BAB I

PENDAHULUAN

Merokok, bentuk penggunaan tembakau yang paling umum, bertanggung

jawab atas ratusan ribuan kematian dini dan penyakit kronis setiap tahunnya .1
Banyak epidemiologis Penelitian telah menunjukkan bahwa asap rokok
berkorelasi positif dengan peningkatan kematian manusia melalui berbagai
penyakit kronis, termasuk ginjal, kardiovaskular, paru, dan penyakit hati serta
beberapa bentuk kanker. Asap rokok terdiri dari berbagai konstituen dan
memberikan banyak peran patofisiologis. Dari jumlah tersebut, nikotin,
komponen adiktif rokok, mengikat reseptornya, yang memiliki beberapa subtipe
(α1 ± 10, β1 ± 4, δ, γ, dan ε), dan dengan demikian, ada tindakan langsung pada
sel neuronal dan non-neuronal.7 Nikotin memiliki banyak biologis efek, seperti
peradangan atau anti-inflamasi, proliferasi sel, apoptosis, angiogenesis, dan
fibrosis .1,2,3
Respon penyembuhan luka yang disebabkan oleh kerusakan jaringan adalah
proses yang kompleks dan dinamis melibatkan berbagai protein matriks
ekstraselular, faktor pertumbuhan, dan sitokin. Tiga fase Penyembuhan luka
didefinisikan sebagai peradangan, pembentukan jaringan (proliferasi), dan
pematangan (remodeling jaringan), yang sementara tumpang tindih. Peradangan
ditandai dengan rekrutmen dari neutrofil dan makrofag ke tempat yang cedera
sebagai respons terhadap kemokin. Utama dan kejadian utama yang terjadi
selama fase kedua penyembuhan luka, yang dikenal sebagai pembentukan
jaringan atau fase proliferatif, meliputi restorasi epitermal, pembentukan baru
pembuluh darah, proliferasi fibroblas, dan produksi matriks ekstraselular
(ECM). Regenerasi jaringan ( tissue regeneratif) adalah tahap terakhir
penyembuhan luka dan melibatkan regresi vaskular dan progresif remodeling
jaringan granulasi. Namun, kelebihan radang dan fibrosis jaringan / Jaringan
parut pada saat penyembuhan luka sembuh mengganggu fungsi normal jaringan
dan organ.2,3,4,5

1
 Jaringan kornea ditandai dengan tidak adanya pembuluh getah bening dan
pembuluh darah di bawahnya kondisi normal, yang memungkinkan kejelasan
optik dan ketajaman visual . Infeksi atau trauma diinduksi oleh cedera kimia /
bedah pada kornea dapat menyebabkan neovaskularisasi (NV) dan fibrosis /
jaringan parut, mengakibatkan hilangnya transparansi kornea dengan visual
permanen permanen penurunan nilai. Respon penyembuhan luka kornea yang
terbakar alkali dicirikan sebagian oleh infiltrasi makrofag / monosit dan neutrofil
ke stroma kornea dari limbus dan perubahan fenotip seluler. Namun,
penghambatan CXCR2-mediated infiltrasi neutrophil gagal menipiskan kornea
yang diinduksi dengan alkali, yang mengindikasikan bahwa NV kornea dapat
terjadi secara independen dari akumulasi neutrofil. Selanjutnya aktivasi
keratosit, pembentukan myofibroblast, dan neovaskularisasi berikutnya dan
fibrosis jaringan semuanya terlibat dalam penyembuhan luka respon atau
pembentukan luka bakar alkali kornea.3,4,5
Sementara keratosit kornea normal berkontribusi pada pemeliharaan
kejernihan kornea, terganggunya integritas kornea akibat trauma yang
disebabkan oleh alkali berdifrensiasi menjadi fibroblas dan / atau myofibroblas.
Myofibroblas kornea memiliki morfologi yang berbeda dibanding keratosit dan
mengekspresikan aktin otot α-polos (α-SMA) Di antara banyaknya sitokin dan
faktor pertumbuhan yang mempengaruhi penyembuhan luka respon,
transformasi growth factor-β (TGF-β) memainkan peran penting dalam
regenerasi jaringan rusak. Secara khusus, TGF-β1 adalah stimulator poten
kolagen tipe I (Col1) pada fibroblas, dan, bersamaan, ini juga menghambat
ekspresi beberapa metaloproteinase matriks (MMPs), yang selanjutnya
mendorong akumulasi serabut kolagen dan pembentukan fibrotik jaringan . Juga,
TGF-β1 adalah induser kuat dari diferensiasi fibroblas ke myofibroblasts. Sel-
sel yang terdiferensiasi ini memainkan peran penting dalam perbaikan luka
dengan mengeluarkan protein ECM, termasuk beberapa jenis kolagen. Namun,
respon penyembuhan luka pada jaringan kornea adalah terkait erat dengan kabut
kornea, pembentukan parut, dan penyimpangan permukaan setelah kornea
operasi, infeksi, dan cedera.3,4,5,6

