HASIL DAN PEMBAHASAN
Transformasi
Purifikasi dan Pengujian Produk PCR
(Stilbena Sintase)
Purifikasi ini menggunakan high
pure plasmid isolation kit dari Invitrogen.
Percobaan dilakukan sesuai dengan prosedur
yang terdapat dalam metode. Purifikasi
bertujuan memurnikan produk PCR yang
diperoleh dari pengotor yang mungkin ada
pada produk PCR. Hasil purifikasi kemudian
diuji dengan elektroforesis gel agarosa.
Hasil elektroforesis menunjukkan
adanya satu fragmen hasil purifikasi.
Fragmen tersebut berukuran sekitar 1500 bp
dan fragmen ini diperkirakan merupakan gen
stilbena sintase yang diinginkan (Gambar 4).
Pengujian dengan elektroforesis gel agarosa
dilakukan untuk mengetahui kualitas dan
kuantitas gen stilbena sintase yang akan
diligasi dengan vektor pGEM-T Easy. Hasil
purifikasi ini selanjutnya dimasukkan ke
dalam vektor pengklonan pGEM-T Easy
5000 bp
1500 bp
1000 bp
M
Gambar 4 Hasil purifikasi gen stilbena
sintase, M= marker, fragmen
berukuran 1500 bp = Gen
stilbena sintase.
Kloning Gen Stilbena Sintase ke dalam
Vektor pGEM-T Easy
Tahapan kloning terdiri atas ligasi,
transformasi dan seleksi. Ligasi dilakukan
dengan menggabungkan fregmen gen
stilbena sintase, plasmid pGEM-T Easy
sebagai vektor, buffer dan T4 DNA ligase.
Produk ligasi kemudian ditransformasikan
ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue
kompeten. Produk ligasi pada tahap ini
adalah stilbena sintase yang sudah disisipkan
pada vektor pGEM-T Easy.
Transformasi ke Escherichia coli
dilakukan untuk memperbanyak DNA
plasmid rekombinan.
dilakukan menggunakan metode heat shock
yaitu dengan pemberian kejut panas pada
suhu 42 oC selama 50 detik. Prinsip dari
proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu
dari 0 oC ke 42 oC terhadap sel yang telah
diberi perlakuan CaCl2. Perlakuan CaCl2 ini
dilakukan dalam pembuatan sel kompeten.
Garam CaCl2 akan mempengaruhi porositas
membran sel sehingga pada saat terjadi
lonjakan suhu membran menjadi tidak
selektif terhadap molekul asing dan produk
ligasi dapat masuk ke dalam sel. Sel
kemudian dikultur dalam media tumbuh LB
dengan penambahan glukosa selama 1.5 jam
untuk memperbanyak jumlah sel dan
memberi kesempatan kepada sel untuk
mengekspresikan marka seleksi dari plasmid
yang dibawanya. Setelah itu sel disebar pada
media seleksi LA, IPTG, dan X-Gal
kemudian diinkubasi selama 16 jam pada
suhu 37 o C. Penambahan IPTG dalam
media seleksi berfungsi sebagai penginduksi
ekspresi gen sedangkan X-Gal berfungsi
sebagai substrat.
Hasil transformasi ke Escherichia
coli menunjukkan terbentuknya koloni putih
dan biru (Gambar 5). Koloni putih
merupakan koloni yang diperkirakan
mengandung fragmen gen sisipan (gen
stilbena sintase) sedangkan koloni biru
diperkirakan merupakan koloni yang tidak
mengandung fragmen gen sisipan.
Terbentuknya koloni putih biru ini
disebabkan adanya marka seleksi pada
vektor pGEM-T Easy. Marka seleksi
biasanya berupa gen yang membawa sifat
resistensi terhadap antibiotik tertentu.
Vektor pGEM-T Easy memiliki marka
seleksi berupa gen resistensi ampisilin dan
marka seleksi tambahan berupa gen Lac Z.
Gen pembawa sifat resistensi terhadap
ampisilin ini menyandi enzim -Laktamase.
