I.

INTRODUCCIÓN

La inmunología es una ciencia relativamente Nuevo que se ha desarrollado rápidamente en

las últimas pocas décadas. Los inmunoensayos son uno de los progresos analíticos más

útiles asociados con esta nueva ciencia.

Mientras que las variantes de los inmunoensayos son demasiado numerosas como para ser

cubiertas completamente en el presente capítulo, hay varios procedimientos que se han

convertido en pautas para el análisis de los alimentos, gracias a su especificidad,

sensibilidad y sencillez. Los inmunoensayos son utilizados ampliamente para el análisis de

los residuos presentes en los alimentos, la identificación de las bacterias y los virus, y la

detección de las proteínas. La detección de las proteínas es importante para la

determinación de los alérgenos, la autentificación de las especies cárnicas y la detección de

los vegetales modificados genéticamente. Con cualquier campo científico nuevo se elabora

una jerga para los términos importantes. Para comprender completamente los

inmunoensayos es necesario definir algunos de estos términos.

Las dos partes claves de cualquier inmunoensayo son los antígenos y los anticuerpos. Un

antígeno es cualquier molécula que induce la formación de anticuerpos. Los anticuerpos

son proteínas producidas por los animales como respuesta a un antígeno. Dichas proteínas

se unen al antígeno en particular, responsable de su inducción.

Los anticuerpos pueden desarrollar afinidades de unión notablemente fuertes por sus

antígenos. Dichas afinidades se encuentran entre las interacciones intermoleculares no

covalentes más fuertes conocidas entre las moléculas. No es excepcional que se obtengan
constantes de afinidad, para la unión entre el anticuerpo y el antígeno, que alcancen los

1012 L/mol. Esto significa que, en el equilibrio, con concentraciones similares del a¡¡

cuerpo y el antígeno, ¡habría un trillón (1 trillón anglosajón, es decir, un millón de

millones) de antígenos unidos por cada uno de los antígenos libres!

Puesto que el anticuerpo y el antígeno son cruciales para cualquier inmunoensayo, resulta

útil comprender mejor la estructura básica del anticuerpo y cómo se une al antígeno. La

Figura 17-1 es una ilustración esquemática convencional de un anticuerpo. El anticuerpo es

una molécula con forma de «Y», compuesta por cuatro cadenas poli peptídicas que se

encuentran unidas por enlaces disulfuros dentro y entre las cadenas. Dos de las cadenas

poli peptídicas son idénticas y, aproximadamente, el doble de grandes que las otras dos

cadenas poli peptídicas idénticas entre sí. A causa de sus tamaños relativos primer par se

conoce como las cadenas pesadas (H) y el segundo par como las cadenas ligeras (L). En

conjunto un anticuerpo es una proteína muy grande, de peso molecular aproximado

150.000.

El antígeno es ligado por dos lugares de unión idénticos, formados por las porciones

terminales de una cadena pesada y otra ligera en la parte. Superior de la “Y”

Los diferentes anticuerpos, producidos por las distintas. Células B, pueden presentar

muchas variaciones en las secuencias de aminoácidos en las proximidades de los lugares de

unión, tanto para la cadena pesada como para la ligera. Esto conduce a una diversidad

extraordinaria

de lugares de unión para los diferentes anticuerpos. Por ejemplo, un ratón posee 107-108

anticuerpos diferentes (y, como mínimo, el mismo número de células B distintas), cada cual
con un Jugar de unión exclusivo. El resto, del anticuerpo (apartado del lugar de unión) es

bastan1c constante y las pequeñas variaciones en esta región dan como resultado las

diferentes clases de anticuerpos. La Figura 17-1 es, en realidad, un ejemplo de la clase más

común de anticuerpos encontrados en el suero de los mamíferos, la inmunoglobulina G, o

más sencillamente, lgG

Para comprender los inmunoensayos, la parte a estudiar más importante del anticuerpo es el

lugar de unión El lugar de unión del antígeno es una hendidura entre lazos de una cadena

poli peptídica pesada y una ligera Desde un punto de vista molecular, esta hendidura es

bastante grande. Algunos experimentos con hidratos de carbono han indicado que el lugar

de unión está relleno de un oligosacárido dextrano formado por siete unid des de glucosa.

Dicho de otra manera, el peso molecular de la porción del antígeno que puede ocupar dicha

hendidura es, aproximadamente, 1.000 g/mol.