2
 Studi terbaru menunjukkan bahwa penyembuhan epitel yang terhambat
pada perokok dibandingkan dengan bukan perokok dengan lecet kornea dan
keratitis. Neurotrophic corneas dan infeksi jamur juga memperpanjang waktu
yang diperlukan untuk penyembuhan pada perokok. Selain itu, diketahui bahwa
asap rokok yang dihirup oleh perokok pasif, menunda repitelisasi kornea dan
penyembuhan pada tikus dengan merangsang peradangan dan degradasi ECM .
Selanjutnya, aktivasi reseptor asetilkolin nikotin (nAChRs) dengan nikotin
meningkatkan NV choroidal dan dapat menyebabkan peningkatan kejadian
pembentukan neovessel choroidal yang terlihat pada perokok dengan degenerasi
makula terkait usia. Namun, sedikit yang diketahui mengenai efek nikotin pada
neovaskularisasi kornea dan fibrosis yang disebabkan oleh luka bakar kimia.
Karena itu, referat ini dibuat untuk mengetahui efek tersebut pada model cedera
kornea alkali.4,5,6

3
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Efek Pemberian Nikotin Terhadap Penyembuhan Luka Kornea

1. Metode dan Protokol Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian yaitu tikus Balb/c betina
umur 8 minggu. Tikus dipertahankan dalam kondisi standar, lingkungan
bebas patogen dengan siklus terang/gelap 12 jam. Pada kelompok yang
diberi nikotin, tikus (n = 6 ± 7 ekor / kelompok) menerima nikotin dalam air
minumnya (100 μg / ml atau 200 μg / ml dalam sakarin 2% 2% larutan
sakarin sendiri diberikan pada kelompok kontrol. Pemberian nikotin pada
konsentrasi 100 μg / ml memberikan kadar nikotin serum setara dengan
perokok 1 pak/hari Setelah 1 minggu, tikus diberi anestesi dengan injeksi
Zoletil i.m dengan dosis 0,2 ml / Kg berat badan Setelah penggunaan topikal
tetes 0,5% proparakain hidroklorida ke permukaan kornea untuk analgesia
lokal, selembar kertas saring Whatman 3 (berdiameter 2 mm) yang
direndam dalam NaOH 1N ditempatkan di tengah kornea kiri. selama 40
detik. Permukaan okular kemudian dibilas dengan 25 ml PBS.5,6
Setelah diberi luka bakar alkali, tikus dieutanisasi dengan dislokasi
serviks setelah anestesi, dan kornea dikeluarkan pada interval waktu yang
ditunjukkan (4, 7, dan 14 hari). Kornea disimpan pada suhu -80 C dan
digunakan untuk ekstraksi RNA. Mata berada dalam formalin fosfat-buffer
10% untuk analisis histopatologis.7
2. Pemeriksaan Mikroskopis
Mata diperiksa dengan stereomikroskop pada hari ke 7 dan 14 setelah
cedera oleh karena alkali. Panjang pembuluh darah baru kornea diukur
dengan menggunakan perangkat lunak digital imaging. Penilaian
mikroskopis dilakukan oleh pengamat tanpa sepengetahuan prosedurnya.6,7
3. Reaksi Rantai Polimerase Real Time Kuantitatif qRT-PCR
Total RNA diisolasi dari jaringan dengan menggunakan kit ekstraksi
Easy-Spin Total RNA (GeneAll, Seoul, Korea). Mengikuti inkubasi dengan

4
 DNase I bebas RNase (Promega, Madison, WI, AS), Transkripsi terbalik
dilakukan dengan menggunakan primer acak dan reverse MLScript MLL
transcriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) menurut
produsennya instruksi. cDNA dikenai qRT-PCR pada Sistem Deteksi PCR
Real-Time CFX96 ™ (Laboratorium Bio-Rad, CA, AS) menggunakan
SYBR Green I sebagai DNA beruntai ganda pewarna mengikat Setelah
reaksi selesai, spesifisitas diverifikasi dengan analisis kurva meleleh.
Kuantifikasi dilakukan dengan menormalisasi nilai Ct masing-masing
sampel menjadi murine atau gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase manusia
(GAPDH atau hGAPDH).7,8,9
4. Analisis Imunohistokimia
Untuk mendeteksi ekspresi αSMA pada kornea yang terluka
pewarnaan imunohistokimia dilakukan Secara singkat, bagian jaringan
kornea diinkubasi dengan antibodi anti-αSMA kelinci semalam pada suhu
4°C Jumlah sel positif per milimeter persegi dihitung dalam lima bidang
yang dipilih secara acak dari slide pengecatan imunohistokimia dengan
pembesaran 200 kali lipat.6,7
5. Western Blot Assay
Jaringan kornea dan sel secara langsung dilisis selama 30 menit di atas
es dengan buffer ekstraksi (T-PER dan RIPA, Thermo Fisher Scientific Inc.,
Waltham, IL, AS). Setelah sentrifugasi pada 13.000 g selama 15 menit pada
suhu 4 ° C, konsentrasi protein dalam supernatan diukur menggunakan kit
Protein Protein Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, IL,
AS) sesuai dengan protokol pabrikan. Protein dimasukkan ke dalam sodium
dodecyl sulfatepolyacrylamide gel elektroforesis (SDS-PAGE) gel,
dipindahkan ke polyvinylidene difluoride (PVDF), dan kemudian diblokir
dengan 5% susu kering tanpa lemak di buffer Tris salin (20 mM Tris, 150
mM NaCl, pH 7,4) dengan 0,05% Tween-20 selama 1 jam di RT. Pertama
antibodi diencerkan 1: 1000 dalam larutan pemblokiran dan diinkubasi
semalam pada suhu 4 ° C. 5,6,7

