em uma camada de bactrias cultivadas
(colnia) em meio slido, que resulta da lise de algumas clulas devido a repetidos ciclos
de multiplicao ltica de um fago que as infecta.

9. Explicar os diferentes tipos de extremidades que estas enzimas geram.

Desenhem.
As enzimas de restrio mais utilizadas so aquelas que geram fragmentos com
extremidades de fita simples complementares de at quatro nucleotdeos de
comprimento, que possuem afinidade uma pela outra e so denominadas extremidades
coesivas. Existem, tambm, certas endonucleases de restrio que cortam a molcula
de DNA sem criar extremidades coesivas.

4
 10. Voc quer construir um DNA recombinante, cujas extremidades de ambos,
plasmdeo e fragmento, so SmaI. Faa um desenho esquemtico, usando cores
diferentes para o DNA do plasmdeo e do DNA do fragmento, da sua construo,
sabendo que o stio de restrio SmaI possui a sequncia: 5CCCGGG3e que o
corte ocorre entre C e G.

11. Idem que 3, mas utilizando a enzima HindIII 5AAGCTT3, o corte ocorre entre A
e A.

12. Diferenciar biblioteca gnica e de cDNA, explicando as diferenas e como se

obtm.

13. Definir sonda e explicar como podem ser preparadas (ie, os tipos de sondas).

Problema de anlise de DNA (Diagnstico Molecular)

B) Anemia falciforme uma hemoglobinopatia de origem autossmica recessiva e

consiste na mutao de apenas um par de base no incio do gene da cadeia beta
do gene da globina. Foi desenvolvido um mtodo de reao em cadeia de
polimerase (PCR) para detectar a anemia falciforme. A mutao falcmica altera
o cdon 6 do gene da globina de GAG para GTG, eliminando assim um stio
para a enzima Mst I, que normalmente est presente. A estratgia usada para o
PCR mostrada a seguir: (A e B so primers)

A
5 6 7

CCT GAG GAG

100 pb 130 pb

Mst I (CCTNAGG)

Com base na figura acima, onde N representa qualquer nucleotdeo, A e B os

primers utilizados e pb pares de bases, responda:

5
a) Quais so os tamanhos previstos de produtos de PCR para indivduos AA
(homozigotos normais), AS (heterozigotos carater falcmico) e SS (homozigoto
afetado) aps digesto com Mst I?
Para indivduos homozigotos normais os produtos de PCR aps a digesto por Mst
I tero tamanhos de 100 pb e 130 pb. Em heterozigotos (AS), existir a presena de 3
tipos de produtos com, 100 pb, 130 pb e 230 pb, j que um dos alelos est mutado,
impedindo a ao da enzima de restrio sobre este stio. Dessa forma, o produto
originado de homozigotos possuiro 230 pb, pois os dois alelos possuem a mutao
pontual para a anemia falciforme.

b) Qual seria o resultado previsto para um indivduo homozigoto para a hemoglobina C

(codon 6 AAG)?
Para indivduos homozigotos para hemoglobina C, os produtos da digesto por Mst
I teriam o mesmo tamanho dos indivduos normais, pois a enzima de restrio utilizada
no descrimina a troca no nucleotdeo de G para A, pois para ela qualquer nucleotdeo
presente nessa posio permite o corte.

c) Qual seria o resultado previsto para um indivduo homozigoto para a talessemia-

por mudana de leitura no cdon 6 (deleo de uma base no codon 6)?

A enzima de restrio s conseguiria realizar a clivegem se a deleo ocorresse no

primeiro nucleotdeo do cdon 6, pois para a enzima, este, pode ser qualquer um dos
quatro (A, G, C, T). Se a deleo fosse nos outros dois veramos a formao de bandas
de 230 pb, j que a enzima no conseguiria cortar as fitas de DNA.

Para responder a esta questo, devero ler o captulo referente a Tcnicas de DNA
recombinante.

Objetivos:

Ao trmino do estudo os alunos devero ser capazes de:

- Citar as tcnicas, em geral, que permitem analisar o DNA

Eletroforese em gel, hibridao Southern, hibridao dot-blot e hibridao in situ
sequenciamento de DNA, reao em cadeia da polimerase (PCR), PCR em tempo real
quantitativa (qPCR).