La comprensión del lugar de unión del anticuerpo ayuda a definir más a fondo el antígeno

ligado. El anticuerpo se une a la parte exterior del antígeno en una región especifica. Esta

región específica ligada por un único lugar de unión del anticuerpo se conoce como el

epítopo (o determinante antigénico). Por otra parte, la unión del anticuerpo al antígeno no

supone un enlace covalente sino las mismas interacciones que son responsables de la

estructura terciaria de las proteínas. Estas interacciones incluyen las electrostáticas, los

enlaces de hidrógeno y las fuerzas de van der Waals. Mientras que estas últimas

interacciones, las de van der Waals, ·son las más débiles, a menudo pueden ser las más

importantes debido a que cada uno de los átomos puede contribuir a la unión anticuerpo-

antígeno, siempre que los átomos se encuentren muy próximos unos a otros (general

aproximadamente 0,3-0,4 nm). Este requisito de una es- trecha proximidad es la causa de
que la unión del anti- cuerpo al antígeno sea considerada como algo parecido a la

interacción entre una cerradura y una llave, en la cual las superficies del lugar de unión del

anticuerpo y del epitopo del antígeno son complementarias la una de la otra.

Una variable trascendental en un inmunoensayo es el tipo de anticuerpo utilizado. Cuando

se utiliza anticuerpo sérico de cualquier animal, hay muchos anticuerpos diferentes que

ligan a diferentes epítopos sobre el antígeno. Este conjunto de anticuerpos diferentes se

conoce como anticuerpos policlonales. Los científicos sabían que las células B individuales

producían anticuerpos con sólo un tipo de lugar de unión, pero eran incapaces de cultivar

las células B fuera del animal. Sin embargo, en 1975, Kohler y Milstein (1) fusionaron con

éxito células de mieloma, o cáncer, 'con células B. Las nuevas células fusionadas, o

hibridomas, retenía las propiedades de ambas células progenitoras. Es decir, podían ser

cultivadas, al igual que las células cancerosas, y producían anticuerpos como las células B.

Los anticuerpos producidos por medio de este procedimiento pasaron a ser conocidos como

anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son idénticos en todos los

aspectos y se unen al antígeno con sólo un tipo de lugar de unión; es decir, un único epitopo

es ligado. Por otra parte, los hibridomas eran «inmortalizados» mediante el procedimiento

y, con un cuidado apropiado, podían producir tanta cantidad de anticuerpo idéntico como

fuese requerida. No le llevó mucho tiempo a la comunidad científica apreciar las tremendas

ventajas de dichos anticuerpos monoclonales y; en 1984, Kohler y Milstein fueron

galardonados con el Premio Nobel por su trabajo. Mientras que, de entrada, los anticuerpos

monoclonales son mucho más costosos de producir, hay la posibilidad de obtener ilimitados

anticuerpos idénticos, con frecuencia de orígenes no animales, tales como la producción de

los hibridomas a gran escala, en cámaras para el crecimiento de células. Para muchos
fabricantes de inmunoensayos, estas ventajas pesaron más que lo costes iniciales de

desarrollo.

II. LA TEORIA

Todos los inmunoensayos deben cumplir dos requisitos. El primero es que debe haber

algún método para separar o distinguir entre el antígeno libre y el antígeno ligado. En

segundo lugar, el antígeno o el anticuerpo deben ser cuantificables - a bajas

concentraciones, para una sensibilidad máxima. La detección a muy bajas concentraciones

ha exigido marcajes muy activos. Uno de los primeros procedimientos de inmunoensayo

fructuosos fue desarrollado por Yalow y Berson (2), en 1960. Este procedimiento hace uso
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de yodo radioactivo; ·_ I, un radioisótopo «caliente» con una vida media de tan. sólo

ocho días. Esta rápida desintegración radioactiva permitió cumplir el segundo requisito de

los inmunoensayos: la cuantificación a bajas concentraciones. Yalow y Berson hicieron uso

de la cromatoelectroforesis en papel para separar el antígeno unido al anticuerpo, del

antígeno libre, satisfaciendo así el primer requisito para un inmunoensayo. Para otros

antígenos, se ha desarrollado una diversidad de técnicas de separación, las cuales incluyen

la adsorción del antígeno libre sobre carbón activo o la precipitación selectiva con sulfato

de amonio o polietilenglicol. Sin embargo, con todas las modificaciones en la separación,

permaneció el marcaje con yodo radioactivo y estos ensayos pasaron a ser conocidos como

los radiolnmunoens1yos o RIA.