5
 antibodi digunakan: antibodi anti-αSMA kelinci (Abcam, Cambridge,
Inggris) dan anti- β-actin (Santa Cruz Bioteknologi Inc., Dallas, TX, AS).
Untuk mendeteksi kompleks antigen-antibodi, antibodi sekunder
terkonjugasi peroksidase (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA)
diencerkan 1: 2000 dalam larutan pemblokiran dan diinkubasi selama 1 jam
di RT. Proteinnya pita divisualisasikan dengan sistem deteksi
chemiluminescence (ECL) yang disempurnakan menggunakan Image
Quant ™ LAS 500 (Ilmu Kesehatan GE, Pittsburgh, PA, AS). Protein
tingkat ekspresi diukur dengan perangkat lunak Image Quant ™ TL.7,8,9
6. Kulture Sel
Sel fibroblas kornea manusia diberikan oleh Prof. Eung Kweon Kim
(Universitas dari Yonsei, Seoul, Korea Selatan). Sel dikultur di Eagle yang
dimodifikasi Dulbecco medium (DMEM; Thermo Fisher Scientific Inc.,
Waltham, IL, AS) dengan glukosa tinggi, 10% FBS, 100 penisin IU / ml,
dan streptomisin 100 μg / ml pada suhu 37 ° C dalam inkubator 4% CO2
dilembabkan. Sel dibiakkan sampai 80% konfluen dan mediumnya berubah
setiap 2 hari. Sel-sel secara rutin dipaparkan dengan trypsinization
menggunakan trypsin 0,05%. Sel itu diunggulkan di sumur dengan pelat 12-
sumur (2 × 105 sel / ml) dengan 1 ml media per sumur, dan kemudian diobati
dengan NaOH 0,01 N dengan atau tanpa konsentrasi nikotin atau cotinine
yang ditunjukkan (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AS) untuk meniru luka
kornea alkali, seperti sebelumnya dijelaskan [28]. Pelat diinkubasi selama
24 jam di inkubator humidified 37 ° C mengandung 5% CO2. Setelah
dikultur untuk waktu yang ditentukan, sampel digunakan untuk
karakterisasi lainnya.8,9
7. Uji Proliferasi Sel
Sel diunggulkan di sumur dengan 96 piring (5 × 104 sel / ml) dengan
100 μl media per sumur, dan kemudian diijinkan untuk bertahan dan tumbuh
selama 24 jam, dilanjutkan dengan pengobatan dengan konsentrasi yang
ditunjukkan nikotin atau cotinine dan bahan lainnya. Ro-32-0432 (RO;
Bioteknologi Santa Cruz Inc, Dallas, TX, AS) dan Wortmannin (WO; Santa

6
 Cruz Bioteknologi Inc, Dallas, TX, USA) digunakan untuk menghambat
protein kinase C (PKC) dan phosphoinositide 3-kinase (PI3K) masing-
masing. Setelah 24 jam inkubasi, proliferasi sel dievaluasi menggunakan
CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies Inc. Rockville, MD, USA)
menurut produsennya instruksi. Penyerapan sampel dibacakan dengan
spektrofotometer (EMax, Molecular Perangkat, Sunnyvale, CA, AS).8,9
8. Analisis Statistik
Semua data dinyatakan sebagai mean ± standard error. Perbedaan
antara beberapa kelompok adalah dibandingkan dengan menggunakan
analisis varians satu arah (ANOVA) dengan SAS versi 9.1 (SAS Institute
Inc., Cary, NC, USA); Perbandingan individu diperoleh dengan Duncan's
Multiple Range Uji (DMRT). Perbedaan antara dua kelompok
dibandingkan dengan menggunakan murid dua ekor t-test Nilai p <0,05
dianggap signifikan secara statistik.
9. Hasil Penelitian Pemberian Nikotin Mempromosikan Pembentukan
Pembuluh Darah Baru di Kornea Setelah Luka Bakar Alkali
Untuk menilai efek nikotin terhadap respons angiogenik pada jaringan
kornea, pertama-tama kita periksa NV pada tikus kornea setelah mengalami
luka alkali. Karena pembuluh darah baru diamati dalam tahap pertama
minggu setelah pembakaran alkali kornea, penelitian ini mengkonfirmasi
adanya pembuluh darah baru di kornea tersebut jaringan pada hari ke 7 dan
14 pasca cedera.
Sejalan dengan laporan sebelumnya, stereomikroskopik pengamatan
menunjukkan pembuluh limbal masuk ke kornea pada hari ke 7 setelah luka
bakar. Di hari ke 14 pasca cedera, sejumlah besar struktur neovaskular
diamati di kornea dibandingkan dengan yang terlihat pada hari ke 7.
Menariknya, bertambah luas dan panjang kapal yang diamati pada
kelompok yang diobati dengan nikotin 7 atau 14 hari setelah cedera. Juga,
gejala seperti itu menjadi lebih parah pada kelompok yang diobati dengan
nikotin dengan cara tergantung dosis (Gambar 1A).