- Explique o processo do PCR

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 Os principais ingredientes de uma reao PCR so a Taq polimerase, primers,

DNA molde e nucleotdeos. Os ingredientes so reunidos em um tubo, juntamente com

cofatores de que a enzima precisa, e passam por repetidos ciclos de aquecimento e

resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado.As etapas bsicas so:

Desnaturao para desnaturar as fitas de DNA, permitindo sua separao; Anelamento,

fazendo com que os primers possam se ligar s suas sequncias complementares no

DNA molde de fita simples; E polimerizao, que permite que a Taqpolimerase estenda

os primers, sintetizando novas fitas de DNA. Este ciclo se repete vrias vezes em uma

reao tpica de PCR.

- Compare PCR e Souther blot quanto sua utilidade e etapas de realizao

O PCR amplamente utilizado para amplificao de um fragmento de DNA de
interesse, permitindo que vrias analises sejam feitas mesmo com uma pequena
quantidade de material. O Southern Blot um mtodo rotineiramente utilizado na
biologia molecular para a deteco de uma sequncia de DNA especfica em amostras
de DNA. Southern Blot combina a transferncia de fragmentos de DNA separados por
eletroforese para uma membrana de filtro e posterior deteco de fragmentos por
hibridao de sonda.

- Diferencie VNTR e RFLP e explique como estes ensaios podem ser realizados.
O RFLP identifica polimorfismos, por meio da determinao de uma alterao do
padro de clivagem, devido a mutaes pontuais em stios de restrio, obtido a partir
de uma determinada regio do DNA. J o VNTR faz a anlise de repeties em srie
em nmero varivel, por meio de enzimas de restrio.
Para comear, o DNA extrado de sangue, saliva ou outras amostras e purificado.O
DNA purificado digerido usando endonucleases de restrio. Os fragmentos de
restrio produzidos durante a fragmentao do DNA so analisados usando
eletroforese em gel. O gel tratado com corantes luminescentes para tornar visveis as
bandas de DNA.

Diagnstico Molecular II

C) Dependendo da pergunta que se tenha em mos, um diagnstico molecular

tambm pode ser dado via sequenciamento nucleotdico. Para praticar, voc

7
 recebeu o gel de sequenciamento abaixo para ler, mas para tanto, precisa
explicar, primeiro, como feito (passo a passo) o procedimento do
sequenciamento nucleotdico pela via enzimtica, ou mtodo de Sanger. Em
seguida, anote o resultado da sua leitura, referente chave indicativa no gel.
Aps a leitura importante identificar se o segmento lido possui uma ORF. Como
voc poderia proceder para esta anlise?
GATC

O mtodo Sanger envolve a produo de muitas cpias de uma regio alvo de

DNA. Os ingredientes so similares aos usados para a reao em cadeia da polimerase
(PCR). Esses ingredientes so: Uma enzima DNA polimerase; um primer, que um
pequeno fragmento de DNA de fita simples que se liga ao DNA molde e atua como um
"iniciador" para a polimerase; nucleotdeos dATP, dTTP, dCTP, dGTP; o DNA molde a
ser sequenciado; e verses Dideoxi, para os nucleotdeos (ddATP, ddTTP, ddCTP,
ddGTP). Os dideoxinucleotdeos so similares aos nucleotdeos comuns, mas falta um
grupo hidroxila na posio 3' do carbono do anel de sacarose. Uma vez que um
dideoxinucleotdeo adicionado cadeia, no h hidroxila disponvel e nenhum outro
nucleotdeo pode ser adicionado.
A mistura dividida em quatro tubos, cada uma ir receber um
dideoxinucleotdeos diferente. Primeiro a soluo aquecida para a desnaturao do
DNA molde e ento resfriadas para que os primers possam se ligar ao molde de fita
8
simples e a DNA polimerase sintetize um novo DNA a partir do primer. A DNA
polimerase continuar a adicionar nucleotdeos cadeia at que acontea a adio de
um dideoxinucleotdeo ao invs de um normal. Nesse ponto, os nucleotdeos no podem
mais ser adicionados, e portanto a fita terminar em um dideoxinucleotdeo. Este
processo repetido em um nmero de ciclos. Ao final da reao, o tubo ir conter
fragmentos de diferentes comprimentos, terminando em cada uma das posies de
nucleotdeos no DNA original. Aps a reao, as amostras so desnaturadas na
presena de formamida e analisadas em gel de poliacrilamida contendo ureia.

