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I. INTRODUCCIÓN.

En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances y,


paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtención de productos
químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica. Los procesos catalizados
por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que presentan una
serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:
Presentan una gran actividad catalítica; Muestran una gran especificidad de
sustrato (incluso estereoselectividad y regioespecificidad); Son muy activos a
temperatura ambiente y presión atmosférica.

De forma general, la inmovilización se refiere al hecho de limitar o retardar el


movimiento. La enzima inmovilizada es aquella que está confinada en un espacio
definido, que retiene su actividad catalítica y puede ser reutilizada de forma
continua (Yu y col., 2004). En comparación con las enzimas solubles, la
inmovilización permite que el biocatalizador sea fácilmente separado de la
reacción (Illanés, 2008). Además, los catalizadores pueden ser inmovilizados no
solo a partir de enzimas purificadas sino también utilizando células completas
(Mahmoud y col., 2009).

Los antecedentes de la inmovilización se remontan al estudio de las biopelículas,


las cuales son una superficie de conexiones de comunidades microbianas que
consiste en múltiples capas de células incrustadas en matrices hidratadas. En el
año de 1815, se realizó un primer intento de la inmovilización al utilizar de forma
empírica el ácido acético y el tratamiento de aguas residuales.

Los componentes principales de un sistema de inmovilización enzimático son la


enzima, la matriz o soporte y el método de fijación. Como consecuencia de la
inmovilización enzimática, algunas de sus propiedades como la actividad
catalítica o la estabilidad térmica llegan a ser alteradas, sin embargo, puede
conservar su funcionalidad durante varios ciclos (Brena y col., 2006).
II. MARCO TEORICO

2.1. Enzima inmovilizada

La inmovilización es un proceso por el cual el movimiento de la enzima en el


espacio se ve restringido total o parcialmente (Wiseman, 1985). Las enzimas
inmovilizadas pueden estar unidas entre sí, unidas a un soporte o libres, pero
confinadas en un espacio determinado. De hecho, algunas enzimas de las
utilizadas en diversas aplicaciones se encuentran ligadas a paredes celularcs
o situadas dentro dc la célula, estando así naturalmente inmovilizadas, pues
la célula evita su pérdida por encapsulación o inmovilización en membranas.

El empleo de la inmovilización de enzimas se conoce desde 1916, ai~o en el


que Nelson y Griffin observaron que la invertasa de levadura se adsorbía
sobre carbón activo y era capaz de catalizar la hidrólisis de sacarosa. En aflos
posteriores se publicaron varios artículos sobre la inmovilización de enzimas
activas inmovilizadas covalentemente a varios soportes. Sin embargo, la
aplicación práctica de las enzimas inmovilizadas se sitúa en 1953, cuando
Grubhofer y Shleith inmovilizaron varias enzimas, como carboxipeptidasa,
diastasa, pepsina y ribonucleasa, en resma de poliestireno diazotada,
mediante enlace covalente. En 1956, Mitz informó sobre el enlace iónico de
catalasa a DEAE-celulosa. En 1963, Bernfeld y Wan lograron la
inmovilización por atrapamiento de tripsina en gel dc poliacrilamida y Quiocho
y Richards inmovilizaron por entrecruzamiento con glutaraldebido la
carboxipeptidasa A. Chang, en 1964, consiguió la inmovilización por
encapsulación de anhidrasa carbónica. En 1971, Gregoriadis preparó
liposomas que contenían amiloglucosidasa. El estudio teórico de la
inmovilización de enzimas durante este periodo inicial fue encabezado por
Katchalski-Katzir y colaboradores (Wiseman, 1985).

Por ejemplo, las enzimas inmovilizadas se utilizan en química sintética, en


los electrodos enzimáticos, en los termistores y en dispositivos analíticos y
son muy útiles en terapéutica en forma de puentes extracorporales. También
se usan en la industria alimentaria y en la industria farmacéutica. Ciertas
enzimas, como la penicilin-acilasa, permiten la producción de antibioticos
semisintéticos en gran escala. Las enzimas que hidrolizan el almidón y sus
productos para obtener jarabes edulcorantes como los HFCS mueven un
mercado de miles de millones de dólares al aflo en USA, ya que, en ese país,
estos productos son competidores directos del azúcar de remolacha y caña.
Algunos ejemplos de los usos industriales de las enzimas inmovilizadas se
muestran en la Tabla 2.1 (Lalonde, 1997).