7
Gambar 1. A. Tampilan mikrofonkopik mata tikus pada hari ke 7 dan 14.
Panjang pembuluh darah baru yang telah ditentukan. B. Hasil qRT-PCR
untuk mendeteksi tingkat mRNA VEGF dan MMP9 ditunjukkan. Data
adalah dinyatakan sebagai mean ± SEM per kelompok dan dianalisis dengan
ANOVA. Kelompok eksperimen yang ditandai dengan huruf yang berbeda
(a, b, atau c) mewakili signifikan Perbedaan pada p <0,05 dibandingkan
dengan kelompok kontrol pada setiap hari. N.S, tidak signifikan.
Untuk lebih jelasnya efek nikotin pada pembentukan pembuluh darah
baru, selanjutnya dianalisis mRNA ekspresi gen terkait angiogenesis faktor
pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) dan MMP9 di jaringan kornea
mengikuti luka alkali. Ekspresi VEGF dan MMP9 secara signifikan
mengalami peningkatan pada tikus yang diobati dengan kadar nikotin yang
tinggi dibandingkan dengan kontrol tikus pada hari ke 4 dan 7, masing-
masing (Gambar 1B). Secara keseluruhan, hasil penelitian tersebut

8
 menunjukkan bahwa pemberian nikotin meningkatkan NV pada cedera
kornea.
Secara kolektif, data ini menunjukkan bahwa pemberian nikotin dapat
meningkatkan jaringan perbaikan jaringan fibrotik yang terkait dengan
opasitas kornea dan kehilangan penglihatan setelah cedera kimia.8,9,10
10. Ekspresi nAChR pada Fibroblas Kornea dan Jaringannya Meningkat
dengan Luka Bakar Alkali.
Karena nikotin memberi efek berbahaya pada penyembuhan luka
kornea, penelitian ini menyelidiki apakah cedera kimia mempengaruhi
ekspresi reseptor nikotin. Di antara gen subtipe nAChR, tingkat mRNA
subunit α3, 7, dan β1 nAChR meningkat secara signifikan pada 0,01N
Fibroblas kornea yang diberi perlakuan NaOH dibandingkan dengan sel
yang tidak diobati (Gambar 3A). Dengan demikian, selanjutnya dievaluasi
ekspresi gen ini pada jaringan kornea tikus pada hari ke 14 setelah cedera.
Itu Hasil penelitian menunjukkan bahwa tingkat subunit α3 dan 7 nAChR
meningkat secara nyata jaringan kornea yang mengalami korosi
dibandingkan dengan kornea yang tidak terluka. Juga, ungkapan tingkat
subunit β1 nAChR cenderung meningkat, namun tidak ada perbedaan yang
signifikan antara kelompok (Gambar 3B).

9
 Gambar 2. Evaluasi ekspresi gen fibrogenik pada jaringan kornea yang
terluka. (A) tingkat mRNA dari gen fibrogenik αSMA, TGFβ1, dan Col1
adalah dianalisis. (B) Jaringan kornea 14 hari setelah cedera diwarnai
dengan antibodi anti-αSMA. Gambar diperlihatkan pada pembesaran 200x.
Persentase daerah positif αSMA dievaluasi pada jaringan kornea. (C) kadar
protein αSMA ditentukan oleh Western blotting pada jaringan kornea
dengan atau tanpa pengobatan NIC 14 hari setelah luka bakar alkali. Nilai
dinyatakan sebagai mean ± SEM. Data dianalisis dengan ANOVA.
Kelompok eksperimen ditandai dengan huruf yang berbeda (a, b, atau c)
mewakili perbedaan yang signifikan pada p <0,05 dibandingkan dengan
kelompok kontrol pada setiap hari. N.S, tidak signifikan.9,10
11. Ekspresi nAChR pada Fibroblas Kornea dan Jaringan Meningkat oleh
karena Luka Bakar akibat Alkali
Karena nikotin memberi efek berbahaya pada penyembuhan luka
kornea, penyelidikan dilakukan apakah cedera kimia mempengaruhi
ekspresi reseptor nikotin. Di antara gen subtipe nAChR, tingkat mRNA
subunit α3, 7, dan β1 nAChR meningkat secara signifikan pada 0,01N.
Fibroblas kornea yang diberi perlakuan NaOH dibandingkan dengan sel
yang tidak diobati (Gambar 3A). Dengan demikian, selanjutnya dievaluasi
ekspresi gen ini pada jaringan kornea tikus pada hari ke 14 setelah cedera.
Itu Hasil penelitian menunjukkan bahwa tingkat subunit α3 dan 7 nAChR
meningkat secara nyata jaringan kornea yang mengalami korosi
dibandingkan dengan kornea yang tidak terluka. Juga, ungkapan Tingkat
subunit β1 nAChR cenderung meningkat, namun tidak ada perbedaan yang
signifikan. antara kelompok (Gambar 3B).6,7