Leitura
5AAAATCTTGATCACAATAAGCTGAAAAATCTTACTTTTAAGATTTCTACAC
GCTAATGAACAATTTTAATCACATACATGTGATCAAC3
O fragmento de leitura no possui uma ORF, est poderia ser identificada pelo
cdon de incio ATG e cdon de parada TAA, TAG ou TGA.

Exame de DNA e a busca da paternidade

D) Aps o falecimento de um rico fazendeiro um suposto filho ilegtimo reclamou os

seus direitos na partilha da herana. Por deciso judicial, a esposa, os trs filhos
registrados (B, C e D), o provvel novo herdeiro (A) e sua me (vide
heredograma abaixo), foram submetidos a um teste de paternidade, que se
fundamenta no material gentico (exame de DNA) destes indivduos. O
resultado encontra-se na tabela abaixo.

B C D

9
 Com relao ao heredrograma do problema. O indivduo A realmente irmo de B,
C e D? Qual o aspecto inesperado que se pode concluir dos parentescos em questo?

Analisando o teste de paternidade, podemos concluir que A irmo de B, C e D.

Mas, a partir do mesmo teste, temos uma revelao inesperada de que D no filho da
me de A e B, sendo somente irmo por parte de pai dos outros indivduos.

Para responder a esta questo, devero ler o captulo referente a Tcnicas de

DNA recombinante.

Ao trmino do estudo os alunos devero ser capazes de:

- Quais mtodos moleculares esto relacionados com a anlise de polimorfismo?

Essas analises podem ser feitas por meio de Southern blot e eletroforese com
produtos derivados de PCR.

- Qual regio do genoma humano utilizada na anlise da paternidade: regio codante

ou no codante? Por qu?

No teste de paternidade so utilizadas regies no codantes, pois so analisadas

repeties em tandem pois essas sequncias nucleotdicas curtas, repetidas de 20 a
100 vezes, apresentam um padro que varia de pessoa para pessoa, a menos que
sejam geneticamente idnticas, como no caso de gmeos univitelinos.

- O que um marcador gentico?

Marcador gentico uma caracterstica que mostra as diferenas entre dois ou mais
indivduos ou organismos. Um marcador gentico deve ser capaz de diferenciar os
progenitores e ser reproduzido com preciso na prognie.

- O que so satlites, minisatlites, microsatlites, repeties em tandem?

Minissatlites (VNTR) so repeties em srie em nmero varivel, constitudas

de sequncias repetidas com 10 a 80 pares de nucleotdeos, e os microssatlites (STR),
repeties curtas em srie so constitudos de sequncias repetidas com 2 a 10 pares
de bases.

- Definir e diferenciar RFLP e VNTR.

O RFLP identifica polimorfismos, por meio da determinao de uma alterao do

padro de clivagem, devido a mutaes pontuais em stios de restrio, obtido a partir
de uma determinada regio do DNA. J o VNTR faz a anlise de repeties em srie
em nmero varivel, por meio de enzimas de restrio.

10
 Produo de Organismo transgnico

E) Vocs trabalham em uma multinacional, relacionada com diagnstico ambiental

e a primeira tarefa de vocs a produo de um peixe sensor de poluio
ambiental. Na presena de um certo tipo de poluente, ele fica vermelho.
Entregue para seu supervisor, o passo a passo de como isto pode ser feito.

Para a produo desse peixe sensor de poluio ambiental necessrio a insero

de uma molcula de DNA circular (plasmdeo) em ncleos de ovos fertilizados que
contenha na regio promotora genes que fornecessem a colorao vermelha para o
peixe quando o mesmo entrasse em contato com um determinado poluente. Para isso
acontecer so necessrios alguns passos. Primeiro insere-se um fragmento de
restrio, como por exemplo o EcoRI, de uma molcula de DNA no stio de restrio
especfico de EcoRI, clivado, de um plasmdio autorreplicante. Quando esse
plasmdio recombinante foi introduzido nos ncleos das clulas do peixe em questo
por transformao, apresentou replicao autnoma, exatamente igual ao plasmdio
original, antes do final do processo ser estabelecido foi necessrio que as duas
molculas de DNA, que foram unidas para dar a colorao ao peixe, fossem misturadas
em condies de anelamento e unidas por ligao covalente mediante tratamento com
DNA ligase.