Tabla 2.1.- Usos industriales de algunas enzimas y células inmovilizadas

Tabla 2.2.- ventajas y desventajas de las enzimas inmovilizadas.


2.2. Usos comerciales

Las enzimas inmovilizadas son muy importantes para usos comerciales, dado
que poseen diversos beneficios para los procesos que involucran reacciones,
que incluyen:

2.2.1. Conveniencia: El proceso puede llevarse a cabo con minúsculos


aportes de proteína, lo que facilita mucho el trabajo. Una vez finalizado
el proceso, las mezclas de reacción por lo general contienen
únicamente solvente y los productos de la reacción.
2.2.2. Economía: La enzima inmovilizada es fácilmente removida de la
reacción, facilitando el reciclaje del biocatalizador.
2.2.3. Estabilidad: Las enzimas inmovilizadas típicamente tienen más
resistencia térmica y estabilidad operacional que la forma soluble de
la enzima.

En el pasado, los jabones en polvo biológicos y los detergentes contenían


muchas proteasas y lipasas que removían exitosamente la suciedad. Sin
embargo, cuando los productos de limpieza tomaban contacto con la piel,
desencadenaban reacciones alérgicas. Es por esto que las enzimas
inmovilizadas son importantes, no sólo económicamente.

2.3. Métodos de inmovilización

Existen cinco métodos principales para inmovilización de enzimas o células:


adsorción, unión covalente,

entrecruzamiento, encapsulamiento y atrapamiento (Chibata y col., 1986 a).


Los métodos más comunes de inmovilización son la adsorción, atrapamiento,
y la unión covalente a un soporte (Figura 1). El procedimiento de
inmovilización ideal para una enzima dada es aquel que le permite conservar
una alta actividad catalítica con el paso del tiempo para ser utilizada
continuamente (Singh y col., 2013). Dependiendo de la estructura de la
proteína y del material, así como de las condiciones de la reacción será el
método de inmovilización a utilizar. A continuación, se hace una breve
descripción de las técnicas convencionales de inmovilización.
Figura 1. Componentes de un sistema de inmovilización: enzima, soporte y
técnica de inmovilización; los métodos más comunes son (izq.) adsorción,
(centro) atrapamiento y (der.) unión covalente.

2.3.1. Adsorción

Es el método más simple de inmovilización, se basa en enlaces débiles,


aunque tiene cierta eficiencia en los procesos. Intervienen fuerzas de Van der
Waals, interacciones iónicas e hidrofóbicas y puentes de hidrógeno. Aunque
esta técnica es de fácil preparación, bajo costo, el soporte se puede recargar,
aún que hay inconvenientes en este método, uno de ellos es que el enlace
es reversible y sólo se puede monitorear la reacción en periodos cortos. Hay
una alta tasa de fuga del biocatalizador, enlace inestable, no es posible
controlar lo anterior y por lo tanto tiene un índice de reproducibilidad bajo.
Además, es muy susceptible a los cambios que se producen en el ambiente
como las modificaciones en el pH, temperatura y fuerza iónica. Entre los
soportes más utilizados se encuentran la carboximetilcelulosa, el almidón,
colágeno, sepharosa modificada, resinas de intercambio iónico, silica gel,
óxido de aluminio, titanio, tierra de diatomeas, cerámica, hidroxiapatita,
cerámica, etc (Joshi y col., 2005; 2006; Gorecka y col., 2011). Estos soportes
generalmente dan como resultado, cantidades bajas de proteína dispuesta (1
mg/g de soporte) y la elución continúa del sistema enzima/células. Con
algunos soportes, como el titanio, se forman uniones de carácter
parcialmente covalente que producen un complejo activo y estable. Otros
soportes utilizados para la adsorción son tanino- quitosano y tanino-
sepharosa (Abdel-Naby y col., 1999, a).
2.3.2. Atrapamiento

