INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

GRUPO : 5QM2 SECCIÓN: 3

ALUMNO: MARTHA CELIA SILVA VILLANUEVA

PROFESOR :ROSA MARTHA CABRERA MARTINEZ

Práctica

SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS DE JUGO DE

FRUTOS POR CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA

20/02/18
 OBJETIVOS
 Separar los aminoácidos presentes en jugo de frutos por cromatografía bidimensional en capa
fina.
 Identificar los aminoácidos separados por comparación de sus valores de Rf con los de
soluciones tipo de aminoácidos.
 Comparar el grado de resolución de la cromatografía bidimensional, con el de la unidimensional.

FUNDAMENTO DE LA CROMATOGRAFIA
BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA
La cromatografía en capa fina es un caso de cromatografía de reparto en la que los componentes de
una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos
del sistema cromatográfico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase móvil o eluyente
(disolvente B).
La placa seca se sumerge en un pequeño volumen de fase móvil (mezcla de solventes). La polaridad
de la mezcla de solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se desea separar.
Como sólo la base de la placa queda sumergida, el solvente comienza a mojar la fase estacionaria y
asciende por capilaridad. Al recorrer la placa la fase móvil va arrastrando a las sustancias apolares y
aquellas más polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separación.Es una técnica
simple en cuanto al equipamiento necesario y de fácil desarrollo. El parámetro experimental asociado
a la técnica es el Rf (factor de retención), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto entre
la fase estacionaria y fase móvil, y que depende de su estructura química y su polarida. 1

La cromatografía bidimensional es una variante de considerable poder de separación, ya que se

emplean dos diferentes solventes aplicados secuencialmente para desplazar a un solo compuesto.
La gota del compuesto (generalmente un ácido o un péptido) se revela con una mancha en papel,
Las mezclas de aminoácidos pueden separarse en placas de capa fina de gel de sílica,empleando
como fase móvil butanol:agua:ácido acético (4:1:1). Las manchas de los aminoácidos pueden
detectarse sobre la placa desarrollada, si después de secarla se revela con una solución de
ninhidrina.Los aminoácidos aparecen como manchas púrpura sobre un fondo ligeramente
amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina)
genera una mancha de color amarillo obscuro.2
el material usado como revelador es usualmente la ninhidrina.2

La cromatografia de capa fina presenta una serie de ventajas respecto a cromatografías alternativas,
como es la de papel, tales como las siguientes:
a) Una mayor resolución, obteniéndose por lo general manchas más pequeñas.
b) Una mayor velocidad de separación.
c) Pueden utilizarse un gran número de materiales como soportes y disolventes.
d) Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperación es muy simple. 1
 Datos experimentales
Cálculo del valor de Rf
𝐹𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑜 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑅𝑓 =
𝐹𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑜 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

Tabla 1.Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las dos fases móviles.

1a fase móvil 2a fase móvil

Aminoácidos
Frente del Frente de Rf Frente del Frente del Rf
soluto disolvente soluto disolvente
Argininina 2.8 8 0.35 1.5 8.2 0.18
Lisina 3.8 8 0.48 1.1 8.2 0.13
Prolina 5.4 8 0.67 2.1 8.2 0.25
Glicina 6.3 8 0.78 2.2 8.2 0.26
Histidina 7.2 8 0.90 1.3 8.2 0.15
Glutámico 7.2 8 0.90 3.3 8.2 0.40
Treonina 7.2 8 0.90 3.2 8.2 0.39
Tirosina 7.4 8 0.92 5.3 8.2 0.64
Metionina 7.5 8 0.93 5.0 8.2 0.60
Fenilalanina 7.8 8 0.97 5.6 8.2 0.68

Tabla 2 .Cromatografía bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases móviles.

1a fase móvil 2a fase móvil

No.de Frente del Frente de Rf Frente del Frente del Rf Aminoácido

mancha soluto disolvente soluto disolvente correspondiente
(orden
(cm) (cm) creciente ) (cm) (cm)
(cm)

1 2.4 8.8 0.27 1.4 8.5 0.16 -

2 2.9 8.8 0.32 1.1 8.5 0.12 Arginina

3 5.1 8.8 0.57 2.5 8.5 0.29 -

4 5.9 8.8 0.67 2.1 8.5 0.24 Prolina

5 6.8 8.8 0.77 2.9 8.5 0.34 Glicina

6 6.8 8.8 0.79 1.2 8.5 0.14 -

7 7.2 8.8 0.81 5.0 8.5 0.58 -

8 7.3 8.8 0.82 2.0 8.5 0.23 -

9 7.5 8.8 0.85 4.2 8.5 0.49 Glutámico

10 8 8.8 0.90 5.4 8.5 0.63 Tirosina

Tabla 3. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las 2 fases móviles.

