Dissertation Annette Walther

Aus der Klinik für Frauenheilkunde mit

Poliklinik und Hebammenschule
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. M. W. Beckmann

Expression von Gonadotropin-Releasing-Hormon und Gonadotropin-

Releasing-Hormon-Rezeptor in Endometriose-Gewebe

Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von
Annette Walther
aus
Fürth
 Dissertation Annette Walther

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. Dr. J. Schüttler

Referent: Prim. PD Dr. P. Oppelt, MBA
Korreferent: Prof. Dr. M. W. Beckmann

Tag der mündlichen Prüfung: 21.01.2011

 Dissertation Annette Walther

Expression von Gonadotropin-Releasing-Hormon und Gonadotropin-

Releasing-Hormon-Rezeptor in Endometriose-Gewebe

1. Zusammenfassung 1
2. Abstract 3
3. Einleitung 5
3.1 Endometriose – Überblick 5
3.1.1 Definition 5
3.1.2 Klassifikation 6
3.1.3 Symptome 10
3.1.4 Diagnostik 10
3.1.5 Therapie 11
3.2 Pathogenese, Pathophysiologie 14
3.3 GnRH: Vorkommen und Regelkreis 17
3.4 Fragestellung 21
4. Material und Methoden 22
4.1 Patienten- und Kontrollgruppe 22
4.2 RNA-Isolierung aus Gewebe 26
4.3 RT-PCR 27
4.4 Realtime-PCR 29
4.5 Statistische Auswertung 30
5. Ergebnisse 31
5.1 RT-PCR 31
5.2. Realtime-PCR 35
6. Diskussion 36
7. Literaturverzeichnis 43
8. Abkürzungsverzeichnis 51
9. Anhang 53
10. Danksagung 56
 1 Dissertation Annette Walther

1. Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele

Endometriose, d.h. das Vorkommen von Endometrium-ähnlichem Gewebe
außerhalb der Gebärmutter, ist eine chronische entzündliche Erkrankung,
von der wohl 5 – 15% aller Frauen im reproduktionsfähigen Alter betroffen
sind. Bei Frauen mit unerfülltem Kinderwunsch und chronischen
Unterbauchschmerzen liegt die Inzidenz deutlich höher. Das Wachstum
des Endometriosegewebes gilt als steroidhormonabhängig. Gonadotropin
Releasing Hormon stimuliert die Freisetzung der Gonadotropine in der
Hypophyse und führt so über einen erhöhten Östrogenspiegel zur
Proliferation von Vaginalepithel und Endometrium. Außerdem besteht
möglicherweise ein direkter, proliferationshemmender Effekt auf die
Endometriumzelle, vermittelt über den Gonadotropin Releasing Hormon
Rezeptor.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von Gonadotropin
Releasing Hormon 1 (GnRH1) und Gonadotropin Releasing Hormon
Rezeptor 1 (GRHR1) in Endometriosegewebe und in normalem
Endometrium untersucht.

Methoden
Aus intraoperativ entnommenem Endometriosegewebe (22 Proben) und
Endometrium (15 Proben) wurde RNA extrahiert und die Genexpression
von GnRH1 und GnRHR1 mittels reverse-transcribed(RT) - PCR geprüft.
Anschließend wurde die RNA in cDNA umgewandelt und mittels Realtime-
PCR erneut auf die Expression von GnRH1 und GnRHR1 untersucht. Die
statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe von Microsoft Excel und eines
SPSS-Datenbanksystems, die Auswertung der klinischen Daten mittels
Fragebogen und Krankenakte.

Ergebnisse
Im von uns untersuchten Kollektiv konnte gezeigt werden, dass in
Endometriosegewebe im Gegensatz zu Endometriumgewebe kein
 2 Dissertation Annette Walther

GnRHR1 exprimiert wird. Außerdem waren durchschnittlich in

Endometriosegewebe höhere Konzentrationen an GnRH1 vorhanden als
in Endometriumgewebe.

Schlussfolgerungen
In den Untersuchungen konnte das Fehlen des GnRHR1 in
Endometriosegewebe nachgewiesen werden, bei gleichzeitig höheren
GnRH1-Konzentrationen als in normalem Endometrium. Das Fehlen des
GnRHR1 scheint zu einem Verlust der Wachstumskontrolle zu führen.
 3 Dissertation Annette Walther

2. Abstract

Background and Research Focus

Endometriosis represents growth and establishement of endometrium-like
tissue outside the uterine cavity. Endometriosis is a chronic inflammatory
disease, which occurs in approximately 5 – 15% of women in the
reproductive age, but in women with infertility problems and chronic pelvic
pain, the incidence is much higher at about 50%. Evidence supports that
the growth of the endometriosis tissue is steroid hormone-dependent.
This present investigation explored the expression of gonadotropin
releasing hormone 1 (GnRH1) und gonadotropin releasing hormone
receptor 1 (GRHR1) in endometriosis tissue in contrast to normal
endometrium.

Materials and Methods

Directly from the operation room, endometriosis tissue (22 samples) and
endometrium (15 samples) was biopsied, RNA was extracted and the
gene expression of GnRH1 and GnRHR1 was examined by RT-PCR.
Subsequently RNA was made into cDNA and GnRH1 and GnRHR1 was
quantitated using Realtime-PCR. Statistical evaluation was conducted
using Microsoft Excel and a SPSS data bank system. Analysis of the
clinical data was conducted using a questionnaire and patient medical
records.

Observations and Results

Within the examined collective we could show that there was no
expression of GnRHR1 in the endometriosis tissue in contrast to normal
endometrium. Furthermore, the concentrations of GnRH1 mRNA in
average were higher in endometriosis tissue than in normal endometrium
tissue.
 4 Dissertation Annette Walther

Implications
Expression of GnRHR1 was lost in endometriosis tissue, however higher
GnRH1 concentrations were found compared to normal Endometrium,
where both GnRH1 and GnRHR1 expression was found. We propose that
the lack of GnRHR1 could lead to a loss of growth control.
 5 Dissertation Annette Walther

3. Einleitung
3.1 Endometriose – Überblick

3.1.1 Definition
Endometriose ist definiert als das Vorkommen von Endometrium-
ähnlichem Gewebe außerhalb der physiologischen
Schleimhautauskleidung der Uterushöhle, das ähnlichen zyklischen
Veränderungen unterworfen ist wie das Endometrium.
Endometriose ist eine chronische entzündliche Erkrankung und stellt eines
der häufigsten gutartigen gynäkologischen Krankheitsbilder dar. Die
genaue Prävalenz der Endometriose ist unbekannt, da eine sichere
Diagnose nur durch Laparoskopie oder Laparotomie erfolgen kann.
Vermutlich sind 5 – 15% aller Frauen im reproduktionsfähigen Alter
betroffen (Vinatier et al. 2000, Bulun et al. 2000, Kitawaki et al. 2003). Bei
Frauen mit Fertilitätsstörungen und chronischen Unterbauchschmerzen
steigt die Inzidenz auf bis zu 60%.
Endometrioseläsionen bestehen aus Endometrium-ähnlichem Gewebe mit
drüsigen und mesenchymalen Anteilen. Je nach Lokalisation der Läsionen
unterscheidet man die Endometriosis genitalis externa in den Organen
des kleinen Beckens wie Ligg. sacrouterina und Ovarien von der
Endometriosis genitalis interna, auch Adenomyosis uteri genannt, mit
Auftreten von Herden innerhalb des Myometriums. Als Endometriosis
extragenitalis wird das Auftreten von Endometrioseherden im Bereich von
Darm, Blase und Peritoneum bezeichnet. Sehr selten ist
extraabdominelles Vorkommen z. B. in der Lunge. Tabelle 1 zeigt die
Häufigkeit des Auftretens von Endometrioseherden an unterschiedlichen
Lokalisationen (nach Tinkanen 2000).
 6 Dissertation Annette Walther

Ort der Endometriose Häufigkeit

Ligamentum sacrouterinum 60%

Ovarien 52%
Douglasraum 28%
Blasendach 15%
Ligamentum latum 16%
Mesosalpinx 10%
Rectum 12%
Tube 2-8%
Dünn- und Dickdarm 7%
Appendix 2%

Tabelle 1: Prozentuale Verteilung der Lokalisation der Endometriose

Es wird angenommen, dass das Wachstum des Endometriosegewebes

steroidhormonabhängig ist. Ein Großteil der Herde reagiert auf den
zyklischen Einfluss der Sexualhormone entsprechend dem normalen
Endometrium mit Proliferation und Umwandlung in sekretorisches
Drüsengewebe. Während der Menstruation kommt es auch zu einer
Blutung aus den Herden.