La técnica de atrapamiento, consiste en la inclusión de la enzima por unión


covalente o no, dentro de geles o fibras (Chiang y col., 2004; Klotzbach y col.,
2008; Subramanian y col., 1999). Además, minimiza la lixiviación de la
enzima y mejora su estabilidad, pero con frecuencia resulta en limitaciones
de transporte de sustrato / analito al sitio activo de la enzima. Sin embargo,
esta técnica permite la posibilidad de adaptar el material de encapsulación
para proporcionar el microambiente óptimo para la enzima, es decir, que
coincida con el entorno físico-químico de la enzima y el material de
inmovilización (Spahn y col., 2008). La encapsulación eficiente se ha
realizado empleando alginato de calcio, que previene la perdida de la enzima
y aumenta la estabilidad mecánica. El atrapamiento por medio de
nanomateriales, ha revolucionado el área de inmovilización de enzimas y ha
ampliado el rango de aplicaciones en el campo de la química fina,
biomedicina, biocombustibles, biosensores y medicina. La disminución en la
lixiviación y el aumento en el índice de eficiencia de atrapamiento, se ha
reportado en la actividad lipasa de Candida rugosa, mediante el uso de
quitosano como soporte; este material se considera no tóxico, biocompatible
y de fácil manipulación química, además de su alta compatibilidad con la
proteína dada su naturaleza hidrofílica. Así mismo, se ha reportado que la
carragenina es otro soporte adecuado para lipasa, pues es un material
tolerante a altas temperaturas y solventes orgánicos (Datta y col., 2013).

2.3.3. Unión covalente

La inmovilización por unión covalente, se basa en el entrecruzamiento de la


enzima y el material del soporte produciendo un enlace fuerte y estable. El
enlace covalente es formado entre el grupo funcional de la matriz del soporte
y la superficie de la enzima que contiene residuos de aminoácidos. La unión
es normalmente formada entre los grupos funcionales presentes en la
superficie del soporte y los grupos funcionales pertenecientes a los residuos
de aminoácidos en la superficie de la enzima. Los residuos de aminoácidos
que intervienen en la formación del enlace, son los grupos los amino (NH2)
de la lisina o la arginina (Tiller y col., 1999), el grupo carboxilo (COOH) del
ácido aspártico o ácido glutámico, los grupos sulfhidrilo de cisteína, los
grupos hidroxilo de (OH) de la serina o treonina (Chibata y col., 1986 a). Los
materiales utilizados en esta técnica incluyen la poliacrilamida, agarosa y
silica. Los polímeros de polisacáridos, que son muy hidrofílicos, son
materiales de soporte muy populares para la inmovilización de enzimas La
unión covalente de la enzima con el material del soporte requiere de dos
pasos: la activación del material de soporte que se lleva a cabo por la adición
de un compuesto reactivo y el segundo es la modificación del esqueleto del
polímero para activar la matriz. El paso de activación produce un grupo
electrofílico en el material del soporte, de esta forma el soporte reacciona con
los nucleófilos de las proteínas. Por ejemplo, el glutaraldehído es activado
cuando reacciona con los grupos amino de las proteínas (Nisha y col., 2012).

2.3.4. Entrecruzamiento

Este tipo de inmovilización consiste en la formación de una gran estructura


tridimensional compleja entre las mismas moléculas de la enzima por medios
físicos o químicos (Xie y col., 2009). Por lo general en los métodos químicos
se forman enlaces de unión covalente empleando ciertos agentes como el
glutaraldehído, ácido dicarboxílico o tolueno disocianato. Por métodos físicos
se utilizan agentes floculantes como poliaminas, polietilenamina, sulfonatos
de poliestireno y fosfatos (Elnashar, 2010). Este método también es
denominado cross-linking (Figura 2), es una técnica que ha sido ampliamente
utilizada en la estabilización de muchas enzimas (Wong y col., 1992). El
entrecruzamiento de una enzima fue descrito por primera vez Quiocho y
Richards en 1964 (Quiocho y col., 1964), utilizando glutaraldehído para
estabilizar los cristales de una enzima y realizar estudios de difracción de
rayos X, además, también se mantuvo la actividad catalítica de la enzima.

Figura 2. Inmovilización por entrecruzamiento o cross-linking


¿Por qué inmovilizar enzimas?

Existen varias razones para la preparación y uso de enzimas inmovilizadas,


por ejemplo una fácil separación de la enzima del producto (Hartmeier, 1986),
y la reutilización de la enzima (Buchholz y col., 1997). Esto último constituye
una de las principales ventajas de las enzimas inmovilizadas, pues su
utilización durante varios ciclos en los procesos a gran escala genera con el
paso del tiempo, una reducción de costos (Tischer y col., 1999, a). En la figura
3, se ejemplifica un esquema de producción con enzimas inmovilizadas.

Figura 3. Reactor de flujo continuo empleando un biocatalizador inmovilizado


que ejemplifica la fácil recuperación de la enzima por medio de ultrafiltración
y la salida del producto.