Enzim -Laktamase akan mendegradasi
ampisilin sehingga ketika sel pembawa
plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam
media yang mengandung ampisilin, maka
sel tersebut akan tumbuh sementara sel yang
tidak membawa plasmid rekombinan akan
mati. Gen Lac Z menyandi enzim -
Galaktosidase. Enzim ini akan
menghidrolisis X-Gal yang ditambahkan
pada media seleksi menjadi galaktosida dan
senyawa turunannya yaitu 5-bromo-4-kloro
indoksil yang berwarna biru. Ketika terdapat
fragmen gen sisipan pada plasmid maka
sintesis -peptida yang berperan sebagai
aktivator terhadap kerja enzim -
Galaktosidase akan terhambat sehingga
warna biru tidak terbentuk.

1 2
Gambar 5 Koloni biru putih
hasiltransformasi pGEM-T Easy ke
Escherichia coli. Nomor 1 adalah
koloni putih dan nomor 2 adalah
koloni biru.
.
Seleksi transforman melalui
pengamatan warna koloni yang terbentuk
tidak selalu sesuai dengan teori. Artinya
bahwa tidak semua koloni berwarna putih
pasti membawa fragmen gen sisipan dan
sebaliknya belum tentu semua koloni
berwarna biru merupakan koloni yang tidak
membawa fragmen gen sisipan. Hal tersebut
dapat disebabkan oleh karakteristik dari
fragmen gen hasil PCR yang diklon ke
dalam pGEM-T Easy. Sebagai contoh,
koloni biru dapat dihasilkan dari produk
PCR yang diklon pada frame yang sama
dengan gen LacZ. Produk PCR tersebut
biasanya memiliki tiga basa sama yang
berulang pada beberapa bagian fragmen,
termasuk memiliki basa adenin yang
berulang pada bagian ujungnya (Promega
1999). Produk PCR yang demikian tidak
memiliki kodon stop pada bagian
fragmennya sehingga akan ditranslasi
bersamaan dengan gen LacZ dan
menghasilkan koloni berwarna biru
Koloni sel yang terbentuk pada
media seleksi selanjutnya diambil 6 koloni
untuk diamplifikasi dengan teknik PCR
koloni dan dikonfirmasi dengan
elektroforesis gel agarosa 1% dengan voltase
100 volt. Tujuan utama dari PCR koloni
adalah untuk mengkonfirmasi koloni
transforman yang membawa fragmen gen
sisipan dan menghindari kesalahan dari
pengamatan warna koloni.
PCR koloni diawali dengan pemilihan
koloni terpisah yang tumbuh pada media
seleksi. Koloni-koloni tersebut diberi nomor
terlebih dahulu kemudian dengan tusuk gigi
steril, koloni tersebut diduplikat pada media
seleksi yang telah dibagi menjadi beberapa
wilayah dan digunakan sebagai cetakan pada
proses PCR.
Elektroforegram (Gambar 6)
menunjukkan terdapat dua klon transforman
yang berhasil diinsersi yaitu koloni nomor 5
dan nomor 6. Keberhasilan dalam proses
PCR koloni dapat diamati dari ukuran klon
transforman. Gambar 6 Menunjukkan bahwa
fragmen mengalami penambahan ukuran
sekitar 200 bp sehingga ukurannya menjadi
1700 bp. Penambahan ukuran ini mungkin
terjadi karena terdapat sekuen promotor dari
vektor yang menempel pada gen target.
Koloni positif selanjutnya dikultur
pada media LB yang ditambah ampisilin.
Selanjutnya, dilakukan isolasi plasmid dari
setiap kultur menggunakan high pure
plasmid isolation kit dari Roche.
5000 bp
1700 bp
1000 bp
1 2 3 4 5 6 M
Gambar 6 Hasil PCR koloni gen STS.
Nomor 1-6 nomor koloni yang
digunakan sebagai cetakan, M=
Marker.