Para responder a esta questo, devero ler o captulo referente a Tcnicas de DNA
recombinante.

Ao trmino do estudo os alunos devero ser capazes de:

- Definir e diferenciar transgnico de transgene.

Um gene introduzido em uma clula ou um organismo denominado transgene

(do ingls, transferred gene, gene transferido) para distingui-lo dos genes endgenos, e
o organismo no qual o gene introduzido denominado transgnico.

- Distinguir transgnico de organismo geneticamente modificado:

Um Organismo Geneticamente Modificado (OGM) um ser vivo que sofreu

alguma mudana artificial em seu material gentico, mediante manipulao da
engenharia gentica. A mudana pode ser apenas em mudanas na estrutura ou na
funo do prprio material gentico do organismo, mas no introduziu nenhum material
gentico de outra espcie no material gentico original, ento esse organismo
considerado somente um OGM.

11
 Um Transgnico um OGM que recebeu uma parte do material gentico de
outra espcie. Um organismo geneticamente modificado foi submetido a tcnicas
laboratoriais que, de alguma forma, modificaram seu genoma, enquanto que um
organismo transgnico foi submetido a tcnica especfica de insero de um trecho de
DNA de outra espcie.

- Identificar os componentes de um transgene.

Um transgene deve conter uma regio promotora e uma regio reguladora que
dirige a transcrio.

- Identificar e compreender os mtodos de transfeco em clulas animais e/ou

vegetais:

- Definir organismo knockout.

O organismo knockout um organismo que teve a expresso de um gene

bloqueada. Esse gene foi substitudo em seu locus por uma verso modificada do qual
se extraiu um ou vrios exes para gerar uma verso no funcional, incapaz de produzir
protena.

- Diferenciar animal transgnico do nocauteado.

Animais transgnicos so aqueles cujo genoma foi modificado pela introduo

de sequncias de DNA de outro organismo. Muitas vezes tais sequncias so
manipuladas por engenharia gentica de tal forma que constituem uma mistura de
pedaos de DNA vindo de diversas origens.

No caso de animais nocautes, a modificao gentica introduzida capaz de

interromper ou anular um gene que, ento, no mais se expressa, sendo denominado
de nocauteado.

- Compreender a metodologia de produo de um gene targeting, diferenciando a

recombinao homloga da insero aleatria.

Anlise de expresso Gnica Global

F) O conhecimento apenas das sequncias nucleotdicas e suas variaes no

so suficientes para a compreenso do funcionamento celular, na identificao

12
 de novos alvos para frmacos e novas terapias. Compreender como a clula
reage a um determinado estmulo, fundamental para compreender o todo. Assim,
tcnicas de anlise de expresso gnica global foram desenvolvidas tanto para
RNA quanto para protena. Sabendo disto, vocs foram encarregados de
analisar o efeito de um novo componente encontrado na frao orgnica do
material particulado, oriundo da queima de biomassa, em clulas epiteliais
derivadas do pulmo humano. Descreva aqui o desenho experimental do seu
experimento, explicando os passos importantes para analisar: a) transcriptoma
e b) proteoma.

Objetivos:

Ao trmino do estudo os alunos devero ser capazes de:

- Compreender as etapas da expresso gnica

- Saber que tipo de vetor usado para anlise de expresso gnica

- Citar diferentes tcnicas de anlise de rna (individual e global)

- Explicar northern-blot e compreender a diferena em relao ao southern-blot

- Explicar e diferenciar rt-pcr (reversa transcriptase pcr) e real time pcr

- Diferenciar estes ensaios do microarray (compreender as etapas necessrias para tal)

- Explicar western-blot e diferencia-lo do southern e northern-blot

- Explicar o funcionamento do gel sds-page

- Explicar o gel 2d em relao a protenas.