10
 Gambar 3. Perbandingan ekspresi subunit nAChR. (A) Analisis qRT-PCR
perwakilan menunjukkan ekspresi α1 ± 10, β1 ± 4, γ, δ, dan subunit ε
nAChR pada fibroblas kornea. Nilai yang disajikan berasal dari tiga
eksperimen independen dan masing-masing sampel diuji dalam rangkap
dua. (B) tingkat mRNA subunit α3, α7, dan β1 nAChR pada jaringan kornea
14 hari setelah cedera. Data dinyatakan sebagai mean ± SEM per kelompok
dan dianalisis dengan uji tangkap dua ekor; P <0,05, P <0,01. N.S, tidak
signifikan.11,12
12. Pengobatan Nikotin dan Cotinine Menginduksi Ekspresi Gen Fibrotik di
Fibroblas Kornea yang Diberi Perlakuan Alkali.
Untuk lebih menyelidiki peran nikotin pada respon fibrotik pada
fibroblas kornea, kita menilai ekspresi gen fibrotik αSMA dan TGF-β pada

11
fibroblas kornea selama 24 jam dengan atau tanpa nikotin atau cotinine,
yang merupakan salah satu metabolit nikotin utama.
Tanpa diduga, hasilnya menunjukkan bahwa konsentrasi nikotin dan
metabolitnya menunjukkan tidak mempengaruhi ekspresi gen terkait
fibrosis pada fibroblas kornea (Gambar 4A). Demikian, Selanjutnya
dilakukan evaluasi apakah ekspresi gen fibrotik dipengaruhi oleh
pengobatan dengan keduanya senyawa pada fibroblas kornea. Menariknya,
tingkat ekspresi ini gen secara signifikan ditambah dengan perlakuan NaOH
0,01 N. Apalagi efek ini lebih jauh meningkatkan pengobatan dengan
nikotin atau cotinine pada konsentrasi yang ditunjukkan (Gambar 4B).
Selanjutnya, pola serupa diamati pada kadar protein αSMA, seperti
yang dikonfirmasi oleh Western blotting (Gambar 4C). Hasil menunjukkan
bahwa nikotin atau cotinine dikombinasikan dengan luka alkali secara
sinergis dapat mengerahkan aktivitas fibrotik pada fibroblas kornea.

Gambar 4. Penilaian kadar gen fibrogenik pada fibroblas kornea manusia.

(A) Sel diperlakukan dengan yang ditunjukkan konsentrasi NIC atau COT.

12
 Setelah inkubasi 24 jam, ekspresi mRNA αSMA dan TGFβ1 ditentukan
oleh sel qRT-PCR (B) diobati dengan konsentrasi NIC atau COT yang
ditunjukkan bersama dengan NaOH 0,01N untuk menginduksi cedera
kimia. Setelah 24 jam ' inkubasi, ekspresi mRNA αSMA dan TGFβ1
ditentukan oleh qRT-PCR. (C) Tingkat protein αSMA ditentukan oleh
Western blotting di total lysates sel. Nilai yang disajikan berasal dari dua
percobaan independen dan masing-masing sampel diuji dalam rangkap dua.
Data dinyatakan sebagai mean ± SEM per kelompok dan dianalisis dengan
ANOVA. Kelompok eksperimen yang ditandai dengan huruf yang berbeda
(a, b, atau c) merupakan perbedaan yang signifikan antara kelompok pada p
<0,05.11,12
13. Proliferasi Fibroblas Kornea Disebabkan oleh Nikotin dan Cotinine
Perlakuan Berkurang dengan Penghambatan Pensinyalan PI3K
(Phosphoinositide 3-Kinase) dan Jalur PKC (Protein Kinase C)
Untuk mengevaluasi apakah efek fibrotik nikotin atau cotinine
dimediasi oleh proliferasi kornea fibroblas, sel diinkubasi dengan nikotin
atau cotinine plus inhibitor spesifik, WO atau RO. Didokumentasikan
dengan baik bahwa nikotin terlibat dalam beberapa jalur sinyal intraselular,
seperti jalur janin-activated kinase / STAT, PKC, PI3K / Akt, dan Ras / Raf
/ MEK / ERK. 11,12,13
Satu studi baru-baru ini menunjukkan bahwa nikotin dapat
menginduksi proliferasi sel stellata hepar dimediasi oleh PI3K dan PKC dan
berkontribusi pada fibrosis hati pada penyakit hati kronis. Selain itu, nikotin
mempercepat perkembangan penyakit ginjal kronis dengan meningkatkan
mesangial proliferasi sel melalui aktivasi PKC. Karena pengobatan nikotin
dan cotinine meningkat transdifferentiasi fibroblas kornea setelah luka
alkali karena peningkatan ekspresi αSMA (Gambar 4B dan 4C), selanjutnya
dinilai apakah jalur sinyal ini terlibat dalam proliferasi sel-sel ini yang
diinduksi oleh pengobatan dengan nikotin atau cotinine dengan atau tanpa
0,01N NaOH. Pengamatan pada peningkatan yang jelas dalam proliferasi
sel-sel ini setelah perawatan dengan 1 μMnicotine atau cotinine serta

13
 perlakuan NaOH 0,01 N saat nikotin atau cotinine diberikan bersama
dengan 0,01N NaOH, proliferasi sel-sel ini meningkat tajam, menariknya
efek tersebut dikurangi secara signifikan dengan pengobatan dengan WO
dan RO, yang memblokir jalur pensinyalan PI3K dan PKC masing-masing
(Gambar 5A dan 5B).11,12,13
Data ini dengan jelas menunjukkan bahwa nikotin dan cotinine
mempromosikan proliferasi kornea fibroblas melalui aktivasi PI3K dan
PKC.

