PRACTICA DE LABORATORIO

TECNICA DE TINCION GRAM

I ) INTRODUCCIÓN:

La tinción de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología para la visualización

de las bacterias, debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram que desarrolló un
método de tinción en 1884.

Por mas de una centuria las bacterias han sido clasificadas a la reacción de Gram, la
habilidad de retener un complejo de iodo violeta cuando se trata con con un solvente
orgánico tal como el alcohol o la acetona , las bacterias Gram positivas retienen la tintura y
aparecen de color violeta, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener y se tiñen
de color rojo para ser vistas con el microscopio

En esta práctica de microbiología se va a realizar la técnica de Tinción Gram para poder

examinar las células bacterianas que se encuentran en el yogurt determinar al tipo al que
pertenecen.

II) OBJETIVO:

1. Emplear técnicas bacteriológicas simples.

2. Conocer el fundamento estructural de la Tinción de Gram.
3. Utilizar colorantes y comprender su utilización.
4. Utilizar el microscopio con el objetivo de inmersión.
5. Observar células procariotas

Lograr el óptimo procedimiento para poder aprender la técnica de Tinción Gram de todos
los integrantes del grupo y comprender la importancia y la diferencia entra las estructuras
de las diferentes bacterias .

IV) MATERIALES Y METODOS

INSTRUMENTOS
03 Portaobjetos
Goteros,
Pipetas,
Mechero,
Microscopio con lente de inmersión.

REACTIVOS
agua destilada.
Cristal violeta,
Gotas de Yogurt
Solución de Lugol
Alcohol 95º
Solución Fucsina o Safranina para contrateñir

V) DESARROLLO DE LA PRACTICA

PROCEDIMIENTO:

 SIEMBRA: Preparar un porta

bien limpio y Coger una
porción pequeña de yogur
con un palillo o una aguja
enmangada y hacer una
extensión sobre el porta.

o
 FROTIS: Se fijo las células de ida y vuelta – hasta que se desagrego - hasta la
mitad del portaobjetos.
 FIJACIÓN: con esto evitamos que cualquier sustancia infecte nuestra muestra y
luego, que nuestra muestra permanezca en el porta objeto (Se fijo por calor – a
mechero
 TÉCNICA DE TINCIÓN: Sobre el frotis fijado se vertió la solución de violeta y se
deje en reposo 1 minuto siempre que colocamos un colorante o mordiente es
recomendable deshacerse de los excesos de líquido ya que pueden interferir
cuando apliquemos otra sustancia. Cubrir con lugol durante 3´. El Lugol actúa como
"mordiente", vale decir, cristaliza la solucion Violeta de Genciana formando un
complejo insoluble en H2O pero soluble en alcohol-acetona.El Lugol forma un
complejo cristal violeta-iodo). Si hay excedente se lava. En este caso hubo exceso
 DECOLORACIÓN con alcohol al 95 % durante 1 min moviendo el portaobjetos en
ambos lados o a cada extremo, hasta que desaparezcan los chorros gris violáceos
del colorante. Después lave con agua.
. Este paso es fundamental porque en el reside la respuesta diferencial de las
Gram + y las Gram –
. Sabemos que el alcohol deshidrata y contrae las células por contacto.
Sabemos también que los poros de las Gram + son mas pequeños que los de las
Gram -
Entonces, la solución alcohol, contrae los poros de las bacterias cerrando
completamente los de las Gram + y parcialmente los de las Gram -. El resultado es
que dicha solución ingresa en estas últimas decolorándolas. Hasta aquí tenemos las
Gram + violetas y cerradas y las Gram - incoloras y abiertas.
  CONTRATINCIÓN: Sobre el frotis se echo 2 gotas de Safranina básica es
parcialmente soluble en H2O e ingresará sólo en las Gram - ya que las otras
continúan cerradas por efecto del alcohol-acetona. La safranina Básicamente
interactúa con la membrana celular y forma un complejo insoluble en H2O. para
realizar la contra tinción y realizar frotis. Al cabo de 1 ó 2 minutos se vierte el
colorante, el preparado se lava con agua si es que hay exceso, y se deja secar.
 ELIMINAR EL EXCESO y lavar con H2O para eliminar restos de colorante. Si bien
los colorantes ahora son insolubles en agua (recordemos que el Violeta de
Genciana fue “fijado” con lugol), el agua actúa lavando el exceso de arriba del
portaobjetos por arrastre. La explicación más simple de esto es usando la analogía