G) Terapia Gnica
1. Micarstica possui uma doena pulmonar de carter dominante, caracterizada
por uma expresso exagerada de um gene, devido a uma mutao em seu
promotor. Que estratgias de terapia gnica poderiam ser oferecidas a esta
pessoa. Explique.

Neste caso a tcnica mais recomendada seria a terapia gnica de clulas

germinativas ou hereditria. O processo consiste na produo de vetores de origem viral
para terapia gnica que removem os genes envolvidos nos mecanismos patognicos e

13
de proliferao viral, mantendo apenas o necessrio para invaso das clulas sem
multiplicao, seguida da insero de um gene teraputico no que resta do DNA viral.

2. Anabela possui uma doena pulmonar de carter recessivo, caracterizada pela

ausncia de uma dada protena. Que tipo de estratgia pode ser utilizada para
a realizao de uma terapia gnica para Anabela? Descreva a abordagem.

No caso de anabela o protocolo ideal de terapia gnica substituiria o gene

anmalo por um gene funcional. As substituies gnicas seriam mediadas por
recombinao homloga e posicionariam o gene introduzido em sua localizao normal
no genoma do hospedeiro.

Objetivos:

Ao trmino do estudo os alunos devero ser capazes de:

- Definir terapia gnica.

a introduo de cpias funcionais de um gene em indivduos que tem duas

cpias anmalas do gene.

- Identificar as potenciais doenas passveis de terapia gnica.

A utilizao da terapia gnica como forma de tratamento est relatada nas

doenas como Imunodeficincia Severa Combinada, cncer, doenas cardiovasculares,
doena de Parkinson e cancro de mama.

- Identificar as diferentes estratgias de terapia gnica.

As estratgias mais usuais na terapia gnica so um gene normal pode ser

inserido num local no especfico no genoma para substituir um gene problemtico; um
gene anmalo pode ser trocado por um gene normal por meio da recombinao; e o
gene anmalo pode ser reparado por meio de mutao reversa seletiva, que devolve ao
gene suas funes normais.

- Como as clulas somticas podem ser modificadas? Descreva as estratgias.

- Identificar o que deve conter o vetor usado em terapia gnica.

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 O vetor deve conter os genes a serem transferidos e expressos em uma clula
receptora. Os diversos tipos de vetores so utilizados com o objetivo de levar o DNA
teraputico ao ncleo das clulas-alvo.

- Compreender como produzir um retrovrus recombinante.

Por meio de tcnicas de DNA recombinante, os genes no genoma viral

necessrios para a reproduo do Mo-MuLV, genes gag, pol e env, so removidos e
substitudos por um gene de interesse. O que sobra do retrovirus so seus elementos
regulatrios: as repeties terminais longas (LTR), que funcionam como sinais de
integrao do provirus e promotores da transcrio e um sinal de empacotamento, para
permitir que o RNA transcrito seja acomodado em uma partcula viral.

- Identificar como os genes so transferidos para a clula do paciente.

- Identificar os diferentes tipos de vetores usados em terapia gnica, inclusive suas

vantagens e desvantagens.

Na maioria das vezes, usam-se vrus para inserir o gene selvagem nas clulas.
No caso de vetores retrovirais, o transgene selvagem integrado com o DNA do
retrovrus ao DNA da clula hospedeira. Assim, quando se usam retrovirus como
vetores, o transgene e transmitido para todas as clulas descendentes na linhagem da
clula afetada.

Quando se usam vetores virais, como os derivados de adenovrus, a presena

dos transgenes nas clulas hospedeiras transitria porque a replicao dos genomas
desses vrus autnoma e eles s persistem at que o sistema imune elimine os vrus
com as clulas infectadas. A vantagem desses vetores em relao aos retrovrus que
no h induo de mutaes possivelmente prejudiciais durante a etapa de integrao.
No entanto, h duas desvantagens importantes: (1) a expresso do transgene
transitria, apenas enquanto persistir a infeco virai, e (2) a maioria dos seres humanos
tem forte reao imune a esses vrus, provavelmente causada por exposio previa ao
mesmo virus ou a virus muito semelhantes.

- Compreender as diferentes formas de inibio da expresso gnica

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