3.1.2 Klassifikation
Neben der Unterteilung in Endometriosis genitalis externa, interna und
extragenitalis erfolgt häufig eine Klassifikation in Anlehnung an die
American Society for Reproductive Medicine (1997). Nach Durchführung
einer Laparoskopie oder Laparotomie werden der Ort, Durchmesser und
die Infiltrationstiefe der intraperitoneal sichtbaren Endometriose-Läsionen
sowie das Ausmaß der Adhäsionen im Bereich von Ovar, Tuben und
Douglasraum beurteilt. Je nach Schweregrad wird von rAFS (American
Fertility Society Revised Classification of Endometriosis) I bis IV (I =
minimal, IV = schwer) unterschieden. Abbildung 1 zeigt den
Dokumentationsbogen in Anlehnung an den rAFS-Score, der in der
Universitäts-Frauenklinik Erlangen zur Endometriose-Klassifikation
verwendet wird.
 7 Dissertation Annette Walther

Klassifikation Endometriose (gemäß rAFS)

_________________ OP-Datum: _________________

______________

Operateur: _________________

Diagnostik OP
Endometriose-Läsionen

<1 1–3 >3 Punkt-

Peri- cm cm cm zahl
toneum oberflächlich
1 2 4
Stadium I (minimal) = 1 – 5 Pkt.
tief
2 4 6 Stadium II (gering) = 6 – 15 Pkt.
Stadium III (mäßig) = 16 – 40 Pkt.
re
Ovar oberflächlich 1 2 4 Stadium IV (schwer) über 40 Pkt.
re tief
-------------------------------------------------------
4 16 20

li
ges. Pkt. Endometriose: _____________
oberflächlich 1 2 4

li tief ges. Pkt: Verwachsungen: ___________

4 16 20
ges. Pkt. AFS-Score: _______________
Gesamt-Endometriose-Implantat-Punkte

Adhäsionen

Adhäsionen 1/3 2/3 > 2/3 Punktzahl

Ovar Einschl. Einschl. Einschl. zusätzliche
re zart 1 2 4 Endometriose:
___________________
re dicht 4 8 16
___________________
li zart 1 2 4 ___________________

li dicht 4 8 16

Tube re zart 1 2 4

re dicht 4* 8* 16
assoziierte Pathologie:
li zart 1 2 4 ___________________
___________________
li dicht 4* 8* 16
___________________
Douglas-
Obliteration teilweise = 4 komplett = 40 ___________________

Gesamt-Adhäsions-Punkte (einschl. Douglas)

* bei komplettem Tubenverschluss auf 16 Punkte

Abbildung 1: Dokumentationsbogen der Universitätsfrauenklinik Erlangen zur

Klassifikation der Endometriose
 8 Dissertation Annette Walther

Nicht berücksichtigt werden hierbei jedoch tiefer liegende extraperitoneale

Manifestationen, die sich zum Teil in gravierenden klinischen Symptomen
äußern. Daher gibt es häufig keine gute Korrelation zwischen dem rAFS-
Score und der Ausprägung der klinischen Symptomatik, da das Ausmaß
einer tief infiltrierenden Endometrioseerkrankung mit dem rAFS-Score
nicht ausreichend beschrieben werden kann. Um diese differenzierter
erfassen zu können, wurde von einer Arbeitsgruppe der Stiftung
Endometrioseforschung der ENZIAN-Score als Ergänzung zum rAFS-
Score entwickelt (Abbildung 2) (Tuttlies et al. 2005).
 9 Dissertation Annette Walther

Abbildung 2: ENZIAN-Score nach Tuttlies et al. 2005

 10 Dissertation Annette Walther

3.1.3 Symptome
Obwohl die Endometriose eine der häufigsten gynäkologischen
Erkrankungen ist, gestaltet sich die Differentialdiagnose aufgrund der eher
unspezifischen Symptome häufig schwierig.
Im Bereich der Endometrioseläsionen kommt es durch die zyklischen
Blutungen und durch zelluläre Entzündungsreaktionen wie die vermehrte
Ausschüttung von Prostaglandinen zur Ansammlung von Blut
(Schokoladenzysten) sowie zu Verwachsungen und Narbenbildungen, die
sich in zyklischen oder dauerhaften Unterbauchschmerzen äußern.
Adhäsionen können durch Tubenmotilitätsstörungen oder Tubenverschluß
zu Fertilitätsproblemen führen. Durch Befall des Septum rektovaginale
kommt es zur Dyspareunie. Außerdem treten Miktions- und
Defäkationsschmerzen auf, teilweise auch Hämaturie und blutige
Defäkation bei Einbruch der Endometrioseherde in Blase oder Darm.
Das sehr häufige Symptom der ausgeprägten Dysmenorrhoe beruht
möglicherweise auf der nachgewiesenen uterinen Dys- und
Hyperkontraktilität (Leyendecker et al. 1996). Diese scheint des weiteren
durch den schlechteren Spermientransport ebenfalls zur verminderten
Fertilität von Endometriose-Patientinnen beizutragen.
Der Schweregrad der Erkrankung (z.B. nach rAFS) und das Ausmaß der
Schmerzsymptomatik zeigen keine Korrelation.

3.1.4 Diagnostik
Obligate Schritte in der Diagnostik der Endometriose sind die klinische
Untersuchung mit vaginaler Inspektion sowie vaginaler und rektaler
Palpation und die vaginale Sonografie zur Erkennung von Endometriomen
der Ovarien oder einer Adenomyose. Ergänzend können die rektale
Endosonografie zur Erkennung einer Darmwandinfiltration, die Zysto- oder
Rektoskopie bei Verdacht auf Befall von Blase oder Darm sowie eine
Nierensonografie und intravenöses Pyelogramm zum Ausschluß einer
Hydronephrose bei Ureterkompression oder Ureterendometriose sinnvoll
sein. Eine Magnetresonanztomografie liefert ebenfalls gute Befunde bei
 11 Dissertation Annette Walther

Vorliegen einer Adenomyose oder tief infiltrierenden Endometriose. In der

klinischen Praxis kann jedoch meist darauf verzichtet werden. Der
Serumspiegel des Tumormarkers des Endometriumkarzinoms, CA-125, ist
bei Frauen mit Endometriose häufig erhöht (Neis 2004), aufgrund seiner
unzureichenden Spezifität spielt er in der Differenzialdiagnostik außerhalb
klinischer Studien jedoch keine Rolle. Am Ende des Algorithmus zur
Diagnostik der Endometriose steht die Laparoskopie mit histologischer
Befundsicherung. Dies ist die einzige Methode, um eine Endometriose
eindeutig nachzuweisen. Alle erkennbaren Herde sollten hierbei exzidiert
werden (therapeutischer Eingriff).

3.1.5 Therapie
Das Ausmaß der Endometriose-Erkrankung korreliert nicht mit dem Grad
der Beschwerden der Patientin. Eine kausale Therapie der Endometriose
existiert bisher nicht. Der primäre Therapieansatz muss immer durch die
Lebenssituation der Patientin bestimmt werden. Gemäß den Leitlinien der
Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe gilt die operative
Entfernung der Herde als „Goldstandard“ zur Symptomkontrolle. Eine
präoperative medikamentöse Therapie wird derzeit nicht empfohlen. Es
existieren verschiedene medikamentöse Optionen zur postoperativen
Rezidivprophylaxe sowie zur Behandlung der Schmerzsymptomatik. Alle
beruhen auf dem Konzept der Induktion eines Östrogenmangels im
Gewebe. Dies führt zur Regression der Endometrioseherde durch
Suppression der ovariellen Funktion. In über 50% der Fälle kommt es
jedoch nach Therapie innerhalb von 5 Jahren zu einem Rezidiv der
Endometriose (Waller & Shaw 1993). Folgende Pharmaka werden
eingesetzt:
Östrogen-Gestagen-Kombinationen in Form oraler Kontrazeptiva führen
zur Suppression der Östrogen-Synthese in den Ovarien. Längerfristig soll
es zur Regression der Endometrioseherde kommen. Nach Vercellini et al.
soll die kontinuierliche Gabe effektiver sein als die zyklische Applikation.
Eine Dauertherapie mit Gestagenen hemmt die hypothalamische GnRH-
Freisetzung durch negative Rückkopplung und wirkt damit ähnlich den
 12 Dissertation Annette Walther

