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TRANSCRITOS MICROBIOLOGÍA 2018

Dr. Juan Fuentes A.

Capi, 2018
Tema 1: Introducción a la Microbiología
Clase 1
La microbiología es una ciencia, lo que implica que se basa en el método científico, que es un proceso
sistemático.

Método científico
Observación: Fenómeno que llama la atención.
Pregunta: Formulación de una pregunta que deriva directamente de la observación.
Hipótesis: Respuesta para la pregunta formulada, que debe ser una afirmación comprobable,
sustentada en la observación o en antecedentes.
Prueba de hipótesis: En este caso corresponde al experimento, o en medicina, por ejemplo, un
examen de laboratorio. Me da evidencias que me permiten saber si la hipótesis es verdadera o
falsa. Si la hipótesis es falsa, se plantea una hipótesis alternativa hasta responder la pregunta.
Tesis: Es una generalización que se realiza a partir de todo el método científico anterior y sirve
para realizar investigaciones mayormente. Es importante distinguir entre los conceptos de tesis
e hipótesis. El conjunto de tesis hace una teoría, entonces, una teoría está comprobada a
través de varios métodos científicos anteriores, incluyendo dentro de ella no sólo tesis, sino
también leyes, que son derivaciones de tesis.

Microbiología viene de tres palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia). Esta ciencia
estudia organismos muy diversos; bacterias, que son organismos procariontes, virus, que no son siquiera
organismos celulares, hongos y parásitos que son eucariontes, por lo tanto, la microbiología es una ciencia
polifilética, lo que significa que estudia organismos con orígenes evolutivos diversos, es decir, que no tienen
relación filogenética entre sí. Existen diversas ramas de la microbiología, como lo son la bacteriología,
virología, micología y parasitología.

Historia de la Microbiología

Antoni Van Leeuwenhoek (1684)


Es considerado el padre de la microbiología, ya que creó un
microscopio primitivo. Consta de una placa metálica con un
pequeño orificio con un lente, sobre la cual, en una aguja, ponía
la muestra, además de tornillos con los que enfocaba. Van
Leeuwenhoek hizo dibujos de lo que observó, a lo que llamó
animálculos, que viene del latín y significa animales pequeños,
dentro de estos dibujos podemos observar desde insectos hasta
incluso bacterias.

Robert Hooke (1635-1702)


Perfeccionó el microscopio de Van Leeuwenhoek, dándole una
forma de tubo, sentando las bases del microscopio moderno. Observó
hongos filamentosos.

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Francesco Redi (1668)
Hizo experimentos sobre la generación espontánea.
Antiguamente se pensaba que la materia era capaz de generar
vida de manera espontánea. Redi quiso saber si la vida
provenía de la vida o de la generación espontánea, tomando
tres frascos con carne, uno completamente abierto, otro
completamente sellado y otro con una gasa que permitía el
intercambio de aire. Observó que solamente en el primero
aparecían las larvas de la mosca, refutando la generación
espontánea. Propuso que la vida viene sólo de la vida. Fue el
primero en utilizar el método científico.

Lazzaro Spallanzani (1765)


Continuó los estudios de Redi sobre la generación espontánea.
Needham sostenía que cuando un caldo nutritivo se calentaba,
mueren los microorganismos, pero luego, de forma espontánea
reaparecían microorganismos en este caldo. Se dio cuenta de que al
calentar un caldo nutritivo y taparlo, nunca volvían a aparecer los
microorganismos. Su aporte es que demostró que la teoría de Redi
también se cumple en los animálculos, y sentó las bases de los
medios de cultivo estériles.

Luis Pasteur (1822-1895)


Comenzó estudiando los procesos de fermentación, lo
que lo llevó a estudiar microorganismos, uno de sus
descubrimientos más importantes, es que terminó de
descartar la generación espontánea a través del
experimento del cuello de cisne. Puso un líquido no
estéril en un frasco con cuello de cisne, que se calienta
hasta la mitad del tubo y se deja abierto (a). Se
observó que en el tiempo permanece estéril (b), pero
cuando ladea el frasco para que el líquido toque la
parte no estéril del tubo, el líquido se llena de
microrganismos (c). Pasteur propuso que los
microorganismos se acumulan en la punta del tubo,
pero al no poder llegar al líquido, no pueden
reproducirse.

