[ Redsa Gentffice | SCREENING FITOQUIMICO DE FLAVONOIDES EN CLAVO HUASCA (Tynanthus Polyanthus. Sandwith Bureau) DE LA LOCALIDAD DE SAN BERNARDO, TAMBOPATA, MADRE DE DIOS, PERU Lastenia Cutipa Chavez’, Martha Olivera Condori’, Miguel Chavez Pinchi’, Virne Mego Mego’, Jaime Cuse Quispe’, Maria Isabel Puma Camargo’, Janet F. Gonzales Bellido” A. ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL, UNIVERSIDAD NACIONAL AMAZONICA DE MADRE DE DIOS, PUERTO MALDONADO-PERU., B. CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERIA QUIMICA, UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAB DEL CUSCO, CUSCO-PERU. RESUMEN La presente investigacién tuvo como finalidad efectuar la determinacién cualitativa de los metabolitos secundarios de la especie Clavo Huasca (Tynanthus polyanthus (Sandwith) Bureau) de la Localidad de San Bernardo, Tambopata, Madre de Dios, para luego continuar con lamarcha fitoquimica para detectar la presencia del componente aromatico, de uso potencial para la industria alimentaria, que puede ser terpenoide 0 fendlico como los flavonoides. Para la Metodologia, se realizé etapas sucesivas de pruebas donde en primer lugar se realizo la seleccién de la muestra, luego el ensayo de arrastre de vapor para metabolitos terpénicos, después los ensayos preliminares de la muestra fresca; seguido de extraccién en equipo Soxhlet y reflujo con diferentes solventes donde en cada etapa se realizo los ensayos quimicos del metabolito secundario y finalmente se determind la marcha fitoquimica y el solvente adecuado, para concluir identificando el componente aromatico mediante cromatografia de capa fina. Los resultados sugieren que el componente aromatico del Tynanthus polyanthus se presenta en mayor concentracién en raices que en hojas y es un flavonoide evidenciado por cromatografia de capa fina revelado con vapores de amoniaco. Los flavonoides por su actividad de antioxidante, previo estudio toxicolégico, son relevantes para su util'zaci6n como aromatizantes de algunos alimentos procesados. Palabras clave: metabolitos secundarios, screening fitoquimico, clavo huasca, Tynanthus polyanthus, Madre de Dios. ABSTRACT The purpose of the research was to perform the qualitative determination of secondary metabolites of clavo huasca species (7ynanthus polyanthus (Sandwith) Bureau) at San Bemardo community, Tambopata, Madre de Dios, and the phytochemistry detection of the presence of aromatic component with potential use for the food industry, that can be terpenoid or phenolic as the flavonoids. We carried out successive tests where in the first time we tested the selection of the sample, then the vapor dragging trial for terpenoids metabolites, later the preliminary trials of the fresh sample; followed by extraction in Soxhlet equipment and reflux with different solvent where in each phase we tested the chemical trials of the secondary metabolites and finally we determined a phytochemistry run and the adequate solvent to identify the aromatic. component by means of chromatography of thin layer. The results suggest that the aromatic component of the Tynanthus polyanthus species is presented in a greater concentration in roots that in foliage and is a flavonoide shown by the chromatography of thin layer and vapors of ammonia. The flavonoids are characterized by their antioxidant activity. Toxicological studies show the importance of their use as flavors in some food processing. Keywords: Secondary metabolites, phytochemistry screening, clavo huasca, Tynanthus polyanthus, Madre de Dios 8[ Fioctvenited Amertnice \ ERRRAETT 1. INTRODUCCION En el mundo la actividad de extraccién y procesamiento de plantas medicinales, asi como la venta y comercializacién de diversos derivados resulta rentable y sobre todo genera desarrollo, avance cientifico, tecnolégico y nuevos descubrimientos para el tratamiento terapéutico de muchas enfermedades, por lo que es importante investigar e! potencial que cuenta nuestra amazonia en especial Madre de Dios. Es asi que el estudio de las plantas medicinales ha abarcado incluso trabajos de investigacidn realizados por