oralen Kontrazeptiva. Außerdem scheinen Gestagene die Apoptoserate im

Endometrium zu erhöhen (Bruner et al. 1999). Es ist auch eine lokale
intrauterine Gestagentherapie mit einem Levonorgestrel beschichteten
Intrauterinpessar möglich.
GnRH-Agonisten führen nach einem kurzzeitigen Gonadotropin-Flush zur
Down-Regulierung der GnRH-Rezeptoren der Hypophyse und damit über
die verminderte Sekretion von LH und FSH zu Hypoöstrogenämie. Die
damit verbundenen Nebenwirkungen (u.a. Demineralisation des
Knochens, Hitzewallungen) können durch die niedrig dosierte Gabe von
natürlichen Östrogenen und Gestagenen gemindert werden (add-back-
Therapie). GnRH-Agonisten werden meist monatlich als subkutane Depot-
Injektionen verabreicht.
GnRH-Antagonisten blockieren direkt die GnRH-Rezeptoren der
Hypophyse ohne initialen Gonadotropin-Flush, sind jedoch wesentlich
teurer als die GnRH-Agonisten und klinisch bei der Endometriose wenig
erprobt.
GnRH-Analoga scheinen zur stärksten Regression der Endometriose-
Läsionen zu führen. Bezüglich der Verbesserung der
Schmerzsymptomatik sind die angeführten Medikamente jedoch
gleichwertig (nach den Leitlinien zur Diagnostik und Therapie der
Endometriose der DGGG 2006). Die Gabe von GnRH-Agonisten über
sechs statt über drei Monate kann das rezidivfreie Intervall verlängern.
Keine der medikamentösen Therapien kann die Fertilität verbessern (C.
Wellberry 1999), jedoch kann die Gabe von GnRH vor der
Stimulationsbehandlung zur in-vitro-Fertilisation die Schwangerschafts-
raten erhöhen.

Zur Schmerzbekämpfung werden zusätzlich nichtsteroidale Antiphlogistika

eingesetzt, die analgetisch und antiphlogistisch wirken, aber die
Ausprägung der Läsionen nicht beeinflussen.
 13 Dissertation Annette Walther

Abbildung 3: Möglicher Therapiealgorithmus bei klinischem V.a. Endometriose aus

dem Deutschen Ärzteblatt 2006
 14 Dissertation Annette Walther

3.2 Pathogenese, Pathophysiologie

Die Pathogenese der Endometriose ist bis zum heutigen Tag nicht genau
geklärt. Es gibt verschiedene, sich zum Teil überschneidende
pathogenetische Modelle, die sich letztlich auf zwei Grundkonzepte
zurückführen lassen. Zum einen die Theorie der Verschleppung von
Endometrium-Zellen (Transplantationstheorie), die an anderer Stelle im
Bauchraum wieder anwachsen und dort einen Endometrioseherd bilden.
Diese Theorie wurde von Sampson bereits 1927 vertreten. Er geht davon
aus, daß während der Menstruation Endometriumzellen retrograd ins
kleine Becken gelangen und dort einen Endometrioseherd bilden. Die
Induktion von Endometriose im Tierversuch durch intraperitoneale
Injektion von Menstrualblut (D’Hooge et al. 1995) oder Transplantation von
Endometrium (Schweppe 2003) unterstützen diese Theorie. Retrograde
Menstruation tritt bei fast allen menstruierenden Frauen auf (Halme 1984).
Es bleibt unklar, warum nur ein Teil dieser Frauen eine manifeste
Endometriose entwickelt.
Die Metaplasietheorie (Meyer 1919) geht davon aus, dass Endometriose-
Zellen durch Umwandlung aus pluripotenten Zölomzellen im Peritoneum
entstehen. Als Auslöser hierfür gilt die Stimulation des Zölomepithels
durch z.B. Steroidhormone (v.a. Östrogene). Diese Annahme wird
unterstützt durch die Tatsache, dass bei Männern, die lange hoch dosiert
mit Östrogenen behandelt wurden, Endometrioseherde beobachtet
wurden (C. Wellberry 1999). Gavzani und Templeton postulierten 2002
auch die wiederholte Irritation der peritonealen Serosa durch z. B.
Infektionen als Auslöser der Metaplasie.
Faktoren, die zu einer Umwandlung führen bzw. die Adhärenz, Invasion,
Wachstum und Persistenz der Läsionen ermöglichen bzw. fördern,
könnten z. B. eine abnorme Immunreaktion (Dmowski & Braun 2004),
genetische Prädisposition (Lamb & Nichols 1986, Stefansson et al. 2002,
Kashima et al. 2004), Veränderungen in der Zusammensetzung der
Peritonealflüssigkeit oder eine Alteration von Endometriumzellen (Sharpe-
Timms et al. 2000, Mahutte et al. 2004) sein.
 15 Dissertation Annette Walther

Transplantations- und Metaplasietheorie stehen sich nicht kontrovers

gegenüber, sondern ergänzen sich zum Teil. Dennoch können beide
Theorien nicht alle Aspekte des Krankheitsbildes Endometriose vollständig
erklären.
Leyendecker versuchte seit 1998 durch die Entwicklung des Archimetra-
Konzepts die Entstehung der Endometriose genauer zu erklären. Es geht
davon aus, dass Endometriose-Läsionen aus dem basalen Endometrium
entstehen. Der Uterus besteht aus zwei entwicklungsgeschichtlich sehr
unterschiedlichen Teilen. Zum einen der Archimetra, sie umfasst das
Endometrium und das darunter liegende Stratum subvasculare des
Myometriums. Die äußeren Muskelschichten, Stratum vasculare und
supravasculare des Myometriums stellen den in der
Embryonalentwicklung des Menschen später gebildeten Teil des Uterus,
die Neometra, dar. Die Funktion der Neometra ist die Entwicklung der
Gebärkräfte zur Ausstoßung des Feten. Die Funktion der Archimetra wird
von den Ovarien gesteuert und besteht in der Infektionsabwehr, dem
Spermientransport durch retrograde uterine Peristaltik sowie der
Proliferation und Differenzierung des Endometriums für die Implantation
des Embryos.
Als Ursache von Endometriose und Adenomyose fand Leyendecker eine
Hyperperistaltik der Archimetra. Diese führe zu einer Desquamation von
Fragmenten des basalen Endometriums sowie zu einer Verstärkung der
(physiologischen) retrograden Menstruation. Am Ende des Zyklus besitzen
nur die Zellen des basalen Endometriums proliferatives Potential, die
Zellen der übrigen Schichten, die bei der Menstruation
physiologischerweise abgestoßen werden, weisen keine Teilungsaktivität
auf. Die so in den Peritonealraum geschwemmten Basalisfragmente
implantieren sich dort und proliferieren zu Endometrioseherden.
Außerdem komme es durch die Hyperperistaltik zur Bildung von
myometrialen Dehiszenzen, in die basales Endometrium infiltriert und eine
Adenomyose bildet. Die Ursache der Hyperperistaltik liegt wohl in einem
Hyperöstrogenismus der Archimetra, induziert durch die Expression
östrogenabhängiger Gene.
 16 Dissertation Annette Walther

Bei der Analyse des Hormonstatus der Endometriose-Läsionen wurde

gezeigt, dass im Gegensatz zu normalem Endometrium in Endometriose-
Gewebe P450 Aromatase exprimiert wird und die 17-beta-Hydroxysteroid-
Dehydrogenase Typ 2 (17β-HSD II) fehlerhaft ist. Aromatase führt zur
Umwandlung von Androstendion in Östron, dieses wird durch 17β-HSD I
in Östradiol umgewandelt. 17β-HSD II inaktiviert Östradiol durch
Umwandlung in Östron. Beides führt zu einer lokalen Akkumulation von
17-beta Östradiol (Bulun et al. 2000, Heinig J et al. 2002). Diese lokal
erhöhten Östradiol-Level scheinen die Proliferation der
Endometrioseherde zu stimulieren. Die Östradiolkonzentration im
Menstrualblut von Endometriose-Patientinnen ist im Vergleich zu nicht an
Endometriose erkrankten Frauen erhöht, während sich die
Serumkonzentrationen nicht unterscheiden. (Takahashi et al. 1989)
Endometriose kommt, wenn auch sehr selten, auch bei Männern vor, die
mit hohen Dosen Östrogen behandelt wurden (C. Wellberry 1999).
Außerdem wird in Endometriose-Läsionen die Überexpression der
Cyclooxygenase 2 beschrieben, welche das (vermehrt vorhandene)
Östradiol in Prostaglandin E2 umwandelt und damit die lokale
Entzündungsreaktion fördert (Chshima et al. 2002).
 17 Dissertation Annette Walther