Urutan Nukleotida Gen Stilbena Sintase
Fragmen DNA plasmid hasil klon
tersebut kemudian dimurnikan dan dikirim
ke lembaga Eijkman Jakarta untuk
ditentukan urutan nukleotidanya. Data hasil
sekuensing yang berupa urutan basa
selanjutnya diproses menggunakan program
bioedit. Melalui program bioedit, urutan
basa yang diperoleh disejajarkan baik
forward maupun revers dan selanjutnya
dianalisis dengan program BLASTX pada
web. www.ncbi.nlm.nih.gov untuk
membandingkan sekuen nukleotida yang
ditranslasikan pada seluruh open reding
frame (ORF) dengan sekuen protein dalam
database ( Claverie dan Notredam 2003).
Hasil analisis dengan program
BLASTX dinyatakan dengan besarnya nilai
scorebits dan E value. Nilai E value dan
scorebits menunjukkan tingkat homologi
gen yang dianalisis dengan protein yang
bersesuaian pada database. Homologi yang
tinggi ditunjukkan dengan nilai score bits
yang semakin besar (>150) dan E value yang
kecil (<10-4). Nilai score bits ditunjukkan
oleh warna hasil analisis BLASTX yaitu
warna hitam, biru, hijau, merah muda dan
merah. Warna hitam menunjukkan nilai
score bits kurang dari 40, warna biru
menunjukkan nilai score bits antara 40
sampai dengan 50, warna hijau
menunjukkan nilai score bits 50 sampai
dengan 80, warna merah muda menunjukkan
nilai score bits 80 sampai dengan 200, dan
warna merah menunjukkan nilai score bits
lebih besar sama dengan 200. Semakin besar
nilai score bits maka semakin tinggi tingkat
homologi gen yang diperoleh dengan protein
lain yang bersesuaian pada database. Hasil
analisis fragmen gen stilbena sintase dengan
program BLASTX menunjukkan
terbentuknya warna merah (Lampiran 6)
dengan nilai score bits lebih besar dari 150
dan E value lebih kecil dari 10-4 (Tabel 1).
Hasil ini menunjukkan bahwa fragmen gen
stilbena sintase yang dianalisis memiliki
tingkat homologi yang tinggi dengan protein
lain yang bersesuaian pada database. Hasil
ini memberikan keyakinan bahwa fragmen
yang terbentuk dari hasil PCR adalah gen
stilbena sintase.
Tabel 1 Hasil analisis BLASTX fragmen
gen stilbena sintase
Protein yang Score E
bersesuaian (Bits) Value
hypothetical protein 286 3e-76
[Vitis vinifera]
Stilbene synthase 286 3e-76
[Vitis riparia]
resveratrol synthase 286 3e-76
[Vitis vinifera]
Stilbene synthase 286 3e-76
[Vitis vinifera]
*hanya ditampilkan sebagian,secara lebih lengkap dapat
dilihat pada lampiran 6.
Kloning Gen Stilbena Sintase ke dalam
Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
Sebelum gen stilbena sintase (STS)
diligasi dengan vektor ekspresi pCAMBIA
1303, gen stilbena sintase yang terdapat
didalam pGEM-T Easy dipotong terlebih
dahulu dengan enzim restriksi Spe1 dan
Nco1. Pemotongan ini dilakukan pada suhu
37oC selama 4 jam. Tujuan pemotongan ini
adalah memisahkan fragmen gen stilbena
sintase (STS) dengan vektor pengklonan
pGEM-T Easy sehingga STS bisa diligasi
dengan vektor ekspresi pCAMBIA 1303.
Hasil pemotongan pGEM-T Easy dan STS
ditunjukkan pada gambar 7.
Gambar 7 menunjukkan bahwa
hasil pemotongani pGEM-T Easy dan
stilbena sintase dengan enzim restriksi Spe1
dan Nco1 menghasilkan 2 fragmen dengan
ukuran sekitar 3000 bp dan 1500 bp.
Fragmen berukuran 3000 bp diperkirakan
merupakan fragmen pGEM-T Easy
sementara fragmen berukuran 1500 bp
merupakan fragmen gen stilbena sintase
(STS). Hasil ini menunjukkan bahwa
fragmen gen stilbena sintase telah berhasil
dipisahkan dengan vektor pengklonan
pGEM-T Easy. Fragmen berukuran 1500 bp
selanjutnya dipotong dari gel menggunakan
pisau skalpel dan dipurifikasi. Selanjutnya,
fragmen gen stilbena sintase diligasi dengan
vektor ekspressi pCAMBIA 1303.