estudiantes de pre- grado (Arroyo, 2009). La presente investigacién tuvo como finalidad efectuar la determinacién cualitativa de los metabolitos secundarios de la especie Clavo Huasca (Tynanthus polyanthus (Sandwith) Bureau) de la localidad de San Bernardo, Tambopata, Madre de Dios, para luego continuar con la marcha fitoquimica para detectar la presencia del componente aromatico, de uso potencial parala industria alimentaria, que puede ser terpenoide o fendlico como los flavonoides. Tynanthus panurensis (Sandwith) Bureau (Bignoniaceae), otra liana como la especie Tynanthus polyanthus es usada en medicina tradicional amaz6nica como un tonico y energizador asi como para el tratamiento de! reumatismo. Estas indicaciones tradicionales llevaron al estudio de sus actividades antiinflamatorias y antioxidantes. Es asi que el andlisis fitoquimico del extracto de corteza de Tynanthus panurensis mostré la presencia de saponinas y una alta concentracién de fenoles y flavonoides (Morales, 2011), de ahi que también sea necesario efectuar un estudio fitoquimico en raiz y hojas de Tynanthus polyanthus para evidencias de algunos de estos compuestos bioactivos. Los metabolitos secundarios son compuestos quimicos organicos complejos de naturaleza heterociclica en muchos casos. Denominados as/ debido a que su importancia para la viabilidad del organismo es secundaria, a diferencia de los gliicidos, proteinas y lipidos. Ellos pueden ser alcaloides, aceites esenciales, sesquiterpeniactonas, glicésidos cardioténicos, fendlicos, saponinas, taninos, etc., los mismos que pueden estar 0 no presentes en un determinado vegetal (Dominguez, 1980) Para la obtencin de metabolitos secundarios se trabajé con las hojas y raices de la especie Tynanthus polyanthus, por ser las partes donde sensorialmente se aprecia mayor aromaticidad, las cuales fueron sometidas a pruebas de extracci6n con diferentes solventes continuando con la respectiva marcha fitoquimica. (Dominguez, 1980). Respecto a la especie de Tynanthus polyanthus no existen referencias bibliograficas de estudios anteriores pero si de la especie Tynanthus panurensis indicando que el componente aromatico es el eugenol que es un fendlico yno esun terpenoide (Taylor, 2003). Los flavonoides, presentes en muchas plantas tanto en hojas como en raiz, pueden tener un efecto alelopatoico cuando estan presentes en los exudados de ralz, como es el caso de algunas plantas invasoras donde suprimen a los hongos mutualistas en el ambiente donde la invasora se establece, no asi en su habitat originario (Callaway, 2008). Asimismo, en Arbutus unedo L., por ejemplo, los extractos acuosos y fracciones fendlicas de la raiz, presentaron moderada actividad antibacteriana contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus, donde el analisis cuantitativo mostré que en las raices estuvieron bastante representadas las antocianinas, seguidos por los flavonoides totales, flavonas y flavonoles (E! Amine Dib, 2011), Los flavonoides, como parte de los exudados de raiz, también pueden favorecer el crecimiento de ciertas bacterias para efectuar el cometabolismo de xenobidticos, aspecto importante para propésitos de fitorremediacién (Técher Didier et al., 2011), Gi( Revicte Gantffice | ‘También se ha demostrado la actividad de algunos flavonoides como es el caso de la baicaleina, derivado de la raiz de Scutellaria baicalensis, una planta usada en medicina tradicional en China, que ha sido usada por cientos de afios, y donde se ha demostrado su actividad antiviral con baja toxicidad (Chen, 2011). 