3.3 GnRH: Vorkommen und Regelkreis

Im zentralen Nervensystem von Säugetieren wurde zwei Formen von
Gonadotropin-Releasing Hormon gefunden. Das Gonadotropin-Releasing
Hormon 1 ist ein Dekapeptid, das aus den neurosekretorischen Zellen des
Hypothalamus pulsatil in das Pfortadersystem der Hypophyse abgegeben
wird und eine zentrale Rolle in der Steuerung des weiblichen Zyklus spielt.
Die Aminosäuresequenz des GnRH1 wurde von Shally et al. erstmals
1971 charakterisiert (Abbildung 4). Das kodierende Gen ist auf
Chromosom 8 lokalisiert und besteht aus 4 Exons.

pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

Abbildung 4: Aminosäuresequenz des GnRH1

Nach Bindung an den GnRHR1 im Hypophysenvorderlappen stimuliert

GnRH1 die Synthese und Freisetzung der Gonadotropine, LH
(luteinisierendes Hormon) und FSH (follikelstimulierendes Hormon). LH
fördert die Androgensynthese, FSH führt durch eine Steigerung der
Aromataseaktivität zu einer vermehrten Umsetzung von Androgenen in
Östrogene. Die Östrogene selbst wirken proliferativ auf Vaginalepithel und
Endometrium. Über einen Rückkopplungsmechanismus wird die Sekretion
des GnRH1 reguliert (Abbildung 5).
 18 Dissertation Annette Walther

Hypothalamus

GnRH

+ Legende:

Hypophyse Organe

Hormone/
FSH LH
Wirkstoffe

+ + Hormonausschüttung

Ovar Rückkopplung

Östrogene & + stimulierende Wirkung

Gestagene

+ +
Vaginalepithel Endometrium

Abbildung 5: Hypothalamisch-hypophysärer Regelkreis

In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl von GnRH-Analoga

entwickelt und umfassend erforscht (Conn und Crowley, 1994). Sie
spielen eine entscheidende Rolle in der Therapie der Endometriose (siehe
oben), werden aber auch zur Therapie des Prostata-Karzinoms und zur
Ovulationsinduktion im Rahmen der in-vitro-Fertilisation eingesetzt. Sie
unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz vom GnRH1 nur durch den
Austausch bzw. die Deletion von ein bis zwei Aminosäuren. Beispiele sind
in Abbildung 6 dargestellt.
 19 Dissertation Annette Walther

pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

GnRH1

pGlu His Trp Ser Tyr D-Leu Leu Arg Pro

Leuprolid

pGlu His Trp Ser Tyr D-Ser Leu Arg Pro Gly

Goserelin

Abbildung 6: Aminosäuresequenz häufig verwendeter GnRH-Agonisten im Vergleich

zu GnRH1

Nach dauerhafter Bindung von z.B. Leuprolid an die natürliche

Bindungsstelle des GnRH1 am GnRHR1 kommt es, nach primärer
Stimulation der LH- und FSH-Produktion, zu einer Desensibilisierung bzw.
Erschöpfung des Rezeptors mit konsekutivem Abfall der Sekretion von LH
und FSH und damit zu einer verminderten Östrogenproduktion. Dies hat
einen antiproliferativen Effekt auf die Zellen.
GnRHR1 kann, ebenso wie GnRH1, im Gehirn, in der Hypophyse, in den
Gonaden, im Endometrium und in der Plazenta nachgewiesen werden.
Es wird angenommen, dass GnRH-Agonisten nicht nur über die
Beeinflussung der hypothalamisch-hypophysären Achse ihre Wirkung
entfalten, sondern auch direkt auf das Endometrium und andere periphere
Gewebe, in denen der GnRHR1 exprimiert wird, wirken (Cheng et al.
2000, Emons et al. 2003, Klausen et al. 2002).
 20 Dissertation Annette Walther

Das GnRH2 oder chicken-GnRH besteht seit ca. 500 Millionen Jahren, ist
dem GnRH1 zu 70% homolog (siehe Abbildung 7), jedoch deutlich
stabiler. Es kann in verschiedenen peripheren Geweben nachgewiesen
werden, die physiologische Funktion ist noch nicht genau erklärt. Die
mRNA des zugehörigen GnRHR2 ist beim Menschen ubiquitär vorhanden,
das Protein konnte jedoch bisher nicht nachgewiesen werden. Man geht
daher davon aus, dass Menschen einen stillen oder zerstörten GnRHR2
besitzen. Zeitweise wurde vermutet, dass GnRH2 Komponenten des
Verhaltens, die bei der Vermehrung eine Rolle spielen, beeinflusst
(Pawson et al. 2003).

pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

GnRH1

pGlu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly

GnRH2

Abbildung 7: Aminosäuresequenzen von GnRH1 und GnRH2 im Vergleich

 21 Dissertation Annette Walther

3.4 Fragestellung
Sowohl Sampson als auch Leyendecker gehen in ihren Theorien davon
aus, dass eine Verschleppung von Endometriumzellen der zugrunde
liegende Pathomechanismus der Endometriose-Entstehung ist. Primär
wäre dann davon auszugehen, dass die Zellen in Endometriose-Läsionen
die gleichen molekulargenetischen Charakteristika aufweisen wie die
Zellen des eutopen Endometriums. Wahrscheinlicher scheint jedoch, dass
die Implantation und Proliferation von Zellen als Endometrioseherde erst
durch genetische Alterationen möglich wird.
Es wurde bereits gezeigt, dass im Endometrium von Frauen, die nicht an
Endometriose leiden, GnRH1 und GnRHR1 exprimiert werden (Ikeda et al.
1997; Raga et al. 1998; Shemesh 2001). Meresman et al. (2003) konnten
zeigen, dass GnRH-Analoga die Apoptoserate in Zellkulturen aus eutopen
Endometriumzellen von Frauen mit und ohne Endometriose erhöhten
sowie die Zellproliferation verringerten. Auch Kraus et al. (2001) zeigten,
das GnRH1 durch Bindung an den GnRHR1 das endometriale Wachstum
unterdrückt. Das in den Endometriumzellen vorhandene GnRH1 scheint
also, vermittelt über den GnRHR1, die Proliferation des Endometriums zu
kontrollieren. Möglicherweise führen Veränderungen in diesem System
zum unkontrollierten Wachstum der Zellen in Endometriose-Läsionen.
Im Rahmen dieser Arbeit soll mittels RT-PCR untersucht werden, ob in
Endometrioseherden GnRH1 und GnRHR1 exprimiert werden. Außerdem
werden quantitative Realtime-PCRs zur Analyse der Genexpression von
GnRH1 sowie GnRHR1 durchgeführt.
Es sollen folgende Fragen beantwortet werden:
- Weisen Endometriose-Läsionen bezüglich der Expression von GnRH1
und GnRHR1 die gleichen molekulargenetischen Charakteristika auf
wie eutopes Endometrium?
- Wie ist die quantitative Expression von GnRH1 und GnRHR1 im
Vergleich?
- Was könnte dies für die Wachstumskontrolle in Endometrioseherden
bedeuten?
 22 Dissertation Annette Walther

4. Material und Methoden

4.1 Patienten- und Kontrollgruppe
Für diese Studie wurden von 22 an Endometriose erkrankten Frauen, die
an der Frauenklinik des Universitätsklinikums Erlangen im Rahmen
medizinisch indizierter chirurgischer Eingriffe operiert wurden,
Gewebestücke aus Endometrioseherden entnommen, sofort in flüssigem
Stickstoff eingefroren und bei -80°C aufbewahrt. Ebenso wurden
Gewebeproben aus dem gesunden Endometrium von 15 Frauen mit und
ohne Endometriose entnommen und eingefroren. Alle Patientinnen
erklärten sich mit der intraoperativen Gewebeentnahme zu
Forschungszwecken schriftlich nach Aufklärung durch Ärzte
einverstanden. Diese Forschungszwecke wurden von der
Ethikkommission der Universität Erlangen bewilligt. Aus den
Gewebestücken wurde mRNA gewonnen und diese mittels RT-PCR und
Realtime-PCR auf die Expression von GnRH1 und GnRHR1 untersucht.
Für jede Patientin wurde ein eigens für diese Fragestellung erstellter
Fragebogen (siehe Anhang) ausgefüllt, der Angaben zu Vorerkrankungen,
Operationen, Beschwerden und Lebensweise enthält (Tab. 2 und 3). Die
Patientinnen mit Endometriose waren zu diesem Zeitpunkt zwischen 17
und 43 Jahren alt (Durchschnitt 31,5), das Alter der Frauen in der
Kontrollgruppe betrug zwischen 27 und 55 Jahren (Durchschnitt 42,1).
 23 Dissertation Annette Walther