Gambar 5. Penentuan molekul sinyal intraselular yang terlibat dalam

proliferasi fibroblas kornea yang diinduksi oleh pengobatan dengan NIC
atau COT. Penghambat spesifik WO dan RO digunakan untuk menghambat
PI3K dan PKC. (A dan B) Sel proliferasi ditentukan oleh uji CCK-8. Nilai
yang disajikan berasal dari tiga eksperimen independen. Data dinyatakan
sebagai mean ± SEM per kelompok dan dianalisis dengan uji tangkap dua
ekor; P <0,05,P <0,01.
Penelitian sebelumnya berfokus pada efek nikotin pada perubahan histologis
pada mata yang ditunjukkan bahwa paparan nikotin menginduksi penurunan
ketebalan retina total secara normal dan diabetes tikus. Selain itu, nikotin

14
menyebabkan penurunan ketebalan choroidal yang signifikan setelah pemberian
oral dengan pengurangan aliran darah okular. Selanjutnya injeksi subkutan dari
nikotin ditemukan berhubungan dengan beberapa perubahan morfologis pada retina
dan lensa, seperti penurunan kepadatan sel ganglion retina, atrofi lapisan serat saraf
retina, dan penipisan dari kapsul lensa . Nikotin juga mempengaruhi morfologi dan
fungsi pigmen retina sel epitel, menunjukkan bahwa efek nikotin mungkin terlibat
dalam hubungan merokok pada penyakit retina. Beberapa penelitian telah
memberikan bukti nyata bahwa nikotin memperngaruhi hal tersebut.10,11
neovaskularisasi choroidal karena mekanisme kerjanya melibatkan peningkatan
proangiogenik VEGF dan penurunan faktor antigen pigmen pigmen yang
diturunkan di retina sel epitel pigmen , dan nikotin memfasilitasi perekrutan sel-sel
yang berasal dari sumsum tulang ke dalam lesi neovaskularisasi choroidal. Dengan
demikian, administrasi topikal mecamylamine, yang merupakan antagonis
nospektif nonselektif, dapat memperbaiki NV choroidal yang terkait dengannya
AMD ada atau tidak adanya stimulasi nikotin .12,13
Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa pemberian nikotin kronis
selama 3 minggu tidak mempengaruhi morfologi kornea pada tikus. Bisa
dibayangkan metabolitnya nikotin mungkin tidak mempengaruhi kondisi normal
jaringan kornea karena avaskularitasnya. Serupa temuan kami saat ini, sebuah studi
klinis baru-baru ini menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan
diamati pada kerapatan endotelial kornea, ketebalan kornea sentral, atau morfologi
endotel antara perokok dan bukan perokok. Namun, jaringan kornea alkali yang
dibakar dipengaruhi oleh pengobatan nikotin, menunjukkan bahwa pembuluh darah
yang baru terbentuk dapat dilibatkan tindakan patologis nikotin. Begitu kornea NV
berkembang mengikuti luka traumatis, itu selanjutnya dipercepat oleh nikotin dan /
atau metabolitnya, termasuk cotinine. Hasil kami juga menunjukkan bahwa
pemberian nikotin kronis dapat meningkatkan NV kornea pada hari ke 7 dan 14
setelah kornea terbakar alkali. Selain itu, kami mengamati peningkatan ekspresi gen
proangiogenik VEGF dan MMP9 pada kornea yang terluka setelah pemberian
nikotin.12,13

15
 Karena cedera kornea traumatis menginduksi respon fibrogenik kornea, kami
juga menilai efek nikotin pada respon penyembuhan luka terkait fibrosis kornea.
Kami menemukan itu pemberian obat nikotin kronis mempercepat akselerasi pada
kornea yang terluka. Efek ini ternyata menjadi konsekuensi meningkatnya aktivasi
keratosit karena bertambahnya jumlah sel positif αSMA diamati pada stroma
kornea pada tikus yang diberi nikotin setelahnya luka alkali sesuai dengan hasil ini,
mRNA dan kadar protein αSMA adalah meningkat secara signifikan pada fibroblas
kornea yang mengalami alkali setelah pengobatan nikotin atau cotinine. Studi
terbaru yang mendukung temuan kami menunjukkan bahwa nikotin memodulasi
diferensiasi fibroblas paru dan sel stellata hepatik, yang menghasilkan peningkatan
ekspresi.
Selain itu, pengamatan cedera alkali meningkatkan tingkat mRNA α3, 7, dan
β1 nAChR pada fibroblas kornea dan jaringan kornea pada hari ke 14 setelah
cedera, kecuali β1 nAChR. Meskipun kami tidak mengkonfirmasi tingkat protein
subunit nAChR, ekspresi meningkat Reseptor-reseptor ini yang disebabkan oleh
luka alkali dapat memperkuat aksi nikotin pada luka-luka jaringan kornea serta
fibroblas kornea.
Beberapa penelitian terbaru menunjukkan bahwa nikotin secara signifikan
mengatur ekspresi TGF-β1 dan reseptornya dan merangsang ekspresi gen terkait
fibrosis. Serupa dengan pengamatan ini, hasil kami menunjukkan bahwa kadar
mRNA TGF-β1 juga ditambah pada fibroblas kornea yang diberi perlakuan alkali
dengan perawatan nikotin atau cotinine. Itu baik diketahui bahwa TGF-β adalah
regulator kritis yang terlibat dalam penyembuhan luka terkait fibrosis, perbaikan
dan diferensiasi pada banyak jaringan dan jenis sel. Penelitian sebelumnya
menunjukkan bahwa TGF-β memainkan peran penting dalam transformasi keratosit
menjadi myofibroblasts, produksi ECM, dan akibatnya fibrogenesis kornea.
Dengan demikian, nikotin dan peningkatan TGF-β1 dapat bertindak secara sinergis
untuk menginduksi respons fibrogenik pada fibroblas kornea dan jaringan kornea
berikut cedera kimia.
Ketika jaringan kornea terluka, keratosit kornea mengalami kematian sel
apoptosis yang berdekatan lokasi luka, mengakibatkan aktivasi dan proliferasi