2. MATERIALES Y METODOS La metodologia utilizada para esta investigacién fue a través de la marcha fitoquimica, con la finalidad de determinar los diferentes metabolitos secundarios, para lo cual se trabajo con etapas sucesivas de pruebas donde en primer lugar se realizo la seleccién, donde debe eliminarse materiales como: arena, polvo, tierra, restos vegetales y organismos que pueden acompajiara la muestra. Antes de ser secado el material, se hizo el ensayo de arrastre de vapor para metabolitos terpénicos, luego se procedié al secado con sumo cuidado, en cuartos 0 camaras bien ventiladas. Se continud con el método de reflujo y Soxhlet con solventes de diferente polaridad (hexano, etanol absoluto, hidroalcohdlico, y agua) seguin la Tabla 1. Posteriormente se determiné la marcha fitoquimica (Figura 1) con el propésito de identificar la presencia del componente activo aromatico y determinar el solvente adecuado, procesando extracto, a través de un screening fitoquimico. Una vez identificado el componente aromatico, se realiz6 los ensayos correspondientes para encontrar el procedimiento adecuado de deteccién mediante la cromatografia de capa fina (Abbot y Andrews, 1990), empleando el solvente de extraccién acetato de etilo en la fraccién del extracto hidroalcohdlico y con los solventes de cromatografia de capa fina con butanol: Acido acético: agua (BAW) (4:1:5) (Dominguez, 1980). Tanto para hojas como para raiz se emple6 el mismo procedimiento. MUESTRA “c” RAICE Tynanthus polyanthus Exiracto poo Residuo_ Bue | @) ‘Acetonay e& Extracto Residuo piesa | Etanol y agua _L Residue r Aga Residue Figura 1. Marcha fitoquimica para Tynanthus polyanthus Fuente: Elaboracién propia, 2009 12Brod ealcod Amorcnice \ EZRETE ET Tabla 1: Matriz de Identificacin de metabolitos secundarios meeeellserenes Reactivo | Caracteristicas de la Metabolito | Identificacion Reaccion Fiavonoides, | Shinoda Coloraciones rojzas. Fenolicos, | Clonuroférico | Coloracién verde petroleo Saporinas. | Agitacion| Presencia de espuma, Extracto 1 | Hexano | Taetonas, | Ballet Rojo claro a oscuro. ‘Azucares. | Felhing Rojo ladrio ‘Aicaloides. | Dragendor | Coloraciones naranjas. Flavonoides. | Shinoda Coloraciones rojzas, Fenolicos, | Cloruroférrico | Coloracion verde petraleo ‘Saponinas. | Agitacion Presencia de espuma Extracto2 | Etanol [Taoionas. | Ballet Rojo claro @ oscuro, ‘aucares. | Felhing Rojo lado. ‘Arcaloides. | Dragendort | Coloraciones naranjas. Flavonoides. | Shinoda ‘Coloraciones rojizas. Fenolicos. | Cloruro férrion | Coloracion verde petroleo ‘Saponinas. | Agitacion Presencia de espuma. Extracio S) json 4 acoras. | Bajet Rojo dlaro a oscuro. ‘Aaucares. _ | Felhing. Rojo adil, ‘Arcaloides. | Dragendorff | Coloraciones naranias. Flavonoides. | Shinoda Coloraciones rojizas. Fenolicos. | Cloruro fémico | Coloracion verde petroleo Saponinas. | Agitacion Presencia de espuma. Extracto 4 | ite, Atcoholica [Tactonas, | Bajiet Rojo claro @ oscuro. “Rzucares. | Felhing. Rojo lado, ‘Acaloides. | Dragendorft | Coloraciones naranjas. Flavonoides. | Shinoda Coloraciones rojas. Fenolicos. | Cloruro mice | Coloracion verde petroleo ‘Saparinas. | Agitacion Presencia de espuma: ExractoS | Aqua [Tacionas | Ballet Rojo claro @ oscuro ‘Azucares. | Felhing Rojo lado. ‘Alcaloides. | Dragendorf’ | Coloraciones naranjas: 13[Readeia 3. RESULTADOS Y DISCUSION En los ensayos preliminares se obtuvo como resultado que las raices del Tynanthus polyanthus presentan el componente aromatico en mayor proporcién que en hojas (por determinacién cualitativa y andlisis organoléptico). Al hacer el ensayo de aceites esenciales terpénicos no hubo resultados positivos por lo que se descarté que su aroma tuviese como responsable al metabolitos terpenoides. Los flavonoides por ser fenolicos pueden cambiar de color cuando se tratan con bases 0 con amoniaco, contienen sistemas aromaticos conjugados por lo que muestran bandas de absorcién en las regiones visible y UV, en las plantas estén generalmente en forma de glicosidos, y un aglicon puede encontrarse en varias combinaciones glicosidicas, los fiavonoides se hallan en todas las plantas vasculares , se encuentran en forma combinada o protegidos, los aglicones por ser fenolicos son t6xicos para las células vivas y se aislan de tejidos muertos como cortezas. Debido a que no estan involucrados en el metabolismo primario. su papel principal es biolégico sobre todo en relacién con los insectos. Los cambios en su estructura como la abertura del anillo y reduccién producen compuestos dulces como la hidrochalcona que es 2000 mil veces mas dulce que la sacarosa. Otros presentan coloraciones casi de la gama del arco iris (Valencia, 1995). En los extractos acuoso, etandlico e hidroalcohdlico se evidencié la presencia del metabolito secundario flavonoide, verificado a través de la prueba de Shinoda para flavonoides la cual fue positiva (+++) presentando una ligera coloracién rojiza (Tabla 2). La prueba de Fehling dio positivo para los mismos extractos donde se presenté el flavonoide, por lo que se asume que este metabolito se presentaria como un glucésido de flavonoide que es la forma comin en la que se presenta en las plantas. Tabla 2. Resultados de determinacién de metabolitos secundarios de la raiz de Tynanthus polyanthus. za 8 8. |) #2) 9 3 zo 7 Ge 2/85) 4 g|2]z | 8 | 3 | #8 | 3 8 5 3 e}gg|a 8 58 16 | Ee _ Sess z3 2c | +++ | +44 = ae f ac ee _ +H ihe > 4c | + + - a] 5c. | a a . $4 |4 Fuente: Elaboracién propia, 2009{ Biodiversidad Amazénica | En cuanto a la cromatografia de capa fina se hizo una serie de ensayos con diferentes sistemas de solventes siguiendo el orden de polaridad para observar la separacién de componentes del flavonoide del extracto etandlico, hidroalcohdlico y acuoso, encontrandose que el BAW (4:1:5) es el que separa los componentes en todos los extractos utilizados. La placa se visualiz6 con luz UV de A 254 nm, hallandose que, en muestra de raices, sin revelado con vapores de amoniaco la coloracién fue verde fosforescente color, que se intensificé al revelarla con vapores de amonfaco. Para muestra de hojas, la placa, visualizada con luz UV de A254 nm, sin revelado con vapores de amoniaco (Figura 2), fue de color verde fosforescente de intensidad menor a la observada en raices, la cual al ser revelada con vapores de amoniaco presento coloracion purpura fosforescente, lo que sugiere la presencia, en hojas, de los flanovonoides chalconas y auronas (Lack Olga, 1998) como se observa en la Figura 3. Figura 2. Cromatografia de capa fina de extractos de hojas y raices de Tynanthus polyanthus visualizada sin revelado con vapores de amoniaco Fuente: Elaboracion propia, 2009 Figura 3. Cromatografia de capa fina de extractos de hojas y raices de Tynanthus polyanthus, visualizada con revelado con vapores de amoniaco. Fuente: Elaboracién propia, 2009 Flavonoides en la forma de isoflavonoides poseen actividad toxica sobre los peces insectos como los rotenoides, usados desde hace mucho como insecticidas y utiles al hombre por su baja toxicidad (Arvigo, 2000). 15[Katka Genifice | EQ 4, CONCLUSIONES En los ensayos preliminares se caracterizo que en las raices del Tynanthus polyanthus el componente aromatico estaria en mayor proporcién que en hojas. EI componente aromatico del clavo huasca no seria aceite esencial, y/o terpenoides sino flavovonoide, evidenciado por la prueba de Shinoda, por lo que se descartaria que su aroma corresponda a un terpenoide. Elsolvente elegido en la marcha fitoquimica son etanol y el hidroalcohdlico observandose que existe la presencia del metabolito secundario de flavonoide verificado a través de la prueba de Shinoda para flavonoides que es positiva (+++) presentando una ligera coloracién rojiza. Los flavonoides por su actividad de antioxidante son relevantes para su utilizacién previo estudio toxicolégico como aromatizante de algunos alimentos procesados. Mediante cromatografia de capa fina se confirmé la presencia de flavonoides en los _extracto etandlico, hidroalcohdlico y acuoso, tanto en raices como en hojas de Tynanthus polyanthus, siendo el BAW el mejor sistema de solventes para separar los flavonoides. Ello se detallé con el revelado de la placa cromatogréfica con vapores de amoniaco observandose la presencia de color purpura fosforescente en la muestra de hojas lo que sugiere contenido de chalconas y auronas. 5. AGRADECIMIENTOS Al Bidlogo Hugo Duefias Linares por haber realizado la identificacién de las especies de clavo huasca y Sufer Marcial B4ez Quispe Edwin Jurado Rojas y Romel Fernandez Quispe por su apoyo en la recoleccién de la muestra de las lianas de clavo huasca. 6. REFERENCIABIBLIOGRAFICA Abbot David y Andrews R.S. Introducci6n ala cromatografia. Ed. 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