Gewebe- GnRH-
Nr. Alter bei OP Ort Endometriose AFS Therapie OCP

219 32 Vagina 4 ja nein

220 35 Harnleiter 4 ja nein
323 26 Ovar 4 nein nein
359 30 Vagina 4 ja nein
442 29 Vagina 3 ja nein
479 27 Peritoneum 4 nein unbekannt
523 30 Rektum 4 nein ja
581 40 Peritoneum 4 nein nein
602 43 Lig. Sacrout. 2 nein nein
605 40 Vagina 4 ja unbekannt
706 34 Lig. Sacrout. 2 nein nein
868 26 Sigma 4 ja nein
1043 32 Lig. Sacrout. 3 nein nein
1315 37 Blasenperitoneum 4 nein nein
1413 36 Lig. Sacrout. 2 nein nein
1442 17 Lig. Sacrout. 1 nein nein
1457 34 Lig. Sacrout./Blase 3 nein nein
1465 27 Vagina 4 ja unbekannt
1518 34 Lig. Sacrout. 3 ja nein
1528 22 Lig. Sacrout. 4 nein nein
1612 30 Lig. Sacrout. 4 nein nein
1648 33 Ovar 4 nein nein
Lig. Sacrout.; LIgamentum Sacrouterinum; AFS: Schweregrad der Endometriose nach AFS-Klassifikation; OCP:
orale Kontrazeptiva zum Zeitpunkt der OP; GnRH-Th.: monatliche Depot-Gabe von GnRH-Analoga zur OP-
Vorbereitung
Tabelle 2: Patientinnengut Endometriose erfasst aus Fragebogen und Krankenakte

Gewebe- GnRH- OCP

Nr. Alter bei OP Grunderkrankung Zyklus Therapie

48 35 Endometriose kein ja nein

315 45 Hypermenorrhoe proliferativ nein nein
613 51 SIK, Zystozele proliferativ nein nein
702 46 Hypermenorrhoe proliferativ nein nein
789 30 Ovarialzysten proliferativ nein nein
883 27 PCO, Sterilität sekretorisch nein nein
1076 49 Zystadenom proliferativ nein nein
1189 36 EUG sekretorisch nein nein
1194 43 Uterus myomatosus proliferativ nein nein
1219 44 Myom proliferativ nein nein
1226 55 Uterus myomatosus Menopause nein nein
1387 33 Endometriose proliferativ nein nein
1423 52 Hyperplasie Menopause nein nein
1929 49 Hypermenorrhoe sekretorisch nein nein
1957 37 Endometriose proliferativ nein nein
SIK: Streßinkontinenz, PCO: polycystische Ovarien, EUG: Extrauteringravidität
Tabelle 3: Patientinnengut gesundes Endometrium erfasst aus Fragebogen und
Krankenakte
 24 Dissertation Annette Walther

Die untersuchten Patientinnen wiesen zum Großteil die für Endometriose

typischen Symptome auf, zum Teil wurden diese aber auch von den
gesunden Kontrollpatientinnen angegeben (Abbildung 8). Dies bestätigt
nochmals, dass die Symptome der Endometriose sehr unspezifisch sind,
was die Diagnosestellung häufig erschwert.

Menstruationsdauer > 64%

4d 54%

50%
Hypermenorrhoe
13%

unerfüllter Kinderwunsch 29%

(>1J.) 25%

0% Kontroll-Pat.
Defäkationsschmerz Endometriose-Pat.
13%

7%
Dyspareunie
21%

14%
Unterbauchschmerzen
50%

21%
Dysmenorrhoe
50%

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70%

Abbildung 8: Diagramm zur: Gegenüberstellung der Symptome von Endometriose-

Patientinnen und Kontroll-Patientinnen
 25 Dissertation Annette Walther

Von den 22 operierten/untersuchten Patientinnen wurden gemäß der

Klassifikation der American Fertility Society 14 Frauen (entspricht ca. 64 %
des Patientenkollektivs) in AFS IV eingestuft (Abbildung 9).

70% 64%
60%

50%

40%

30%
18%
20% 14%

10% 4%

0%
I (= minimal) II (= gering) III (= mäßig) IV (= schwer)
n=1 n=3 n=4 n = 14

Abbildung 9: Diagramm zur AFS-Klassifikation der Endometriose-Patientinnen

 26 Dissertation Annette Walther

4.2 RNA-Isolierung aus Gewebe

Um RNA aus den bei -80°C gelagerten Gewebestücken zu isolieren,

wurden diese zunächst in gefrorenem Zustand in einem mit Stickstoff
gekühlten Teflonbehälter im Mikro-Dismembranator II der Firma Braun
zerkleinert. Anschließend wurde mit 1 ml Trizol Reagens® (Invitrogen,
Darmstadt, Deutschland) eine Isolation der RNA durchgeführt. Nach der
Zugabe von 200 µl 100% Chloroform wurde durch die 40-minütige
Zentrifugation mit 4000 U/min bei 4°C in einer
Hochgeschwindigkeitszentrifuge Typ Megafuge 1.0 R der Firma Heraeus
eine Phasentrennung in RNA, DNA und Proteine herbeigeführt. Der klare
Überstand, der die RNA enthielt, wurde abpipettiert und mit 500 µl 100%
Isopropanol präzipitiert. Nach einer weiteren Zentrifugation wurde das
Pellet mit 3ml 75% Ethanol gewaschen und die RNA anschließend bei
Raumtemperatur getrocknet. Dann wurde die RNA in 500µl mit DEPC
behandeltem Wasser gelöst.
Die RNA-Konzentration der Proben wurde mit Hilfe einer Photometer-
Messung (Photometer der Firma Thermospectronic) bei 260nm bestimmt.
Die so hergestellten RNA-Proben wurden bis zur Weiterverwendung bei -
80°C gelagert.
 27 Dissertation Annette Walther

4.3 RT-PCR
Je 500ng RNA (bei der GnRH-Rezeptor-RT-PCR von Endometrium 750ng
RNA) wurden in einem Gesamtvolumen von 50µl mit 25µl 2x Reaction
Buffer ® (Invitrogen, Darmstadt, Germany), 1µl Superscript II Enzym ®
(Invitrogen, Darmstadt, Germany) und den spezifischen Primern
vervielfältigt. Der 1. Schritt war die cDNA-Synthese für 30 Minuten bei
40°C, es folgte ein Erhitzen bei 94°C für 2 Minuten, anschließend 35
Zyklen PCR mit 15 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 54°C und 2 Minuten
bei 68 °C. Der letzte Schritt waren 7 Minuten bei 72°C. Die Sequenz der
verwendeten Primer (Invitrogen Custom Primers) war für GnRH1: 5’-AAA
ACT CCT AGC TGG CCT TAT-3’ und 5’-GGA ATA TGT GCA ACT TGG
TG-3’.
Die Vervielfältigung der GnRH1-mRNA nach 35 Zyklen PCR führte zu
einer DNA mit der berechneten Größe von 399 bp.

Exon 1 2 3 4

399 bp

Abbildung 10:

Für GnRHR1 wurden Primer der Sequenz: 5’-GAT TGT CAT GCC ACT
GGA TG-3’ und 5’-TTA GAG TCT TCA GCC GTG CTC-3’ verwendet.
Das Vorhandensein von mRNA wurde durch eine β-Aktin-RT-PCR mit den
Primern 5’AGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCA 3’ und
5’GTGATCTCCTTCTGCATCCTGTCGGCAATGC 3’ nachgewiesen.
Die berechnete Größe des PCR-Produkts für GnRHR1-mRNA war 524 bp.
 28 Dissertation Annette Walther

Exon 1 2 3

524 bp

Abbildung 11:

Die Produkte der RT-PCR wurden mit Hilfe des High Pure PCR Product
Purification Kit® von Roche gereinigt und auf 1,2% Agarose-Gelen in 1 x
TBE (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,4) analysiert, mit
Ethidium-Bromid fixiert und fotografiert.
Eine Mengenbestimmung erfolgte mit Hilfe der Kodak 1D Image Analysis
Software im Vergleich zur β-Aktin-DNA, die im Bezug auf die
Molekulargewicht-Standards (Low Mass Standard, Invitrogen) quantifiziert
wurde. Anschließend wurden alle Werte auf den niedrigsten Wert der zur
β-Aktin-DNA normalisiert.
 29 Dissertation Annette Walther