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Edward Jenner (1749-1823)
Es el padre de las vacunas. Era un médico inglés que observó que los campesinos no se contagiaban con la
viruela humana, pero sí se contagiaban con la viruela de las vacas, que corresponde a una viruela más
suave. Propuso como hipótesis que el virus vacuno prepara al cuerpo para resistir la enfermedad mayor.
Experimentó inyectándole a un niño la viruela vacuna, el que se enfermó levemente y luego de esto le inyectó
el virus mortal, al que sobrevivió.

Luis Pasteur
Además, creó la vacuna para la rabia basado en los resultados de Jenner. Como no existía un virus más
suave, propuso atenuarlo con productos químicos o calor. El tiempo de latencia de la rabia es muy amplio,
pudiendo ponerse la vacuna después de la exposición, por lo que probó su vacuna en un niño mordido por un
perro con infectado, el que sobrevivió a pesar de la alta mortalidad que posee la rabia. Esta vacuna es una de
las más potentes que se conocen, siendo un gran aporte a la medicina. Actualmente encontramos dos tipos
de vacunas, las vacunas vivas como la de la viruela, o las vacunas atenuadas como la de la rabia.

Robert Koch (1843-1910)


Identificó los microorganismos como los agentes etiológicos de la enfermedad y generó la teoría de la
resistencia adquirida (Jenner, Pasteur y Koch) que dice que si un organismo se expone a una cepa no
virulenta (es decir, atenuada o inactivada) el organismo se prepara y lo protege contra la cepa virulenta.
Definió los postulados de Koch trabajando con tuberculosis y ántrax, instaurándose el concepto de contagio
desde un individuo enfermo a uno sano.

Postulados de Koch
1. El microorganismo debe estar presente en todos los individuos que presenten la enfermedad.
2. El microorganismo debe ser recuperado del individuo enfermo y poder ser aislado en un medio de
cultivo.
3. El microorganismo proveniente de ese cultivo debe causar la misma enfermedad si se aplica a un
individuo sano, es decir, la enfermedad se transmite.
4. El individuo experimentalmente infectado debe también presentar el microorganismo.

Joseph Lister (1827-1912)


Instauró los conceptos de esterilización, antisepsia, sanitización, etc. Descubrió que, si los instrumentos
quirúrgicos eran sometidos al fuego o al fenol previo a la cirugía, no se producían infecciones, propuso que
estos procesos eliminaban los microorganismos de la instrumentalización. También sentó las bases para el
descubrimiento de la Listeria.
Instauró un concepto relacionado con el lavado de manos. En esos años los partos eran atendidos por
médicos o parteras, habitualmente las parteras sólo atendían a una paciente y luego se iban, en cambio los
médicos atendían muchas pacientes, observó que dependiendo de si los partos eran atendidos por parteras o
por médicos existían tasas diferenciales de infecciones postparto, siendo mayores en el caso de los médicos.
Propuso el lavado de manos entre cada paciente, por lo que fue despedido, pero en el siguiente hospital en
que trabajó logró disminuir en gran medida las infecciones.

Martinus W. Beijerinck (1865 - 1939)


Hizo muchos aportes a la microbiología ambiental y es denominado el padre de la virología. En este momento
ya se conocían los postulados de Koch, por lo tanto, se utilizaba el concepto de contagio. Hizo experimentos
en los que filtraba un contenido con microorganismos con filtros de 0,45 o 0,22 µm, que son suficientemente
pequeños para separar las bacterias, que son del orden de 10 µm. Cuando el filtrado de un líquido con
bacterias era inyectado en ratones, estos no se enfermaban ya que las bacterias habían sido eliminadas de la

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sustancia. En uno de estos experimentos, los ratones inyectados con el filtrado sí se infectaron, por lo que
postuló que esa enfermedad no estaba producida por bacterias, sino por partículas más pequeñas que eran
capaces de atravesar el filtro, a lo que le llamó veneno, que viene del latín virus.

Investigadores Rusos (1930)


Encontraron virus que son específicos para un huésped favorito, gracias a esto conocemos virus de animales,
plantas, bacterias, hongos, etc. Se dieron cuenta que había virus que matan a las bacterias en particular, por
lo que comenzaron a aplicar virus en las heridas de los pacientes.

Paul Ehrlrich (1908)


Pensó en crear compuestos químicos con la propiedad de matar a los microorganismos y que fueran inocuos
para el paciente, es decir, toxicidad selectiva. Inventó compuestos basados en arsénico que mataban sífilis
en modelos de ratones, siendo finalmente el tratamiento con salvarsán que permitía la curar a los ratones de
la sífilis.