Una característica común de las proteínas, la cual resulta útil en los inmunoensayos, es la

unión de las pro- teínas a las diversas superficies hidrófobas. Las proteínas presentan

amplias regiones que contienen grupos hidrófobos, los cuales prefieren no ser expuestos al

agua. Estos grupos hidrófobos apolares incluyen los hidrocarburos y los grupos aromáticos,

los cuales prefieren interactuar con grupos semejantes, antes que con un di- solvente polar

tal como el agua. En condiciones acuosas, estas regiones se unirán a otras superficies

hidrófobas por medio de interacciones de van der Waals, excluyen- do el agua. Las

superficies que, habitualmente, se pro- ponen en los inmunoensayos para aprovecharse de

este tipo de unión incluyen el carbón vegetal, la nitrocelulosa y el plástico. Para los

inmunoensayos, se utilizan muy comúnmente recipientes de plástico de muchos tipos. Entre

los más populares se encuentran las microplacas, hechas de plásticos tales como el
poliestireno. Típica- mente, dichas microplacas se fabrican con un formato de 96 pocillos

individuales, cada uno de ellos con una capacidad de, aproximadamente, 300 µL de

disolución. Para identificar los pocillos, las filas se etiquetan verticalmente desde la A hasta

la H y las columnas se numeran horizontalmente de la 1 a la 12. Es importante darse cuenta

de que las proteínas se unen aleatoriamente al fondo y las paredes de los pocillos de la

placa, por me- dio de interacciones hidrófobas. Las interacciones hidrófobas entre las

proteínas y estas superficies aumentan a temperaturas más bajas (a causa de una menor

agitación molecular) y con una fuerza iónica de la disolución incrementada (que aumenta la

polaridad del disolvente). Además, los detergentes pueden recubrir las superficies

hidrófobas y deben ser utilizados con cuidado, de tal modo que no interfieran con la unión

de las proteínas a la superficie hidrófoba.

III. ALGUNAS VARIACIONES DEL INMUNOENSAYO ENZIMATICO

(ELISA)

1. UNA VISIÓN DE CONJUNTO

Por más que los RIAs daban buenos resultados, estaban confinados a laboratorios

especialmente equipados, debido a los peligros asociados con la utilización del yodo

radioactivo. Los inmunoensayos no se desarrollaron para un uso más general, incluyendo el

uso de campo, hasta que se desarrollaron los marcadores enzimáticos. Unos pioneros de

este desarrollo fueron Engvall y Perlmann (3), quienes en 1971 desarrollaron un

inmunoensayo al que denominaron ensayo inmunosorbente ligado a los enzimas, o ELISA.

También ayudaron a popularizar el uso de la separación de las proteínas utilizando plásticos

hidrófobos, tales como el poliestireno. Estos desarrollos extendieron la utilización de los

inmunoensayos a tantas áreas de investigación que aún se utiliza vulgarmente el término

ELISA para describir todos los inmunoensayos enzimáticos.

El enzima ideal para un ELISA o un inmunoensayo enzimático es uno que sea muy estable,

se enlace fácil- mente a los anticuerpos o los antígenos, y catalice rápidamente un cambio

observable frente a un sustrato sim- ple. En la etapa final de un ELISA, el enzima sobrante

reacciona con un sustrato para generar una molécula que es coloreada y que puede ser

cuantificada espectrofotométricamente. El tipo de espectrofotómetro utilizado para el

seguimiento del desarrollo de la coloración causada por la acción del enzima se conoce

como un lector de placas para ELISA. Sorprendentemente, con los muchos enzimas

disponibles, un enzima, la peroxidasa de rábano silvestre (o rábano picante) es, con mucho,

el más popular (4). La peroxidasa de rábano silvestre es muy estable, con muchos

procedimientos actualmente desarrollados para sujetarlo covalentemente a una diversidad

de moléculas. Sin embargo, lo más importante es el hecho de que este enzima presenta, con

muchos sustratos incoloros, con velocidad de reacción catalítica muy rápida, para producir

una coloración. Otros enzimas utilizados para los inmunoensayos incluyen la fosfatasa

alcalina, la β-galactosidasa y la ureasa. Después de la peroxidasa de rábano silvestre, la

fosfatasa alcalina ha sido el siguiente enzima más popular para los ínmunoensayos

enzimáticos.