de la mancha de aceite en la vereda: si quisiéramos limpiarla usando agua vamos a

notar que es imposible disolver el aceite pero si uso una manguera a presión puedo
“empujar” la mancha a otro sector. Esto es lo que hacemos en el porta objeto:
empujamos el exceso de colorante hacia fuera del portaobjetos, para poder ver lo
que hay debajo
 Observar en el microscopio

MARCO TEORICO
TÉCNICA DE TINCION GRAM

Existen variaciones de esta técnica, pero en términos generales, la tinción Gram involucra
estos pasos:

1. Tinción inicial: Las células se tiñen con cristal-violeta. En este paso todas las
células se tiñen de morado.

2. Mordente: Se adiciona yoduro lugol que reacciona con el cristal violeta y forma el
complejo: cristal violeta-yoduro. Las células continúan moradas.
3. Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, que actúa lavando el complejo
cristal violeta-yoduro de las células Gram negativas (estas quedan incoloras). Este
es el paso crítico, pues si se exagera, decolora las Gram positivas o de lo contrario,
no decolora a las Gram negativas.

4. Contratinción: Se vuelve a teñir con Safranina o fucsina, de manera que las

bacterias Gram negativas, que habían quedado incoloras, se tilen de rosado a
fucsia, en tanto que las Gram positivas no se afectan con la contratinción.

Basándonos en la
reacción a esta tinción de las bacterias, éstas se han clasificado,
taxonómicamente hablando, en grampositivas y gramnegativas.
Las gramnegativas son constantes en su reacción, mientras que las
grampositivas pueden presentar respuestas variables frente a determinadas
condiciones, son gramlábiles. Para explicar el mecanismo de tinción se han
propuesto varias hipótesis, fundadas en la naturaleza química de la pared
VI) RESULTADO DEL EXPERIMENTO

OBSERVACIÓN
Realizar una tinción de Gram: mediante esta coloración se pueden diferenciar las bacterias
típicas del yogur (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus), que son Gram (+),
de las bacterias

CONCLUSION

Hemos podido reconocer a través del método de tinción Gram, en este caso se
identifico bacterias y sus formas y los lactobasilos del yogurt, en nuestro caso se
juntaron las bacterias de streptococcus y los lactobasilos estando unidos en el
portaobjetos y diferenciándose por los colores rosa y los lactobasilos eran gran
positivas y de color rosa y los streptococcus eran vien la observación del
microscopio se pudo apreciar su formas bien definidas y diferenciadas. Gram +
violetas y cerradas y las Gram - incoloras y abiertas.

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un

VII) GRAFICOS portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de
separar lo más posible los microorganismos, ya que si
aparecen agrupados en la preparación es muy difícil
obtener una imagen clara y nítida.
 Esta solución es fijado al vidrio del portaobjetos para
poder aplicar los métodos habituales de tinción que
permiten la observación al microscopio de las bacterias
sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos
lavados La fijación de una extensión bacteriana hace
que las bacterias queden inactivadas y adheridas al
vidrio alterando lo menos posible la morfología y
bacteriana y las posibles agrupaciones de células que
pudiera haber.

GRAN POSITIVAS
LACTOBACILOS Y
STREPTOCOCCUS YOGURT
actobasilos

Portaobjetos

MEDIANTE LA
TÉCNICA DEL
FROTIS SE
COMBINARO LAS
DOS BACTERIAS.