5000 bp
3000 bp
1000 bp 1500 bp
M
Gambar 7 Hasil pemotongan pGEM-T Easy
dan gen stilbena sintase (STS)
dengan enzim restriksi Spe 1 dan
Nco1, M= Marker, fragmen
berukuran 3000 bp = Plasmid
pGEM-T Easy, fragmen berukuran
1500 bp= Gen stilbena sintase.
 Gen stilbena sintase disisipkan pada
vektor ekspresi pCAMBIA 1303 pada
tempat pemotongan enzim restriksi NcoI dan
Spe1 sehingga untuk mencapai tujuan
tersebut vektor pCAMBIA 1303 dipotong
terlebih dahulu dengan enzim restriksi NcoI
dan Spe1. Hasil pemotongan vektor
pCAMBIA 1303 menunjukkan terbentuknya
fragmen berukuran sekitar 12000 bp
(Gambar 8). Fragmen tersebut kemudian
diisolasi dari gel dan dipurifikasi, sehingga
didapatkan plasmid pCAMBIA 1303 yang
siap diligasi dengan gen STS. Pemotongan
dengan enzim restriksi ini dilakukan pada
suhu 37 °C selama 1 jam. Seluruh volume
reaksi kemudian dielektroforesis pada gel
agarosa 1%.
Setelah itu, dilakukan Ligasi antara
pCAMBIA 1303 dan stilbena sintase. Ligasi
dilakukan dengan mencampur plasmid
pCAMBIA 1303, DNA sisipan (stilbena
sintase), buffer dan T4 DNA ligase. Ligasi
dilakukan menggunakan T4 ligase dan
buffer ligase dari Promega. Penggunaan
enzim T4 DNA ligase pada proses ini untuk
mengatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara ujung 5’ fosfat dan 3’
hidroksil dari nukleotida yang berdekatan.
Penambahan enzim T4 DNA ligase ini
mampu membentuk kompleks enzim AMP
yang selanjutnya terikat pada nick (daerah
putus).
12000 bp
1000 bp
M
Gambar 8 Hasil pemotongan pCAMBIA
1303, M=Marker, fragmen
berukuran 12000= Plasmid
pCAMBIA 1303.
Hasil ligasi stilbena sintase dan
pCAMBIA 1303 selanjutnya
ditransformasikan ke bakteri Escherichia
coli XL1-Blue untuk memperbanyak DNA
plasmid rekombinan. Transformasi
dilakukan menggunakan metode Heat shock
yaitu dengan pemberian kejut panas pada
suhu 42 oC selama 50 detik. Prinsip dari
metode ini adalah adanya lonjakan suhu dari
0 oC ke 42 oC terhadap sel yang telah diberi
perlakuan CaCl2. Garam CaCl2 akan
mempengaruhi porositas dari membran sel
sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu
membran menjadi tidak selektif terhadap
molekul asing dan produk ligasi dapat
masuk ke dalam sel.
Hasil transformasi selanjutnya
diseleksi dalam media Luria bertani agar
yang mengandung kanamisin 25 mg/L.
Hasil seleksi menunjukkan Terbentuknya
beberapa koloni putih (Gambar 9). Koloni
tersebut diperkirakan merupakan koloni
Escherichia coli yang mengandung plasmid
rekombinan. Escherichia coli yang tidak
mengandung plasmid rekombinan tidak akan
tumbuh dalam media seleksi karena tidak
membawa gen yang mampu mendegradasi
kanamisin.
Koloni tersebut kemudian
ditumbuhkan dalam media LB yang
mengandung kanamisin dengan konsentrasi
25 mg/L. Plasmid rekombinan dalam E. coli
yang telah dikultur selanjutnya diisolasi.
Isolasi DNA plasmid ini menggunakan kit
dari Qiagen.
K
Gambar 9 Hasil transformasi pCAMBIA
1303-stilbena sintase ke
Escherichia coli XL-1 Blue, K=
Koloni yang mengandung plasid
rekombinan.
