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CRECIMIENTO MICROBIANO
Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asincrónicos puesto
que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular.
Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran células que
acaban de dividirse, otras que están replicando su ADN, otras que están credciendo,
otras que están iniciando la división celular, etc.
Los cultivos sincrónicos son muy difíciles de mantener por lo que su importancia
está principalmente ligada a los estudios básicos de biología microbiana. Sin embargo,
en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento
próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronización del culti-
vo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente
se comporten como relativamente sincrónicas.
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Microbiología General
Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
MEDIOS DE CULTIVO
C4H7O2N
lo que supone que los componentes de las células son: carbono que representa alrede-
dor del 50% del peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno (14%), fósforo (3%), azufre (en
torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co,
Mb, Cu y Zn.
C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056
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Microbiología General
Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algún
agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente
agar).
En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden
ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos
mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferencia-
les cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de
microorganismos (por ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de micro-
organismos hemolíticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos característi-
cas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y
medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganis-
mo a partir de una mezcla una población mixta de gran tamaño.
MÉTODOS DE AISLAMIENTO
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Microbiología General
Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos y para poder
identificarlos con seguridad.
Sin embargo, cada vez se va conoce más sobre el funcionamiento de las comunida-
des bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro
supone unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiología de los mi-
croorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en condi-
ciones de cultivos puros.
Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que se
producen en cada división continúan su vida independientemente formándose una sus-
pensión de células libres.
1.- Fase lag o de adaptación durante la que los microorganismos adaptan su meta-
bolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones
de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.
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Microbiología General
Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
4.- Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del
cultivo.
Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos
líquidos se presentan también en cultivos sólidos. La cinética de crecimiento, en este
caso, se puede estudiar siguiendo la evolución del número de células viables por unidad
de superficie o por unidad de masa.
Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido, el
resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se deno-
mina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que si
se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la produc-
ción de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el número inicial de bacterias por
unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se lla-
ma un césped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio.
Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicación (crecimiento)
de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las con-
diciones físicas o químicas del entorno. En estos casos, podríamos considerar como
muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de
nuevo favorables.
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Microbiología General
Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
2.- Medida de la masa de células: el sistema se basa en que las células en suspen-
sión dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en
suspensión y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parámetro de
medida más fácil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de células debe ser
del orden de 105 por ml.
6.- Medida de actividad metabólica de las bacterias como que respiran producen
una disminución del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia
del consumo de oxígeno (utilización de colorantes sensibles a oxidación-reducción tales
como el azul de metileno).
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
N = N0 2n (ecuación 1)
n=t/τ (ecuación 2)
N = N0 2t/τ (ecuación 3)
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Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente, por ello es
mejor transformarlas en otras más simples. Para transformar una ecuación exponencial
en una recta, tomamos logaritmos en los dos términos y resulta:
Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón
de una constante igual a ln2/τ. Si el tiempo de generación τ es muy grande, el creci-
miento tendrá poca pendiente (será lento) y si τ es pequeño el crecimiento será rápido.
dN/dt = µN (ecuación 5)
esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es propor-
cional al número de células presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionali-
dad (µ) se le denomina tasa de crecimiento.
N = N0 eµt (ecuación 6)
esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con el
tiempo siendo la constante de proporcionalidad µ.
Comparando esta ecuación (7) con la similar presentada más arriba (4), podemos
concluir que µ = ln2/τ y, por consiguiente, que τ = ln2/µ. Es decir, que hay una correla-
ción inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo de generación (τ).
Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa celular,
etc. después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ; o bien, poder calcular la
tasa de crecimiento µ a partir de medidas experimentales del incremento en el número
de células, biomasa, etc.
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
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Microbiología General
Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
En función de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pue-
den crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halófilos y xerófilos
según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente.
El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que,
en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una
diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica.
El pH interno en la mayoría de los microorganismo está en el rango de 6.0 a 7.0.
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de
crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH del
medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a
otros microorganismos competidores. Así, por ejemplo, las bacterias lácticas que produ-
cen grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primario
reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacte-
rias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias
competidoras mueren y las lácticas se convierten en la población dominante.
La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación
de ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico, acético, láctico) por ciertas bacterias. En
este sentido, hay que tener en cuenta que la acción bactericida de estos ácidos orgánicos
de cadena corta es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que produ-
cen. Esto es, los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por
sí mismos.
El efecto letal del pH ácido sobre los microorganismos tiene aplicación en la conser-
vación de alimentos acidificándolos. De esta forma, la adición de ácido acético en forma
de vinagre permite la conservación de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo)
y la producción de ácidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la
vida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo).
4.- Potencial redox: nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar elec-
trones, esto es: sus características oxidantes o reductoras. Uno de los factores que in-
tervienen en el potencial redox, aunque no el único, es la concentración de oxígeno
[O2].
Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que
otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganis-
mos presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones oxidantes o reducto-
ras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para que
se produzca el crecimiento.
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
electrones que actúa como oxidante ambiental. Por ejemplo, las bacterias que "respiran"
nitratos (NO3-), sulfatos (SO42-) u otros compuestos orgánicos oxidados (respiración
anaerobia).
Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabo-
lismo. Esto es: en presencia de oxígeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su
ausencia, fermentativo. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el
de los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen
fermentando que cuando lo hacen respirando.
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
Ys = dN/dS (ecuación 8)
Ys = dN/dS (ecuación 8)
µ = Ys qs (ecuación 11)
Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, también mayor
será la tasa de crecimiento.
Sin embargo, hay una cierta compensación entre la tasa de consumo del substrato y
el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de
substrato tienen rendimiento más bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta
tasa, el rendimiento disminuye). A esta relación inversa se le conoce con el nombre de
efecto Pasteur.
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La expresión "3engordar" está usada de forma metafórica: las bacterias no engordan. La uso porque
resulta útil esta metáfora antropòmórfica para entender algunos de los conceptos relacionados con el ren-
dimiento de cultivos.
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
Por último, nos falta relacionar la tasa de crecimiento (µ) con la concentración de
substrato (S). En condiciones de substrato abundante, la concentración de este no afecta
al valor de µ; pero cuando el substrato se hace limitante, sí existe ese efecto. La expre-
sión matemática que relaciona ambos parámetros se conoce con el nombre de ecuación
de Monod y es la siguiente:
En esta ecuación la tasa de crecimiento (µ) depende de la máxima que puede alcan-
zar el microorganismo (µmax), de la concentración de substrato (S) y de un valor cons-
tante, Ks, que representa la concentración de substrato a la que se alcanza una tasa de
crecimiento igual a la mitad de la máxima. La ecuación de Monod tendrá mucha im-
portancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuación el rendi-
miento debe ser independiente de la concentración de substrato.
En la práctica, los valores de Ks suelen ser muy bajos, lo que indica que los microor-
ganismos crecen con tasas (µ) muy próximas a las máximas (µmax) a concentraciones de
substrato bajas y sólo cuando estas son extremadamente bajas, la velocidad de creci-
miento se reduce. Esto es debido a que los sistemas de transporte de nutrientes suelen
tener valores de Km considerablemente reducidos (La Km indica la concentración de
substrato a la que la velocidad de transporte es la mitad de la máxima)
Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que estén
creciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente pro-
ductos de interés (biomasa, metabolitos secundarios, etc.). Este tipo de cultivo es tam-
bién importante en los estudios de fisiología y de ecología microbiana. En la naturaleza
un ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjunto
de procesos microbianos intestinales de todos los animales.
QUIMIOSTATO
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por consi-
guiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el número de volúmenes de
reactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor por unidad de tiempo.
Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de subs-
trato está dentro del reactor.
Tiempo de generación
concentración de substrato
Velocidad de dilución
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Microbiología General
Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
que permite calcular cómo varía la concentración del nutriente limitante en el efluente
en función de la tasa de dilución D.
TURBIDOSTATOS
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En realidad, esto no es una demostración de que en el steady state las tasas de dilución y crecimiento se
igualan, ya que en los cáculos se partía de esta condición para poder reformular la ecuación de Monod.
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
CULTIVO SEMI-CONTINUO
Podemos distinguir dos grandes tipos de fermentadores según el estado del medio de
cultivo: fementadores líquidos y sólidos.
FERMENTADORES LÍQUIDOS
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
Fermentadores en tanque
La aireación se consigue por un difusor de aire que emite desde la parte inferior de la
cuba de fermentación. La transferencia de oxígeno al cultivo se hace por las burbujas
que van ascendiendo por el volumen de cultivo.
Fermentadores Air-lift
la entrada de aire produce un convección que se canaliza por un tubo vertical interior en
la cuba. La aireación también permite reducir la cantidad de calor producida durante la
fermentación.
En este fermentador, las burbujas de aire van aumentando de tamaño conforme as-
cienden por el tubo interior por lo que su relación superficie/volumen disminuye y la
transferencia de oxígeno al cultivo es menor.
Fermentadores Deep-Jet
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Tema 2.- Cultivo de microorganismos.
FERMENTADORES SÓLIDOS
1. Tambor
2. Bandejas
3. Sistema de lecho (bed system)
Por otra parte, existen sistemas semisólidos en los que los microorganismos están
adheridos a superficies estáticas y los nutrientes pasan por filtración o goteo a través de
ellos (sistema de la producción de vinagre por goteo), o los microorganismos se en-
cuentran formando agregados que se mantienen en suspensión por medio de una co-
rriente de medio de cultivo líquido (reactores de lecho fluidificado).
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