1° fase móvil 2° fase móvil

N° de Frente del Frente del Rf (Orden Frente del Frente del Aminoácido
mancha soluto disolvente creciente) soluto disolvente Rf correspondiente

1 2.1 8.1 0.25 5.8 8.0 0.72 -

2 3.4 8.1 0.41 1.0 8.0 0.125 -

3 4.4 8.1 0.54 2.9 8.0 0.36 -

4 4.4 8.1 0.54 2.9 8.0 0.36 -

5 4.8 8.1 0.59 3.8 8.0 0.47 -

6 5.5 8.1 0.67 2.4 8.0 0.30 Prolina

7 6.3 8.1 0.77 2.9 8.0 0.36 Glicina

8 6.7 8.1 0.82 2.2 8.0 0.27 -

9 7.1 8.1 0.87 4.3 8.0 0.53 Glutámico

10 7.1 8.1 0.87 5.3 8.0 0.66 -

11 7.5 8.1 0.92 5.5 8.0 0.68 Tirosina

Cromatogramas

Fig.1 Cromatograma unidimensional desarrollado con la

Fig. 2 Cromatograma unidimensional desarrollado con la
fase móvil de cloroformo-metanol-amoníaco 17%
fase móvil de Butanol-Ác. Acético-agua (3:1:1).
(2:2:1).
Fig3.Cromatograma bidimensional tipo. Fig. 4 Cromatograma bidimensional problema.

CUESTIONARIO

1.Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo empleado como problema.
Tabla4.Aminoácidos que contiene el juego de jitomate.3

Nutriente Cantidad Nutriente Cantidad

Ácido glutámico 270 mg. Metionina 5 mg.
Ácido aspártico 101 mg. Prolina 14 mg.
Alanina 20 mg Serina 22 mg
Arginina 14 mg. Tirosina 10 mg.
Cistina 1 mg Treonina 19 mg.
Fenilalanina 19 mg. Triptofano 4 mg
Glicina 14 mg. Valina 19 mg.
Histidina 11 mg. Lisina 23 mg
Isoleucina 19 mg.
2.Escriba la reacción completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminoácido.

3.¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Explique su respuesta.

Si es posible, pero está sujeto a un incremento en la polaridad conforme se aplican las fases móviles, debido a que el
movimiento del soluto está sujeto a interacciones con la fase móvil, al aumentar la polaridad de la fase móvil en una fase
estacionaria polar, disminuye el coeficiente de reparto, por lo que se recomienda conocer la polaridad del soluto para
aprovechar eficientemente el espacio bidimensional de la placa cromatográfica, lo cual a su vez proporcionaría una
mejor resolución.

4.Indique las posibles fuentes de error de esta técnica.

 Manipular las placas de sílica sin guantes.

 Olvidar exponer las placas a los vapores de amoniaco para neutralizar o exceder el tiempo de exposición a los
vapores. Al marcar las líneas de aplicación del compuesto con bolígrafo.
 Exceder el tamaño de la aplicación en la placa.
 Una mala proporción de los solventes.
 El colocar mal la placa en la cámara o colocarla al revés.
 Desprender la sílica de la placa de aluminio al colocar las aplicaciones de los solutos.
 Que las cámaras no se saturen con el disolvente empleado.

4.En que consiste la cromatografía de fase inversa.

La cromatografía de fase inversa es una forma de cromatografía de partición líquido- liquido en la que el carácter polar
de las fases está invertido respecto de la cromatografía en papel. La fase estacionaria presenta un líquido no polar
inmovilizado sobre un sólido relativamente inerte, mientras que la fase móvil es un líquido más polar.
 DISCUSIÓN

De acuerdo a los resultados obtenidos, en la tabla 1 se presentan los cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados
en las 2 fases móviles en donde se puede observar las diez manchas correspondientes a las soluciones tipo de aminoácidos
distribuidas en función de su estructura. El orden de elución fue el siguiente: Arginina, lisina, prolina, glicina, ácido
glutámico, histidina, treonina, tirosina, metionina y fenilalanina; Denotando que los aminoácidos más polares son arginina,
lisina e histidina. Los aminoácidos que más se desplazaron fueron fenilalanina, metionina y tirosina, reparto explicado
debido a su interacción hidrofóbica con el disolvente cloroformo-metanol-amoníaco y por la repulsión con la fase
estacionaria. El coeficiente de reparto de cada aminoácido en la cromatoplaca 2 disminuye proporcionalmente al aumento
en la polaridad de los disolventes utilizados en comparación a los utilizados en la primer cromatoplaca.