 Hasil isolasi plasmid dianalisis
dengan menggunakan elektroforesis gel
agarosa. Hasil elektroforesis menunjukkan
terbentuknya plasmid berukuran sekitar
13500 (Gambar 10). Plasmid ini
diperkirakan merupakan plasmid pCAMBIA
1303 yang telah mengandung fragmen gen
stilbena sintase.
Plasmid yang telah diisolasi
selanjutnya dipotong dengan enzim restriksi
spe1 dan Nco1. Pemotongan ini dilakukan
untuk memastikan bahwa sel yang tumbuh
pada media seleksi adalah sel E. coli XL1-
Blue yang membawa plasmid yang telah
tersisipi gen stilbena sintase. Hasil
pemotongan plasmid rekombinan
pCAMBIA 1303-stilbena sintase dengan
enzim restriksi Spe1 dan Nco1
menunjukkan terbentuknya dua fragmen
masing-masing berukuran sekitar 12000 bp
dan 1500 bp (Gambar 11). Fragmen
berukuran 12000 bp diperkirakan
merupakan plasmid pCAMBIA 1303
sedangkan fragmen berukuran 1500 bp
diperkirakan merupakan fragmen gen
stilbena sintase . Adanya dua pita dengan
ukuran 12000 bp dan 1500 bp ini
menunjukkan bahwa gen stilbena sintase
telah berhasil dikonstruksi dengan vektor
ekspresi pCAMBIA 1303.
13500 bp
12000 bp
M seperti pada habitat aslinya yaitu tanah yang
Gambar 10 Gen stilbena sintase yang sudah
terklon dalam pCAMBIA 1303,
M=Marker, fragmen ukuran
13500= Gen stilbena sintase yang
terklon dalam pCAMBIA 1303.
12000 bp
1000 bp 1500 bp
M
Gambar 11 Hasil pemotongan pCAMBIA
1303- stilbena sintase dengan
enzim restriksi Spe1 dan Nco1,
M=Marker, fragmen berukuran
12000 bp= Plasmid pCAMBIA
1303, fragmen berukuran 1500 bp
= Gen stilbena sintase.
Transformasi pCAMBIA 1303-Stilbena
Sintase ke dalam Agrobacterium
tumefaciens.
Transformasi pCAMBIA 1303-
stilbena sintase ke dalam Agrobacterium
tumefaciens menggunakan metode heat
shock. Prinsip metode ini adalah terjadi
lonjakan suhu dari 0 oC ke suhu -20 oC
terhadap sel yang telah diberi perlakuan
CaCl2. Garam CaCl2 akan mempengaruhi
struktur dan muatan dari membran sel
sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu
membran menjadi tidak selektif terhadap
molekul asing dan produk ligasi dapat
masuk ke dalam sel .
Setelah sel kompeten AGL-0
dicampur dengan plasmid pCAMBIA 1303-
STS, campuran selanjutnya disebar ke media
seleksi LA yang dicampur kanamisin dan
rifamfisin kemudian diinkubasi dalam
keadaan gelap. Inkubasi dalam keadaan
gelap dilakukan karena Agrobacterium
tumefaciens sensitif terhadap cahaya. Selain
itu, inkubasi dalam keadaan gelap dilakukan
untuk mengkondisikan Agrobacterium
gelap.
Hasil seleksi DNA rekombinan
pada media sleksi menunjukkan
terbentuknya koloni berwarna putih
(Gambar 12). Koloni yang terbentuk
merupakan koloni yang mengandung
plasmid rekombinan yaitu koloni yang
mengandung DNA rekombinan pCAMBIA
1303-stilbena sintase. Jumlah koloni yang
tumbuh di media seleksi saat transformasi ke
Agrobacterium tumefaciens lebih sedikit
dibandingkan dengan jumlah koloni saat
transformasi ke Escherichia coli. Hal ini
terjadi karena Agrobacterium tumefaciens
memiliki jumlah salinan yang lebih sedikit
dibandingkan dengan Escherichia coli.
Agrobacterium tumefaciens yang digunakan
pada penelitian ini adalah Agrobacterium
galur AGL-0. Agrobacterium galur AGL-0
digunakan karena memiliki virulensi yang
lebih tinggi dibandingkan galur
Agrobacterium lainnya.