16
keratosit yang tersisa. Mereka kemudian bermigrasi ke situs yang rusak, dan
kemudian mengambil fenotipe perbaikan yang serupa yang khas fibroblas. Saat
penyembuhan luka berlangsung, fibroblas dapat berubah menjadi αSMApositive
myofibroblas, mengakibatkan pengendapan ECM di jaringan kornea yang terluka.
Namun, Aktivasi keratosit dan deposisi ECM yang berlebihan pada kornea yang
terluka berkontribusi pada kornea keburukan yang menghasilkan gangguan
penglihatan (45 ± 47). Hal tersebut menunjukkan bahwa proliferasi fibroblas kornea
meningkat secara signifikan dengan pengobatan dengan nikotin atau cotinine. Ini
Temuan ini konsisten dengan laporan lain mengenai efek nikotin pada
proliferasi jenis sel lainnya, seperti sel stellata hepatik dan sel endotel vena
umbilikalis manusia. Pada konsentrasi yang sama yang digunakan dalam percobaan
in vitro kami. Proliferasi sel-sel ini ditambah dengan luka alkali, dan efeknya
selanjutnya meningkat dengan pengobatan dengan 0,01N NaOH bersama dengan
nikotin atau cotinine.12,13,14
Jumlah kaskade signaling yang dipengaruhi oleh nikotin telah diidentifikasi
pada non-neuronal sel. Meskipun tidak mengkonfirmasi semua jalur pensinyalan
yang terkait dengan nikotin dan / atau cotinine, Hasil penelitian saat ini
menunjukkan bahwa mekanisme kerja nikotin menyebabkan proliferasi fibroblas
kornea dikaitkan dengan jalur pensinyalan PKC dan PI3K. Serupa dengan hasil,
sebuah penelitian baru-baru ini menunjukkan bahwa fibroblast kornea TGF-β1
transdifferentiasi secara signifikan dihambat oleh penghambat spesifik jalur singel
Akt, menunjukkan bahwa pensinyalan PI3K / Akt berada di hilir pensinyalan TGF-
β Smad-independent. Temuan baru yang menarik lainnya selanjutnya mendukung
data: ECM yang diturunkan dari chondrocyte ditunjukkan untuk menekan
neovaskularisasi kornea dan fibrosis yang diinduksi burner alkali dengan
penghambatan NF-κB aktivasi melalui blokade jalur pensinyalan Akt dan PKC.
Trauma okular akibat luka bakar kimiawi bermanifestasi sebagai gejala klinis
yang rumit, seperti cacat epitel kornea, pembentukan parut, angiogenesis, radang
jaringan, dan fibrosis, menyebabkan berkurangnya transparansi kornea dan
kehilangan penglihatan. Di antara gejala tersebut, kornea reepithelialization sangat
penting untukkeberhasilan penyembuhan yang karena mengurangi risiko infeksi

17
terkait dengan peningkatan respon inflamasi dan fibrogenik. Sebuah penelitian
terbaru menunjukkan bahwa peningkatan sinyal PI3K / Akt terlibat dalam
peningkatan signifikan manusia migrasi sel epitel kornea dan penyembuhan luka
goresan kornea. 10,11
Juga eksogen menambahkan penyembuhan luka epitel koroner TGF-β3
melalui pensinyalan Smad dan PI3K / Akt pada tikus diabetes. Selanjutnya,
aktivitas PKC-alpha meningkat selama luka epitel kornea penyembuhan, yang
merangsang perkembangan faktor proliferasi sel epitel kornea yang diinduksi
hepatosit dan migrasi. Oleh karena itu, sangat penting untuk memverifikasi efek
dan hasil yang tepat dari menghambat sinyal PKC dan PI3K / Akt pada kornea yang
terbakar secara kimia yang terkait dengan epitel penyembuhan luka, angiogenesis,
dan fibrosis. Selain itu, meski jalur transduksi serupa diamati mengenai diferensiasi
myofibroblast TGF-β pada pembiakan Sel fibroblast kornea manusia dibandingkan
dengan keratosit kornea manusia normal, perlu untuk menilai efek nikotin atau
cotinine dan jalur pensinyalan terkait di keratosit kornea primer manusia.11,12,13
Singkatnya, hasilnya memberikan bukti yang jelas bahwa efek nikotin yang
kronis berakselerasi terhadap angiognesis kornea dan fibrosis setelah luka alkali.
Efek nikotin itu dimediasi, setidaknya sebagian, oleh sinyal PI3K dan PKC.