En la sección siguiente se describen tres variantes de inmunoensayos enzimáticos: el de

emparedado, el competitivo y el indirecto. La variante de inmunoensayo indirecto se puede

aplicar a ambos formatos: el de empareda- do y el competitivo. Por ejemplo, una variante

podría ser un ínmunoensayo competitivo indirecto. Con el formato ELISA de emparedado,

la cantidad de desarrollo de coloración está directamente relacionada con la cantidad de

antígeno presente en la muestra. Con cualquier formato

de ELISA competitivo, hay una relación inversa entre la cantidad de color desarrollada y la

cantidad de antígeno presente en la muestra (véase la 'Figura 17-2)

2. LOS INMUNOENSAYOS DE EMPAREDADO

Uno de los formatos más populares para un ínmu-noensayo enzimático es el

inmunoensayo de empare- dado de anticuerpos (véase la Figura 17-3). La «vianda»

en el emparedado de anticuerpos, es el antígeno. Este formato de ínmunoensayo se

utiliza más comúnmente para la identificación de las proteínas. En el análisis de los

alimentos, esto puede suponer la identificación de un adulterante, tal como la

proteína de cerdo ·en un pro- ducto de carne de vacuno; o un alérgeno. proteico, tal

como la proteína de cacahuete; o la proteína de trigo en un producto que

representarla un problema para las personas que padecen la enfermedad celíaca:

Generalmente, un anticuerpo que se une al antígeno es, en primer lugar,

inmovilizado de alguna manera. La inmovilización más común del anticuerpo

consiste, sencillamente, en unirlo a una superficie hidrófoba, tal como el plástico. El

exceso de anticuerpo se elimina por me- dio del lavado y la prueba está lista para el

análisis de un extracto alimentario. El anticuerpo inmovilizado se de- nomina un

anticuerpo de captura. La disolución de alimento que está siendo ensayada contiene

muchos compuestos que podrían actuar como antígenos. Sin embargo, el anticuerpo

fue preparado mediante la inmunización de un animal con un antígeno proteico

concreto, purificado, y solamente dicho antígeno proteico contenido en la disolución

del alimento se unirá al anticuerpo de captura. Ahora el antígeno y el anticuerpo de

captura se encuentran inmovilizados y la disolución de alimento sobrante puede ser

eliminada por lavado. Observe que las flechas entre las secciones de la Figura 17-3

indican una etapa de lavado seguida por la introducción de una disolución distinta.

Después de la etapa de lavado, se introduce otro anticuerpo unido a un enzima. Este

anti- cuerpo, denominado el anticuerpo de detección, también reconoce al antígeno.

De nuevo, se elimina por lavado el exceso de anticuerpo de detección y, a

continuación, se adiciona el sustrato enzimático incoloro para desarrollar una

coloración si estuviese presente el enzima ligado. El enzima sólo estará presente si

el anticuerpo de detección ha sido inmovilizado por medio de la unión con el

antígeno. Cuanto más intenso sea el color desarrollado, mayor es la cantidad de

antígeno presente. Es decir, hay una proporcionalidad directa entre la intensidad del
color observado en la etapa final y la cantidad de antígeno presente en la muestra

alimentaria extraída. Para aumentar la sensibilidad de un inmunoensayo de

emparedado, se pueden utilizar más anticuerpos para la captura del antígeno. Este

formato de inmunoen- sayo puede hacerse muy sensible y marcadamente especifico,

puesto que dos anticuerpos deben detectar el antígeno.

En la versión más sencilla del inmunoensayo de emparedado, se divide en dos

partes una disolución de un anticuerpo policlonal. Una parte se une al plástico para

convertirla en el anticuerpo de captura. La segunda porción de la disolución del

anticuerpo policlonal se liga a una enzima como la peroxidasa de rábano silvestre y

pasa a ser el anticuerpo de detección. También se pueden utilizar anticuerpos

monoclonales, pero en ese caso hay que extremar las precauciones puesto que no se

puede utilizar un solo tipo de anticuerpo monoclonal, tanto para el anticuerpo de

captura como para el de detección, puesto que sólo un único tipo de epítopo es

reconocido por cualquier anticuerpo monoclonal. Dicho de otra manera, el antígeno

debe ser capaz de unirse a dos anticuerpos al mismo tiempo y, por consiguiente,

debe poseer al menos dos epítopos distintos, reconocidos por anticuerpos diferentes.