Ambos cromatogramas solo permitieron la identificación relativa de los aminoácidos : Prolina, Glicina,Glutámico y Tirosina
denotándolos como las manchas más características, dado que la concentración del jugo no permitió visualizar una
correcta resolución.

En el caso del cromatograma bidimensional tipo tabla 3 , se observan diez manchas correspondientes a los aminoácidos
y que al comparar el coeficiente de reparto con los de los anteriores cromatogramas, solo se identificaron algunos como
fueArginina,Prolina,Glicina,Glutámico y la Tirosina los demás no pudieron ser identificados ya que sus Rf no coincidían con
los otros datos de Rf de los gromatogramas .

Se identificaron en el cromatograma bidimensional problema cinco de los aminoácidos de la muestra de jugo de jitomate
, los cuales se pudieron terminar por comparación de sus Rf de los aminoácidos identificados en la tabla 1 y
posteriormente con la tabla 2,estos aminoácidos corresponder a Prolina, Glicina,Glutámico y Tirosina, de acuerdo a la
referencia consultada el jugo de jitomate contiene aproximadamente 16 aminoácidos de los cuales contiene en mayor
cantidad Ácido glutámico ,Ácido aspártico y la Serina y en menor cantidad contiene prolina ,glicina tirosina ,etc .,puede
verse en la tabla 4 , ubicada en el cuestionario; los demás aminoácidos no pudieron ser identificados de acuerdo a sus Rf
debido a que solo colocamos 10 de los 20 aminoácidos ,por lo cual también se reduce la cantidad de poder encontrar
mayor número de aminoacidos encontrados en la muestra problema de jugo de jitomate ,otro factor que pudo haber
afectado y que es importante tomar en cuenta es el tipo de jitomate del cual se extrajo el jugo para la obtención de
aminoacidos ya que hay una gran variedad de jitomates y dependiendo de cuál sea cada uno de ellos pues va a depender
los aminoacidos que contenga así como la cantidad de aminoacidos que se encuentre presente en cada uno de ellos
,también lo que puede variar encontrar los aminoacidos presente es el estado de madurez del jitomate si se encontraba
muy maduro puede que este haya perdido la cantidad de aminoacidos presentes asi como algunos de ellos ya que con
forme madura se van perdiendo o degradando algunos aminoacidos , despareciendo así de esta manera .

Una forma de corregir estos errores podría ser aumentando la concentración de la muestra problema a lo doble de lo cual
se trabajó ,tener los cuidados necesarios al momento de colocar las muestras de los aminoacidos o el jugo del jitomate no
desprender la sílica de la cromatoplaca , utilizar siempre guantes para manejar las cromatoplacas , no estar hablando en
el momento de colocar las muestras para evitar interferencias , así como exponer el tiempo adecuado a exposición de
vapores de amoniaco etc.
 CONCLUSIÒN

Los aminoácidos obtenidos e identificados a partir de la cromatografía bidimensional en capa fina en

la muestra problema (juego de jitomate), fueron: Glicina, Ácido glutámico, Tirosina,Prolina

La cromatografía bidimensional proporciona una mejor resolución que la unidimensional, sujeta al

uso de la fase móvil adecuada.Se corrobora que esta técnica tiene un mayor grado de resolución a
comparación con la técnica de cromatografía unidimensional

Bibliografía
1.http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/11%20CROMATOGRAF%C3%8DA%20DE%20CAPA%20FIN
A%20DE%20AAs.pdf
2.http://www.odonto.unam.mx/pdfs/bioquimica_experimentalparte4_defiparte1.pdf
3. https://alimentos.org.es/aminoacidos-zumo-jitomate-natural.
4. https://es.scribd.com/doc/72120488/Cromatografia-de-fase-inversa