4.4 Realtime-PCR
Für die Untersuchung der Gen-Expression mittels Realtime-PCR wurde
zunächst cDNA aus den RNA-Proben synthetisiert. Die reverse
Transkription erfolgte mit Hilfe eines High-Capacity-cDNA® Archive Kit
(Applied Biosystems) nach Herstellerangaben unter Zusatz eines
Mastermixes aus Reverse Transcriptase Puffer, dNTP, Random Primer,
Nukleasefreiem Wasser und Reverse Transcriptase Enzym durch
Inkubation für 2 Stunden bei 37°C in einem Peltier Thermal Cycler.
Für die PCR einschließlich Quantifizierung wurde ein ABI Prism 7000
Sequence Detection System verwendet. Alle Primer wurden als Assay-on
demand von der Firma ABI (Applied Biosystems) hergestellt und damit
eine 40 Zyklen umfassende PCR mit TaqMan Universal PCR Mastermix
(Applied Biosystems) sowie 50ng cDNA durchgeführt. Es wurde bei 22
Patientinnen mit Endometriose sowie bei 16 Kontrollpatientinnen die
Expression von GnRH1 und GnRHR1 getestet. Zur Qualitäts- und
Quantitätskontrolle wurde das 18s-rRNA Gen als „Housekeeping-Gen“
verwendet. Für die Standardkurve und Kalibratorreferenz wurde für
GnRH1 eine Kontrollprobe aus Uterusgewebe, für GnRHR1 aus
Granulosazellen verwendet.
Alle Standard- und Patientenproben wurden zwei Mal getestet und die
erhaltenen Werte zur Berechnung der Quantifikation gemittelt. Der
Schwellenwert wurde automatisch ermittelt und stets beibehalten. Die
Berechnung wurde nach dem von ABI empfohlenen Standardverfahren
durchgeführt.
 30 Dissertation Annette Walther

4.5 Statistische Auswertung

Bei der statistischen Berechnung der Ergebnisse wurde der Students t-
Test für unabhängige Stichproben verwendet. Das Signifikanzniveau lag
bei p < 0,05. Die Erfassung und Auswertung der Daten erfolgte mittels
eines SPSS Datenbanksystems (SPSS 13.0; SPSS Inc.) sowie mit Hilfe
von Microsoft Office Excel Version 2002.
 31 Dissertation Annette Walther

5. Ergebnisse
5.1 RT-PCR
Die Vervielfältigung der GnRH1-mRNA nach 35 Zyklen PCR führte zu
einer DNA mit der berechneten Größe von 399 bp. Dies konnte bei 16 der
22 Proben (73%) aus Endometriose-Gewebe und bei 15 der 15 Proben
(100%) aus Endometrium - Gewebe nachgewiesen werden, wie in Tabelle
3 dargestellt. Als Positivkontrolle wurde eine RNA aus fötalem Gehirn
(Clontech ®) mitgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgelistet.

Endometriose Kontrollen
Gewebe-Nr. GnRH1 GnRHR1 Gewebe-Nr. GnRH1 GnRHR1

pos neg pos neg

219 48
pos neg pos pos
220 315
neg neg pos pos
323 613
pos neg pos pos
359 702
pos neg pos pos
442 789
pos neg pos pos
479 883
neg neg pos pos
523 1076
pos neg pos pos
581 1189
neg neg pos pos
602 1194
pos neg pos pos
605 1219
pos neg pos pos
706 1226
neg neg pos neg
868 1387
pos neg pos neg
1043 1423
pos neg pos pos
1315 1929
pos neg pos pos
1413 1957
pos neg
1442
pos neg
1457
pos neg
1465
neg neg
1518
pos neg
1528
neg neg
1612
pos neg
1648
pos.: positiv; neg.: negativ
n=22 n=15

Tabelle 4: Ergebnisse RT-PCR

 32 Dissertation Annette Walther

Die berechnete Größe des PCR-Produkts für GnRHR1-mRNA war 524 bp.
Das Vorkommen von GnRHR1-mRNA konnte in keiner der 22 Proben aus
Endometriose-Gewebe gezeigt werden. In Endometrium-Gewebe wurde in
12 von 15 Proben (80%) GnRHR1-mRNA nachgewiesen. Auch hier wurde
fötales Gehirn (Clontech ®) als Positivkontrolle mituntersucht.

Die untenstehende Abbildung 12 zeigt die unter UV-Licht fluoreszierenden

Banden für GnRH1 (399bp) und GnRHR1 (524bp) in ausgewählten
Proben aus Endometriose-Gewebe (E) und Endometrium (K) sowie in
fötalem Gehirn als Positivkontrolle.

524bp

399bp

FB 219 220 1315 613 789 1929 FB 219 613 789 1929
E E E K K K E K K K

GnRH1 GnRHR1

Abbildung 12: Ergebnis der RT-PCR für GnRH1 und GnRHR1 aus Endometriose-
gewebe und Kontroll-Endometrium
FB: fötales Gehirn; E: Endometriosegewebe; K: Endometrium als Kontrollgewebe

Die Quantifizierung von GnRH1 in den einzelnen Proben erfolgte mit Hilfe
der Kodak 1D Image Analysis Software im Vergleich zur β-Aktin-DNA, die
im Bezug auf die Molekulargewicht-Standards (Low Mass Standard,
Invitrogen) quantifiziert wurde. Anschließend wurden alle Werte auf den
niedrigsten Wert der zur β-Aktin-DNA normalisiert. Die erhaltenen Werte
sind in Tabelle 4 dargestellt.
 33 Dissertation Annette Walther

normalisiertes
Gewebe-Nr. ß-Aktin GnRH 1 GnRH1

Endometriose
219 22.91 36.44 34,42
323 33.49 negativ 0,001
442 36.49 33.52 19,88
523 48.61 negativ 0,001
581 23.96 33.79 30,52
602 26.34 negativ 0,001
605 28.43 24.79 18,87
706 113.5 63.96 12,19
868 58.7 negativ 0,001
1043 61.66 109.3 38,36
1315 37.07 28.07 16,39
1413 39,14 95.71 52,92
1442 21.64 28.52 57,04
1457 38.23 128.1 72,51
1465 36.64 15.75 9,3
1518 31.53 negativ 0,001
1528 37.53 35.76 20,62
1612 39.56 negativ 0,001
1648 38.74 20.95 11,7

Endometrium
48 23.82 44.92 40,81
315 89.55 46.63 11,27
613 50.23 39.53 17,03
702 53.46 77.03 31,18
789 74.51 41.61 12,08
883 53.67 41.73 16,83
1076 50.64 60.82 26
1189 74.32 28.46 8,29
1194 84.56 32.37 8,28
1219 74.56 35.07 10,18
1226 62.12 186.3 64,9
1387 45.18 206.3 98,81
1929 71.71 53.91 16,27
1957 57 18.78 7,31

Tabelle 5: Quantifizierung der RT-PCR für GnRH1 aus Endometriosegewebe und

Kontrollendometrium

Die Genexpression der GnRH1-produzierenden Endometrioseläsionen

wurde mit der Genexpression von GnRH1 in normalem Endometrium
verglichen. Im t-Test für unabhängige Stichproben konnte kein
 34 Dissertation Annette Walther

signifikanter Unterschied gezeigt werden (p=0,662). Der Mittelwert für

GnRH1 war in Endometriosegewebe bei 30,3631 (von 9,3 bis 72,51), in
Endometriumgewebe bei 26,3743 (von 7,31 bis 98,81). GnRH1 war also in
Endometriosegewebe 1,15fach höher als in normalem Endometrium
nachweisbar.

25
100

80
10

24

60

40

20

Endometriose Endometrium

Abbildung 13: Boxplot zur Quantifizierung von GnRH1 in Endometriose-Gewebe und

Endometrium
 35 Dissertation Annette Walther

5.2. Realtime-PCR

GnRH1
Im t-Test für unabhängige Stichproben konnte kein signifikanter
Unterschied in der Genexpression von GnRH1 in Endometriosegewebe
(n=22) verglichen mit normalem Endometrium (n=16) gezeigt werden
(p=0,194). In der semiquantitativen Auswertung war der ct-Mittelwert für
GnRH1 in Endometriosegewebe bei 14,3495 (von nicht nachweisbar bis
152,22), in Kontroll-Endometrium bei 4,4713 (von 0,28 bis 34,18). GnRH1
war also in Endometriosegewebe 3,2fach höher als in normalem
Endometrium nachweisbar.