Sin embargo, si se utilizan dos anticuerpos monoclonales diferentes que reconozcan

dos epítopos distintos del antígeno, la incubación con el extracto alimentario y el

anticuerpo de detección se pueden llevar acabo, de hecho, en una sola etapa.

 3. LOS INMUNOENSAYOS COMPETITIVOS

Los problemas asociados con el ensayo de las moléculas pequeñas.

A causa de la selectividad, la sensibilidad y la relación directamente proporcional

entre el desarrollo de la coloración y la cantidad de antígeno detectado, el

inmunoensayo de emparedado es el formato a elegir para cualquier molécula grande.

Sin embargo, muchas de las moléculas analizadas en los alimentos no son tan grandes

como las proteínas, sino que son moléculas pequeñas tales como las. toxinas, o los

restos de antibióticos o pesticidas. En estos casos hay varios problemas que describen

ser superados antes de que pueda ser preparado ínmunoensayo.

El primer problema es que cuando los animales son inoculados con moléculas

pequeñas, éstos no desarrollan anticuerpos frente a dichas moléculas. Generalmente,

una molécula debe presentar un peso molecular superior 5.000 para ser percibida

como un antígeno por el sistema inmune de un animal. La solución es enlazar

covalentemente la molécula pequeña, o algún derivado apropiado de la molécula

pequeña, a una molécula portadora grande. La forma enlazada de la molécula

pequeña se conoce como un hapteno. Las moléculas más comunes utilizadas como

portadoras son proteínas que sean bastante solubles, por sencillez en el enlazado

químico, y extrañas al animal, para estimular adecuadamente una respuesta inmune.

Las moléculas portadoras típicas incluyen las proteínas de la albúmina de una especie

diferente, tales como la albúmina de suero bovino, y las hemocianinas, las cuales se

obtienen de los crustáceos. Naturalmente, cuando se utiliza un conjugado hapteno-

proteína para la inmunización de un animal, su sistema inmune es estimulado para

producir anticuerpos que se unen no sólo el hapteno adosado externamente y su

enlace covalente, sino también el exterior expuesto de la proteína extraña.

Un segundo problema en el desarrollo de un inmunoensayo para una molécula

pequeña es que un formato de inmunoensayo de emparedado no funcionará, puesto

que se requieren dos epítopos diferentes para que se unan ambos· anticuerpos. Una

molécula pequeña representa solamente un epítopo, e incluso sólo parte de un epitopo.

La solución a los problemas que se acaban de describir es utilizar un formato de

inmunoensayo competitivo (véase la Figura 17-4). El primer paso requerido en un

inmunoensayo competitivo implica Ja inmovilización de la molécula pequeña, a menudo en

la forma de un hapteno, o bien la inmovilización del anticuerpo. Para unir el hapteno a una

superficie tal como la nitrocelulosa o el plástico, una vez más puede ser enlazado en primer

lugar a una proteína que se una a estas superficies hidrófobas. Sin embargo, la proteína

empleada para ligar el hapteno a la superficie es diferente de la proteína utilizada para

inocular al animal, puesto que el animal también ha desarrollado anticuerpos contra Ja

proteína portadora utilizada para Ja inoculación, y que para el inmunoensayo competitivo

sólo se desean los anticuerpos específicos para el hapteno.

III.3.1. LOS PROBLEMAS ASOCIADOS CON EL ENSAYO DE LAS

MOLÉCULAS PEQUEÑAS

III.3.2. EL FORMATO DEL HAPTENO UNIDO

III.3.3. EL FORMATO DEL ANTICUERPO UNIDO

III.3.4. EL INCREMENTO DE LA SENSIBILIDAD

III.3.5. LA SIMILITUD CON LAS PRUEBAS CHARM

III.3.6. LAS PRECAUCIONES A TOMAR DURANTE EL DESARROLLO

III.3.7. LA CURVA DE CALIBRADO

III.4. LOS INMUNOENSAYOS INDIRECTOS

IV. LA PURIFICACIÓN MEDIANTE LA INMUNOAFINIDAD

V. LAS APLICACIONES

VI. RESUMEN

VII. PREGUNTAS DE REPASO

VIII. REFERENCIAS