Un ejemplo típico es la utilización de glucosa isomerasa inmovilizada, enzima


que permite la obtención de 12.000-15.000 kg de jarabe de maíz de alta
fructosa al emplear un kilogramo de la misma, durante toda la vida operativa
del biocatalizador (Swaisgood, 2003).

Las enzimas de uso industrial en general se exponen a condiciones extremas,


tales como altas concentraciones de sustrato, un pH y temperatura elevados,
por consiguiente, para la mayoría de aplicaciones industriales deben ser
inmovilizadas con el objetivo de mejorar su selectividad, actividad y
durabilidad (Tischer y col., 1999, b).
2.4. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN

La inmovilización altera el comportamiento de las enzimas. Generalmente se


incrementa la estabilidad conformacional de las mismas (métodos de uniones
de tipo covalente y aun más, con la adición de grupos bifuncionales), se
aumenta la protección frente a proteasas y se evita la agregación
intermolecular. Se produce una alteración del microentorno de la enzima
debido a su interacción con el soporte, haciendo por ejemplo que enzimas
sensibles al oxígeno, como nitrogenasas ó hidrogenasas, vean favorecida su
actividad cuando están inmovilizadas, debido a que la fuerza iónica que tiene
el entorno disminuye la concentración efectiva de oxígeno en el medio.

Pueden perder total o parcialmente la actividad por interacciones con el


soporte, por impedimento del paso del sustrato al sitio activo, por interacción
con grupos cargados del soporte o por cambios conformacionales que den
formas inactivas. Otros cambios que afectan la actividad enzimática,
aumentándola o disminuyéndola, son producidos por efectos de difusión del
sustrato al sitio activo (por insolubilidad del soporte en el medio de reacción,
por impedimentos estéricos o por efectos electrostáticos entre el sustrato y el
soporte) y por efectos en el microentorno enzima-soporte.

2.5. APLICACIONES DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS

La inmovilización de enzimas permite una mejora significativa de su


estabilidad, lo que hace posible su empleo en la producción industrial de
productos químicos, farmacéuticos, alimentos; en el tratamiento de residuos;
en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, y otras muchas
aplicaciones (Arroyo, 1998). Las aplicaciones más importantes de las
enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en tres partes: como sensor
analítico, en el campo de la medicina y en el sector industrial.

1. Aplicaciones analíticas: como biosensores. Un biosensor es un


dispositivo analítico autónomo que incorpora un material biológicamente
activo en contacto íntimo con un elemento de transducción apropiado para
el propósito de detectar (reversible y selectivamente) la concentración o
actividad de las especies químicas en cualquier tipo de muestra (Arnold y
col., 1988).
Las enzimas fueron los primeros componentes biológicos utilizados en los
biosensores, y siguen siendo, los elementos más comúnmente empleados.
Los métodos enzimáticos son los más atractivos en los dispositivos de
detección, debido a su notable especificidad acción sobre un sustrato único
o grupos de sustratos (Mayank y Arya, 2014). Los biosensores pueden ser
utilizados en la industria de los alimentos, agricultura y diagnóstico
biomédico. El ejemplo más popular es el sensor basado en la glucosa
oxidasa, utilizado por individuos que sufren diabetes para controlar los
niveles de glucosa en la sangre. Alternativamente, algunos biosensores
utilizan medidores sensibles de fluorescencia, lo cuales monitorean los
cambios en la fluorescencia intrínseca de FAD de la glucosa oxidasa. Varios
biosensores basados en la glucosa oxidasa se enumeran a continuación; 1)
El monitoreo de la glucosa en las fermentaciones, 2) Biosensor de fibra
óptica para el análisis de las concentraciones de glucosa en refrescos, 3)
Biosensor desechable del tipo tira para la sangre y suero, 4) Biosensor para
sangre (GO-HPR-colorante), 5) Biosensor térmico miniaturizado para la
sangre entera y 6) Sensor de glucosa de sangre entera (Sandip y col., 2009).