GnRHR1
Bei der Untersuchung der Genexpression von GnRHR1 konnte GnRHR1
weder in Endometriosegewebe noch in Endometrium detektiert werden.
 36 Dissertation Annette Walther

6. Diskussion

Endometriose, das Vorkommen von Endometrium-ähnlichem Gewebe

außerhalb des Uterus, ist mit einer Inzidenz von vermutlich etwa 15%
eines der häufigsten gynäkologischen Krankheitsbilder. Durch die von ihr
verursachten Fertilitätsstörungen und chronischen Unterbauchschmerzen
hat sie eine erhebliche klinische Relevanz. Die Entwicklung einer
optimalen Therapie wird jedoch dadurch erschwert, dass die Pathogenese
der Endometriose bis heute nicht vollständig geklärt ist.
Es existieren zwei wichtige Konzepte zur Entstehung der Endometriose:
nach der Metaplasietheorie von Meyer entstehen Endometrioseherde aus
der Umwandlung pluripotenter Zölomzellen im Peritoneum. Die
Transplantationstheorie nach Sampson geht dagegen von einer
Verschleppung endometrialer Zellen in den Bauchraum aus. Leyendecker
führte diese Idee im Archimetra-Konzept weiter. Die retrograde
Menstruation ist nach den Ergebnissen von Halme physiologisch, unklar
ist die zugrunde liegende Veränderung der Zellen, die zur Implantation
und Entstehung von Endometrioseherden führt. Es wurden bereits
verschiedene Mechanismen diskutiert, die zu einer Umwandlung führen
bzw. die Adhärenz, Invasion, Wachstum und Persistenz der Läsionen
ermöglichen bzw. fördern könnten, darunter genetische Prädisposition
(Lamb & Nichols 1986, Stefansson et al. 2002, Kashima et al. 2004), eine
abgewandelte Zusammensetzung der Peritonealflüssigkeit sowie eine
veränderte Immunreaktion (Dmowski & Braun 2004). Am
wahrscheinlichsten erscheint die genetische Alteration der
Endometriumzellen. P450 Aromatase wird in Endometriumzellen nicht
exprimiert, konnte jedoch in Endometriose-Läsionen nachgewiesen
werden. Des Weiteren ist die 17β-HSD II in Endometriose-Gewebe
fehlerhaft. Beides führt zu lokal erhöhten Östradiolspiegeln in den
Endometrioseherden, was die Proliferation der Läsionen zu stimulieren
scheint.
 37 Dissertation Annette Walther

Auch GnRH scheint das Wachstum des Endometriums zu beeinflussen:

Zum einen im Rahmen des hypothalamisch-hypophysären Regelkreises:
Natürliches GnRH führt zur vermehrten Freisetzung von FSH und LH aus
der Hypophyse, hierdurch kommt es zur verstärkten Bildung von
Östrogenen. Die Erhöhung der Östrogenkonzentration im Gewebe fördert
die Proliferation des Endometriums. Die Verabreichung von
langwirksamen GnRH-Agonisten als z.B. subkutane Depot-Injektion führt
zu einer paradoxen Desensibilisierung der hypophysären GnRH-Sekretion
und damit quasi zu einer biochemischen Kastration. Der somit induzierte
Östrogenmangel führt zu einer Regression der Endometrioseläsionen.
Außerdem wird von Vignali (1998) vorgeschlagen, dass GnRH auch als
direkter Wachstumsregulator von Endometriose-Zellen fungiert. Meresman
et al. (2003) konnten zeigen, dass GnRH-Analoga die Apoptoserate in
Zellkulturen aus eutopen Endometriumzellen von Frauen mit und ohne
Endometriose erhöhten sowie die Zellproliferation verringerten.
Kraus et al. (2001) zeigten, das GnRH1 durch Bindung an den GnRHR1
das endometriale Wachstum unterdrückt.
GnRH und GnRH-Analoga scheinen also, vermittelt durch den GnRHR,
das Wachstum von Endometrium und Endometriose-Gewebe direkt auf
zellulärer Ebene zu kontrollieren.
Nach Luo et al. 2004 aktivieren GnRH-Analoga den ERK1/2 Signalweg
durch die Phosphorylierung von ERK1/2,wie in Abbildung 14 dargestellt.
Dies könnte den Mechanismus darstellen, über den die
Wachstumskontrolle erfolgt.
 38 Dissertation Annette Walther

Abbildung aus EM Berlin 2006

MEK1/2

ERK1/2

Zielgene

Abbildung 14: Durch GnRH kontrolliertes Wachstum des Endometriums

 39 Dissertation Annette Walther

Ein Unterschied in der Expression von GnRH1 und GnRHR1 in

Endometriose-Zellen im Vergleich zu normalem Endometrium könnte also
ebenfalls das Wachstum der Endometriose-Läsionen beeinflussen.
Wir zeigten in unseren Versuchen das Fehlen des GnRHR1 in allen
Endometrioseproben bei gleichzeitigem Vorhandensein von GnRHR1 in
fast allen Proben aus normalem Endometrium. GnRH1 scheint im eutopen
Endometrium durch Bindung an den GnRHR1 das Wachstum zu
kontrollieren (Abbildung 14), indem es die Apoptoserate erhöht sowie die
Zellproliferation hemmt. Der Verlust des GnRHR1 im erkrankten Gewebe
stellt wohl einen Verlust der Wachstumskontrolle dar, da das vorhandene
GnRH keinen „Angriffspunkt“ für seine Steuerungsfunktion hat (Abbildung
15). Es kommt also zum unkontrollierten Wachstum des Endometriose-
Gewebes, während das Wachstum des Endometriums durch GnRH1 und
GnRHR1 exakt gesteuert wird.

GnRHR1

GnRH1
Endometrium

Kontrolliertes
Wachstum

Abbildung 15: Durch GnRH kontrolliertes Wachstum des Endometriums

 40 Dissertation Annette Walther

Im Rahmen der Endometriose kommt es durch das Fehlen des GnRHR1

zu einem Verlust der Wachstumskontrolle.

GnRH1
+1.2x
Östradiol

Endo-
metriose

gesundes kein GnRHR1:

Ovar Verlust der
Wachstumskontrolle

+1.2x
GnRH1
Kein GnRHR1:
Endo- Verlust der Wachstumskontrolle
metriose

Normales
Peritoneum

Abbildung 16: Unkontrolliertes Wachstum bei Endometriose

Im Labor durchgeführte Zellkultur-Versuche zeigten keine Wachstums-

hemmung von Endometriose-Zelllinien bei Behandlung mit GnRH1 und
Leuproline (ein GnRH-Agonist). Das kultivierte Kontroll-Endometrium
zeigte im Gegensatz dazu unter den gleichen Bedingungen eine lineare
Abnahme des Wachstums mit zunehmender Medikamentkonzentration
(eigene Daten, unveröffentlicht). Diese Versuche unterstützen die
Hypothese, dass der Verlust der GnRHR1-Expression in Endometriose-
Zellen zu einem Verlust der Wachstumskontrolle führt.
Das im Rahmen dieser Arbeit gezeigte Fehlen von GnRHR1 in
Endometriose-Gewebe steht im Widerspruch zu den Resultaten von
Borroni et al. 2000, die in allen untersuchten Endometriose-Proben
 41 Dissertation Annette Walther

GnRHR-mRNA mittels RT-PCR und Southern-Blot nachwiesen und bei

der Untersuchung von Zellkulturen aus Endometriose-Zellen in 38% der
Proben einen antiproliferativen Effekt von GnRH-Agonisten zeigten. Hier
wurde jedoch ausschließlich ovarielle Endometriose untersucht. Dies
deutet auf Unterschiede in der Genexpression bei unterschiedlichen
Lokalisationen der Endometriose hin. Dies sollte in weiteren
Untersuchungen überprüft werden.
Das nachgewiesene Fehlen des GnRHR1 in Endometriose-Gewebe
macht den Einsatz von GnRH-Analoga zur Therapie der Endometriose
fragwürdig. Ein direkter Einfluss auf die Proliferation des erkrankten
Gewebes scheint nicht möglich zu sein, da hier der GnRHR1 fehlt. Die
mögliche Wirkung lässt sich nur über die Induktion eines
Östrogenmangels im Gewebe durch Beeinflussung des hypophysär-
hypothalamischen Regelkreises erklären. Unklar bleibt, warum GnRH-
Analoga effektiver zur Regression von Endometriose-Herden führen als
orale Antikonzeptiva oder Gestagene, wenn die Wirkung jeweils
ausschließlich auf der Suppression der ovariellen Funktion beruht. In der
Praxis wichtiger scheint aber der Aspekt, dass die Verminderung der
durch die Endometriose hervorgerufenen Beschwerden bei den
genannten Substanzklassen gleichwertig ist (Leitlinie Endometriose der
DGGG).

