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CLASE ESPECIAL

ELISA Y WESTERN BLOT


Estructura de los anticuerpos
Tipos de anticuerpos
Variantes de anticuerpos en medicina e investigación
1. Anticuerpos policlonales: múltiples anticuerpos
que se unen al mismo antígeno.

2. Anticuerpos Monoclonales: son anticuerpos


específicos para un único epítopo de un antígeno.

3. Abzimas

4. Faboterápicos: antídotos contra venenos de


picaduras por animales como serpientes o
artrópodos, se fabrican antisueros mediante
suero crudo o bien altamente enriquecido en
inmunoglobulinas.
Producción de anticuerpos
Anticuerpos Policlonales Anticuerpos monoclonales

Ag de interés
Célula
mieloma
Célula B
Productora
de Ab Fusión
Híbridos
Selección de
Hibridoma
de interés

Anticuerpos heterogéneos Anticuerpos homogéneos


FUNDAMENTO DE LAS TÉCNICAS
INMUNOLOGICAS
Ac  secundario
marcado  *
Muestra
biológica

Determinación o detección de proteínas, a través de la unión


competitiva; en la que un anticuerpo se fija a una proteína o parte de
esta (epítope)
A) Inmunocitoquimica (Ac´s acoplados a enzimas)
B) Inmunoflorescencia (Ac´s acoplados a fluoróforos)
C) Inmunoquimioluminiscencia (Ac´s acoplados a sustancias
quimioluminiscentes).
D) Radioinmunoensayo (Ac´s acoplados a radioisotopos).
ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay)
(Ensayo por inmunoadsorción ligado a
enzimas')
ELISA directo (Sandwich),
detecta Ag
Y
Anticuerpo clona 2

Anticuerpo clona 1
ELISA indirecto, detecta Ac

De  cabra
-­Antihumano
Y
Humano

Ag
El Western blot

Inmunoblot

Inmuno-electrotransferencia

Técnica analítica usada para detectar


proteínas específicas en una muestra
determinada (una mezcla compleja de proteínas,
como un extracto tisular).
¿Que se necesita para un ensayo de western blot?
Western blot
Proceso del ensayo de western blot?
2 pasos importantes…..

SDS-PAGE WB Incubación con un mAb


Western blot
Quantitative Western  Blots Enhanced chemiluminescence (ECL)
Geles de 2D…. Peso molecular vs pH
Maestría en Investigación
Clínica

Biología Molecular: ADN y ARN


Dr. Sergio López Briones
Agosto, 2017

Semestre Agosto-Diciembre, 2017


ACIDOS NUCLEICOS
Las moléculas gigantes de la vida
La totalidad de los sistemas vivientes, desde los “virus” hasta el hombre, debe
su origen, sus propiedades y su desarrollo a dos clases de macromoléculas:
los ácidos nucleicos y las proteínas
ACIDOS NUCLEICOS
Los seres vivos se encuentran dos tipos de ácidos nucleicos: el ADN
y ARN. Ambos tienen semejanzas químicas pero las funciones que
desempeñan son diferentes. En conjunto, son los responsables de la
manifestación de todas las características y funciones del organismo.
ESTRUCTURA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

1. Los ácidos nucleicos son grandes moléculas constituidas por la


unión de monómeros, llamados nucleótidos.
2. Reciben este nombre debido a su presencia en el núcleo.
3. Nucleótidos: son moléculas que se pueden presentar libres en la
Naturaleza o polimerizadas, formando ácidos nucleicos.
4. También pueden formar parte de otras moléculas que no son
ácidos nucleicos, como moléculas portadoras de energía o
coenzimas
5. Los nucleótidos se forman por la unión de una base nitrogenada ,
una pentosa y uno o más ácidos fosfóricos
6. La unión de una pentosa y una base nitrogenada origina un
nucleósido , y su enlace se llama N – glucosídico
7. Por ello, también un nucleótido es un nucleósido unido a uno o
más ácidos fosfóricos.
8. Las bases nitrogenadas pueden ser Púricas o Pirimidínicas
BASES NITROGENADAS
BASES NITROGENADAS
Debido a la estructura particular de estas bases:

A–T

G-C
COMPLEMENTARIEDAD DE LAS BASES Y
ESTRUCTURA HELICOIDAL

Modelo de “escalera”, formada por


dos cadenas de ADN enfrentadas.