2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas. El


estudio de las enzimas inmovilizadas para aplicaciones biomédicas se inició
en la década de 1960 (Liang y col., 2000 a), con el objetivo de resolver
algunas de las limitaciones para el uso de enzimas clínicas. Desde entonces,
varios enfoques han sido utilizados en la terapia de enzimas ya sea para la
detección de sustancias bioactivas en el diagnóstico de enfermedades o con
el objetivo de tratar una condición de enfermedad (Pastor y col., 2006) Por
ejemplo la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de leucemias y
cánceres diseminados que requieren asparragina para desarrollarse. Se ha
diseñado un hemodializador de fibra hueca que contiene asparaginasa
inmovilizada (Callegaro y Denti., 1983). Se han probado preparados de
enzimas microencapsuladas para tratar enfermos con alteraciones
genéticas, en las cuales estaban ausentes algunas enzimas. También los
preparados pueden ser utilizados para mejorar la digestión, eliminando
metabolitos tóxicos y prevenir el desarrollo de tumores. Debido a su
aplicación práctica, el estudio de las enzimas inmovilizadas en los soportes
o microencapsuladas permitirá una mejor comprensión de su funcionamiento
in vivo (Dainichenko, 1988). En la tabla 1 se muestra algunas enzimas que
han sido inmovilizadas por propósito clínico.
3. Aplicaciones industriales: en la industria química, farmacéutica,
alimentaria y de tratamiento de residuos. Una de las principales aplicaciones
de la inmovilización de enzimas a nivel industrial es para la producción de
diversos L-aminoácidos, tales como L-alanina, L-isoleucina, L-metionina, L-
fenilalanina, L-triptofano y L-valina por aminoacilasa fúngica (E.C. 3.5.1.14)
inmovilizada mediante unión iónica sobre DEAE-Sephadex (Aehle, 2007).

Los aminoácidos son ampliamente empleados en la industria de los


alimentos, nutrición, medicina y cosméticos así como materiales iniciadores
de síntesis químicas. Las aplicaciones alimenticias y de nutrición solo
emplean los L-isómeros activos de aminoácidos (Chibata y col., 1986 b). Uno
de los aminoácidos que se producen desde 1973 con enzimas inmovilizadas
es el L-aspártico, por medio de un sistema continuo que consta de una
columna con enzima inmovilizada. En el sistema, la aspartasa (4.3.1.1)
extraída de células de Escherichia coli se inmovilizaron por la técnica de
atrapamiento en gel de acrilamida y la columna se empleó para la producción
continua industrial (Tosa et al., 1973). Años más tarde, esta matriz fue
sustituida por carragenina y la producción del aminoácido aumentó hasta
tener un rendimiento de 100ton/mes utilizando un reactor de 1 kilolitro
(Chibata y col., 1986 b).
Otros ejemplos de enzimas inmovilizadas son la enzima penicilina acilasa
(amidasa (E.C. 3.5.1.11), ahora es utilizada es ampliamente en la producción
del ácido-6-aminopenicilanico de la pencilina G y la glucosa isomerasa (E.C.
5.3.1.18) se utiliza en la producción de jarabe de alta fructosa a partir de la
glucosa (Aehle, 2007).
Como ejemplo para el tratamiento de residuos, tenemos a Thiobacillus
denitrificans, el cual es utilizado en el tratamiento de aguas residuales que
contienen nitrato, utilizando el método de tres veces
congelado/descongelado para inmovilizarlo con PVA (Zhang y col., 2008).
Otras enzimas empleadas en de la industria alimentaria, son las
carbohidrasas que tienen una gran aplicación como se muestra en la tabla
2. Con estas enzimas es posible obtener diferentes tipos de jarabes de
azúcar, prebióticos e isomaltulosa. Las carbohidrasas más importantes son
de origen microbiano e incluyen amilasas, invertasas, inulinasas,
galactosidasas, glucosidasas, fructosiltransferasas, pectinasas y
glucosiltransferasas (Jares y col., 2013).
Tabla 3. Inmovilización de enzimas carbohidrasas con diferentes técnicas y
sus aplicaciones en la industria alimentaria (Jares y col., 2013).

Para que estas enzimas sean rentables para la industria, requieren una
técnica de inmovilización eficiente, simple y de bajo costo. En la siguiente
tabla se muestran dichas enzimas y su método de inmovilización, así como
su aplicación en la industria.

CONCLUSIONES

El uso y la aplicación de enzimas inmovilizadas en diferentes áreas, es muy


extenso y han sido de gran impacto por que han minimizado los costes de
operación y por la facilidad en la recuperación de la enzima y separación del
producto. Esto se debe principalmente a la reutilización del biocatalizador
inmovilizado, lo cual permite que a nivel industrial y otras áreas de aplicación
sea considerado como una tecnología rentable.
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