Mit der Realtime-PCR wurde außerdem gezeigt, dass die Konzentration

von GnRH1 in Endometriosegewebe deutlich höher war als in normalem
Endometrium (siehe 5.2). Dies legt nahe, dass es durch den fehlenden
Rückkopplungsmechanismus über den GnRHR1 zur vermehrten Bildung
von GnRH1 kommt. Die erhöhten Konzentrationen des GnRH1 fördern
möglicherweise nochmals das unkontrollierte Wachstum des erkrankten
Gewebes.
Unter Umständen führt das aus den Läsionen vermehrt ausgeschüttete
GnRH1 außerdem, nach seiner Verteilung auf dem Blutweg, durch
Bindung an den GnRHR1 im gesunden Endometrium dort ebenfalls zu
einem veränderten Wachstum. Hier kommt es möglicherweise, durch
Bindung des vermehrt vorhandenen GnRH1 an den GnRHR1, zur
 42 Dissertation Annette Walther

verminderten Proliferation des Endometriums, was zu verschlechterten

Implantationsbedingungen des Embryos führen könnte. Dies könnte ein
Auslöser für die Fertilitätsprobleme von Frauen mit Endometriose sein,
zusätzlich zu den mechanischen Problemen wie Vernarbungen und
Tubenverklebungen. Es ist erwiesen, dass eine Koagulation bzw.
Resektion von Endometriose-Herden unabhängig von deren Lokalisation,
auch bei intakten tubo-ovariellen Strukturen, zu erhöhter Fertilität führt
(Ulrich et al. 2005). Es ist denkbar, dass dies durch den niedrigeren
Spiegel an GnRH1 verursacht wird.

Noch deutlicher war dieser Effekt für das im Labor ebenfalls untersuchte
GnRH2. Hier konnte ein signifikantes Überwiegen (p=0,001) der GnRH2-
Expression in Endometriosegewebe (n=21) verglichen mit Endometrium
(n=13) nachgewiesen werden. GnRH2 war in Endometriosegewebe
4,9fach höher als in normalem Endometrium nachweisbar (Oppelt 2009)

Finden all diese Veränderungen ausschließlich im erkrankten Gewebe

statt, unabhängig davon, ob das untersuchte Individuum an einer
Endometriose erkrankt ist? Nach Jurgensen (1996) ist die Zellproliferation
in eutopem Endometrium von Patientinnen mit Endometriose nicht höher
als in der Kontrollgruppe. Meresman (2003) zeigte die gleiche Wirkung
von GnRH-Agonisten auf Zellen aus eutopen Endometrium von Frauen
mit und ohne Endometriose. In der von uns durchgeführten RT-PCR
jedoch leiden von drei Frauen, in deren eutopem Endometrium kein
GnRHR1 gefunden wurde, zwei an einer Endometriose als
Grunderkrankung. Dies könnte der Grund für das vom Rest der
Kontrollgruppe abweichende Ergebnis für GnRHR1 sein. Um diesem
Hinweis nachzugehen, wäre für die Zukunft die vergleichende
Untersuchung der Expression von GnRH1 und 2 und GnRHR1 in
Endometrium und Endometriose-Gewebe der gleichen Patientin
interessant.
 43 Dissertation Annette Walther

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8. Abkürzungsverzeichnis
AFS American Fertility Society

bp Basenpaare

cDNA complementary DNA

ct-Wert threshold Cycling

DEPC Diethylpyrocarbonat
DGGG Deutsche Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe e.V.
DNA Desoxyribonukleinsäure

FSH Follikel-stimulierendes Hormon

GnRH Gonadotropin Releasing Hormon

GnRHR Gonadotropin Releasing Hormon Rezeptor

17β-HSD 17-beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase

LH luteinisierendes Hormon
Ligg. Ligamenta
Lig. Sacrout. Ligamentum sacrouterinum

mRNA messenger Ribonukleinsäure

n Anzahl
Nr. Nummer

OCP orale Kontrazeptiva

OP Operation

PCR Polymerase-Kettenreaktion
 52 Dissertation Annette Walther

RNA Ribonukleinsäure
rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
RT-PCR reverse-transcribed-Polymerase-Kettenreaktion

U/min Umdrehungen pro Minute

 53 Dissertation Annette Walther

9. Anhang
Patientinnen-Fragebogen zur Endometriose

1. Leiden oder litten Sie an einer der unten aufgeführten

Erkrankungen?

□ Krebserkrankungen __________________________
□ Autoimmunerkrankungen ______________________
□ chron. infektiöse Erkrankungen __________________
□ sexuell übertragbare Krankheiten ________________
□ bisherige gyn. Operationen od. andere Operationen im
Beckenbereich
___________________________________________
□ Allergien ____________________________________
□ sonstiges ___________________________________
2. Sind Sie Raucherin?
□ ja, _____ Zigaretten/Tag
□ nicht mehr, habe geraucht von ______ bis _______
□ nein
□ andere Genussmittel wie Schnupftabak o.ä.
___________________________________

3. Waren Sie bereits schwanger?

□ nein
□ ja, □ Vaginalentbindung _____
□ Sectio _____
□ Spontanabort _____
□ EUG _____
□ selbstgewollter Abbruch _____
Schwangerschaften insgesamt _____

4. Wo haben Sie in den letzten 2 Jahren gelebt?

□ Großstadt
□ kleine bis mittelgroße Stadt
□ ländliche Umgebung
 54 Dissertation Annette Walther

5. Sind in Ihrer Familie bereits Endometriosefälle bekannt?

Mutter □ ja □ nein
Schwester □ ja □ nein
Tochter □ ja □ nein
andere □ ja □ nein
6. Zyklusgeschichte
Menarchenalter:_____
Zyklus □ regelmäßig _____d
□ unregelmäßig
Blutungsdauer (d) _____
Blutungsstärke □ wenig □ normal □ viel
letzte Blutung (Tag/Monat/Jahr) _________________

7. Gab es bereits Eingriffe bezüglich der Endometriose?

□ nein
□ ja, Datum:__________ Klinik _________________
8. Haben Sie bereits erfolglos versucht, schwanger zu werden?

□ nein
□ ja, seit _________
□ Ist Sterilität bei Ihnen bekannt?
9. Wurde die Sterilität behandelt?

□ nein
□ ja, Methode: _____________
10. Haben Sie Schmerzen?

□ Dysmenorrhoe nach Biberoglu-Behrmann: ________

□ andere Schmerzen (z. B. Becken) nach Biberoglu-Behrmann:
________

Biberoglu-Behrmann:
0= keine Schmerzen
1= leichte Schmerzen (geringe Arbeitsbeeinträchtigung)
2= mäßige Schmerzen (für einen Teil des Tages im Bett)
3= starke Schmerzen (im Bett für einen oder mehrere Tage)
 55 Dissertation Annette Walther

Haben Sie weitere Beschwerden?

□ nein
□ ja, □ rektale Blutung
□ Blut im Urin
□ andere Beschwerden: _____________________
11. Wann traten erstmals Beschwerden auf?
Alter: ___________

12. Leiden oder litten Sie während der Schwangerschaft unter

Schmerzen
□ nein □ ja
Wie stark waren/sind die Schmerzen im Vergleich zum nicht
schwangeren Zustand?
□ stärker □ schwächer □ gleich
13. Therapie und Kontrazeptiva-Einnahme der letzten 6 Monate:

Name Dosis Beginn Ende letzte regel-

Einnahme mäßig?
orale Kontrazeptiva _____
GnRH ______ _____
Danazol ______
Gestagen
NSAID
IUD _____
Andere

14. Hat Ihre Mutter Kontrazeptiva eingenommen?

□ unbekannt
□ nein
□ ja, welche: ______________
 56 Dissertation Annette Walther

10. Danksagung

Ich bedanke mich herzlich bei meinem Doktorvater Herrn Prim. PD Dr.
Peter Oppelt MBA für die Überlassung dieses Themas und die gute
Betreuung, insbesondere in der schwierigen Abschlussphase der Arbeit.

Herrn Prof. Dr. M.W. Beckmann, Direktor der Klinik für Frauenheilkunde
mit Poliklinik und Hebammenschule der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg, danke ich für die Möglichkeit der Durchführung dieser
Promotion in seinem molekularmedizinischen Labor.

Besonderer Dank gilt Frau Dr. Strissel und Herrn Dr. Strick für die gute
Einarbeitung in die molekularbiologischen Methoden und dafür, dass sie
jederzeit zur Hilfe bereit waren. Auch Frau Elisabeth Stiegler und Frau
Sonja Oeser danke ich für viele praktische Tipps und Unterstützung und
viele Tassen Kaffee.

Zum Schluss bedanke ich mich besonders bei meiner Familie und meinen
Freunden, die mich immer wieder zum Weiterarbeiten ermutigten.