18
 DAFTAR PUSTAKA

1. Ejaz S, Insan ud d, Ashraf M, Nawaz M, Lim CW, Kim B. Cigarette smoke

condensate and total particulate matter severely disrupts physiological
angiogenesis. Food Chem Toxicol. 2009; 47:601±614.
https://doi.org/10.1016/j.fct.2008.12.018 PMID: 19138718.
2. John G, Kohse K, Orasche J, Reda A, Schnelle-Kreis J, Zimmermann R, et
al. The composition of cigarette smoke determines inflammatory cell
recruitment to the lung in COPD mouse models. Clin Sci. 2014;
126:207±221. https://doi.org/10.1042/CS20130117 PMID: 23875733.
3. Lu Q, Sakhatskyy P, Grinnell K, Newton J, Ortiz M, Wang Y, et al.
Cigarette smoke causes lung vascular barrier dysfunction via oxidative
stress-mediated inhibition of RhoA and focal adhesion kinase. Am J Physiol
Lung Cell Mol Physiol. 2011; 301:L847±L857.
https://doi.org/10.1152/ajplung.00178.2011 PMID: 21984567.
4. Boor P, Casper S, Celec P, Hurbankova M, Beno M, Heidland A, et al.
Renal, vascular and cardiac fibrosis in rats exposed to passive smoking and
industrial dust fibre amosite. J Cell Mol Med. 2009; 13:4484±4491.
https://doi.org/10.1111/j.1582-4934.2008.00518.x PMID: 19292733.
5. Azzalini L, Ferrer E, Ramalho LN, Moreno M, Dominguez M, Colmenero
J, et al. Cigarette Smoking Exacerbates Nonalcoholic Fatty Liver Disease in
Obese Rats. Hepatology. 2010; 51:1567±1576.
https://doi.org/10.1002/hep.23516 PMID: 20432253.
6. Balansky R, Ganchev G, Iltcheva M, Steele VE, D'Agostini F, De Flora S.
Potent carcinogenicity of cigarette smoke in mice exposed early in life.
Carcinogenesis.2007;28:2236±2243.https://doi.org/10.
1093/carcin/bgm122 PMID: 17522065.
7. Soeda J, Morgan M, McKee C, Mouralidarane A, Lin C, Roskams T, et al.
Nicotine induces fibrogenic changes in human liver via nicotinic
acetylcholine receptors expressed on hepatic stellate cells. Biochem

19
 Biophys Res Commun. 2012; 417:17±22.
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2011.10.151 PMID: 22108052.
8. Snoek SA, Verstege MI, van der Zanden EP, Deeks N, Bulmer DC, Skynner
M, et al. Selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonists worsen
disease in experimental colitis. Br J Pharmacol. 2010; 160:322±333.
https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2010.00699.x PMID: 20423343.
9. Mabley J, Gordon S, Pacher P. Nicotine exerts an anti-inflammatory effect
in a murine model of acute lung injury. Inflammation. 2011; 34:231±237.
https://doi.org/10.1007/s10753-010-9228-x PMID: 20625922.
10. Cardinale A, Nastrucci C, Cesario A, Russo P. Nicotine: specific role in
angiogenesis, proliferation and apoptosis. Crit Rev Toxicol. 2012;
42:68±89.https://doi.org/10.3109/10408444.2011.623150PMID:22050423.
11. Jensen K, Afroze S, Ueno Y, Rahal K, Frenzel A, Sterling M, et al. Chronic
nicotine exposure stimulates biliary growth and fibrosis in normal rats. Dig
Liver Dis. 2013; 45:754±761. https://doi.org/10.1016/j.dld. 2013.02.023
PMID: 23587498.
12. Goette A, Lendeckel U, Kuchenbecker A, Bukowska A, Peters B, Klein HU,
et al. Cigarette smoking induces atrial fibrosis in humans via nicotine. Heart.
2007; 93:1056±1063. https://doi.org/10.1136/hrt. 2005.087171 PMID:
17395670.
13. Pakyari M, Farrokhi A, Maharlooei MK, Ghahary A. Critical Role of
Transforming Growth Factor Beta in Different Phases of Wound Healing.
Adv Wound Care. 2013; 2:215±224. https://doi.org/10.1089/
wound.2012.0406 PMID: 24527344.
14. Finnson KW, McLean S, Di Guglielmo GM, Philip A. Dynamics of
Transforming Growth Factor Beta Signaling in Wound Healing and
Scarring. Adv Wound Care. 2013; 2:195±214. https://doi.org/10.1089/
wound.2013.0429 PMID: 24527343.

20