Se retuerce dando lugar a una doble


hélice con giro hacia la derecha.

A través de uniones del tipo puente


hidrógeno
NO  SE  HA  ENCONTRADO  EN   SEÑALES  PARA  LAS  PROTEÍNAS  
CONDICIONES  FISIOLOGICAS,  FORMA   REGULADORES  DE  LA  EXPRESIÓN  
B  DESECADA GÉNICA
UBICACIÓN CELULAR DEL ADN
1. Casi todo el ADN de las células eucariotas se encuentra en el núcleo celular
(también se lo encuentra dentro de mitocondrias y cloroplastos ).
2. Las moléculas de ADN presentes en el núcleo se enroscan alrededor de las
moléculas de histonas (proteínas), formando, las fibras de cromatina
3. Forman una estructura bien compacta , con forma de bastón, llamada
cromosoma.
4. El número de cromosomas,
es constante y característico para cada ser vivo.
Número de cromosomas en:

Humano Otros mamíferos


Ácidos nucleicos como: Energía o cofactores
Trifosfato de adenosina (ATP)
Dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD)
RNA: UBICACIÓN CELULAR
El ARN mensajero (ARNm) da lugar de la síntesis de proteínas. La secuencia
de nucleótidos del ARNm determina la secuencia de aminoácidos de la
proteína. Por ello, el ARNm es denominado ARN codificante.

No obstante, muchos ARN no codifican proteínas, y reciben el nombre de


ARN no codificantes; el ARN de transferencia (ARNt) y el ARN ribosómico
(ARNr), que son elementos fundamentales en el proceso de traducción, y
diversos tipos de ARN reguladores
Citoplasma

Ribosomas
TIPOS DE ARN
1. ARNm (mensajero): se forma en el núcleo a partir del molde de ADN,
contiene una única cadena de nucleótidos que es complementaria. Luego
pasa al citoplasma.
2. ARNt (transferencia): se encuentra en el citoplasma, es más pequeño
que los anteriores y se encarga de transportar los aminoácidos.
3. ARNr (ribosómico): se encuentra en el citoplasma y se fija a los
ribosomas
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

ANTES

AHORA
CÓDIGO GENÉTICO
1. El ADN contiene un “lenguaje” propio llamado código genético.

2. En este “idioma”, tres bases de ADN (un triplete) conformarían una


“palabra” o codón.

3. Cada codón es una clave para designar


uno de los 20 aminoácidos diferentes.

4. Es la relación que existe entre una


determinada secuencia de nucleótidos
en el ADN y la secuencia de aminoácidos
de una proteína dada.

5. Esta relación mediada por el ARN


mensajero se establece por la correspondencia
entre cada uno de los aminoácidos y una
determinada secuencia de tres nucleótidos.
Características del código genético
1. Es universal. Lo utilizan casi todos los seres vivos
conocidos. Solo existen algunas excepciones en unos pocos
tripletes en bacterias.

2. No es ambiguo, pues cada triplete tiene su propio


significado. Todos los tripletes tienen sentido, bien codifican
un aminoácido o bien indican terminación de lectura.

3. Está degenerado. Hay varios tripletes para un mismo


aminoácido, es decir hay codones sinónimos.

4. Carece de solapamiento, es decir los tripletes


no comparten bases nitrogenadas.

5. Es unidireccional. Los tripletes se leen en el


sentido 5´-3 ´.
CÓDIGO GENÉTICO
De 25 a 35,000 genes
Maestría en Investigación
Clínica
Biología Molecular: Genes y Replicación
del ADN
Dr. Sergio López Briones
Septiembre, 2017

Semestre Agosto-Diciembre, 2017

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