Agrobacterium tumefaciens
merupakan bakteri tanah yang secara genetik
dapat mentransfer gen ke tanaman. Bakteri
ini secara alami mampu menginfeksi
tanaman dan menyebabkan timbulnya tumor
akibat dari transfer fragmen DNA (T-DNA)
dari plasmid Ti (tumor-inducing) bakteri ke
sel tanaman. Sifat unik ini memungkinkan
plasmid Ti menjadi alat pemindah gen-gen
antar spesies yang berbeda, yaitu dengan
menyisipkan gen asing pada T-DNA (
Shepherd 1997).
Plasmid Ti ditemukan pada
semua strain A. tumefaciens virulen,
berukuran sekitar 200 kb dan stabil
dalam Agrobacterium pada
temperatur di bawah 30 °C. Selama
pembentukan tumor urutan tertentu
plasmid Ti T-DNA ditransfer ke sel
tanaman dan berintegrasi ke genom
inti sel tanaman (Tzfira & Citovsky
2002). Plasmid Ti membawa banyak
gen yang terlibat dalam proses
infeksi, sebagian dari sekuennya
berintegrasi ke DNA kromosom
tanaman.
K fragmen berukuran 1500 bp merupakan
Gambar 12 Hasil transformasi pCAMBIA
1303-STS ke Agrobacterium, K=
Koloni yang tumbuh.
Agrobacterium tumefaciens
memiliki tiga komponen genetik yang
digunakan untuk menginfeksi tanaman.
Komponen yang pertama adalah komponen
T-DNA, yaitu fragmen yang ditransfer ke sel
tanaman. T-DNA terletak di plasmid Ti pada
Agrobacterium. Komponen kedua adalah
virulance (vir) region . Gen vir dibagi
menjadi tujuh macam, yaitu vir A, vir B, vir
C, vir D, vir E, vir F, dan vir G (Brown
1997). Gen-gen vir mensintesis protein
virulance (vir). Peranan protein vir adalah
menginduksi terjadinya transfer T-DNA dan
mengintegrasikan T-DNA ke tanaman. Gen
vir akan berekspresi jika terdapat inducer,
antara lain monosiklik fenolik seperti
asetosiringon dan monosakarida seperti
glukosa dan galaktosa. Selain inducer,
kondisi pH juga mempengaruhi gen vir, pH
yang digunakan adalah 5-5.8. Senyawa
fenolik dan monosakarida terbentuk saat
tanaman dikotil mengalami luka dengan
mengeluarkan getah dan proses ini jarang
terjadi pada tanaman monokotil sehingga
untuk transformasi tanaman monokotil perlu
penyesuaian kondisi infeksi. Penyesuaian
kondisi dapat dilakukan dengan
menambahkan fenolik, menambahkan
monosakarida, dan pengaturan pH (Sheng &
Citovsky 1996). Komponen yang ketiga
adalah gen cromosomal virulance (chv). Gen
chv terletak di kromosom Agrobacterium.
Gen ini berfungsi dalam pelekatan bakteri ke
dalam sel tanaman dengan membentuk
senyawa protein -1,2-glukan (Sheng &
Citovsky 1996).
Penggunaan Agrobacterium
tumefaciens dalam transformasi tanaman
lebih menguntungkan dibandingkan dengan
metode lain. Beberapa keuntungannya antara
lain Agrobacterium tumefaciens bersifat
lebih stabil dan tanaman transgenik bersifat
fertil (Arencibia et a. 1998).
SIMPULAN DAN SARAN
Hasil penelitian menunjukkan
bahwa gen stilbena sintase sudah berhasil
terklon ke dalam vektor ekspresi pCAMBIA
1303. Hal ini dibuktikan dengan restriksi
menggunakan enzim Spe1 dan Nco1
menghasilkan dua fragmen berukuran 12000
bp dan 1500 bp. Fragmen berukuran 12000
merupakan pCAMBIA 1303 sedangkan
fragmen gen stilbena sintase. DNA
rekombinan pCAMBIA 1303-stilbena
sintase telah berhasil ditransformasi ke
Agrobacterium tumefaciens strain AGL-0.