Alexander Fleming (1928-1955)


Microbiólogo denominado el padre de los antibióticos que trabajaba con
Staphylococcus aureus cuando se le contaminó una muestra con un hongo.
Notó que alrededor del hongo no había crecimiento de la bacteria,
descubriendo la existencia de un compuesto natural que no permite la
proliferación de las bacterias. Como el compuesto viene del hongo Penicillium
notatum, él le llamó Penicilina, pero nunca pudo aislarla ya que no tenía las
técnicas químicas.

Howard Florey y Ernst Chain (1940)


Lograron aislar la penicilina, por lo que obtuvieron un Nobel de Medicina, que compartieron con Fleming.

El avance en el tiempo de la microbiología ha permitido el descubrimiento de muchos patógenos, varios de


ellos muy recientemente, como podemos observar en la siguiente tabla.

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Conceptos en Microbiología

En la clínica es importante que sepamos la diferencia entre esterilización, desinfección y antisepsia.


Antisepsia y desinfección son conceptos hermanos, ambos se refieren a eliminar muchos organismos
patógenos, aunque no todos, por ejemplo, en ambos casos permanecen las esporas, a diferencia de la
esterilización que sí elimina todos los microorganismos. La antisepsia y la desinfección se diferencian sólo en
que la antisepsia se realiza en tejido vivo y la desinfección se realiza a superficies y objetos. Es necesario
hacer la distinción entre desinfección y sanitización, esta última es un proceso orientado a reducir la
población de microrganismos a niveles considerados seguros para la población.
Los germicidas son agentes químicos que matan microorganismos, dentro de los cuales encontramos los
bactericidas, esporicidas, virucidas, tuberculicidas, fungicidas, etc. Los tubérculos se tratan aparte ya que son
bacterias cubiertas por capas lipídicas muy resistentes.

Esporas
Es un concepto que en microbiología cambia su significado dependiendo del
microorganismo del que estemos hablando. En los hongos son partículas reproductivas que
salen del esporangio y fundan otra colonia. En cambio, las bacterias, bajo condiciones
adversas de estrés realizan un proceso de diferenciación celular que implica la
condensación del ADN y su cubierta con proteínas protectoras formando una espora, la que
es fuertemente resistente a las condiciones adversas, no realiza metabolismo por lo que no
necesita agua y es resistente a los antibióticos. Bajo condiciones favorables la espora es
capaz de germinar y generar la bacteria vegetativa completa.

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Clase 2
Esterilización
Se utiliza en superficies e instrumentos.

Autoclave
Dentro de los esterilizantes físicos encontramos la presión húmeda, también conocida como autoclave, que
es básicamente una olla a presión de gran tamaño que permite subir la temperatura del agua a más de
100°C, explicado por la ley de los gases ideales. Podemos destacar el tiempo que debo autoclavar para
obtener una esterilización, si disminuyo la temperatura de 121°C a, por ejemplo, 115°C, necesito 50% más de
tiempo para obtener los mismos resultados, entonces es importante estar muy seguros de la temperatura a la
que está configurado la autoclave. Sus ventajas son que es muy cómodo de usar, además al utilizar agua,
esta se mete en todos los espacios pequeños del instrumental que se quiere esterilizar, siendo muy eficaz.

Calor seco
No se hace en autoclave, sino que, en horno, el que puede llegar hasta 180°C. Se recomienda usar la
autoclave por sobre el calor seco, ya que no todo el instrumental soporta tal temperatura, siendo el primero
mucho más amigable con los materiales.

Filtración
Existen filtros de aire y líquidos. Son muy buenos para filtrar bacterias, pero no son capaces de dejar fuera los
virus.

Radiación UV
Se utiliza bastante en laboratorios para esterilizar superficies, tardando aproximadamente 10 minutos. Tiene
la propiedad de no ser muy penetrante, por esto es porque sólo se utiliza en superficies.

Radiación ionizante
Se refiere a microondas o radiación gamma. A diferencia de la radiación UV, las radiaciones ionizantes son
penetrantes, pero producen múltiples cambios químicos.

Si tenemos un medio de cultivo líquido la forma más eficaz y recomendada de esterilización es presión
húmeda, ya que la filtración es más arriesgada por el riesgo de contaminación viral. La radiación UV no

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penetra lo suficiente y las radiaciones ionizantes podrían funcionar, pero podría cambiar químicamente el
medio de cultivo.

Esterilización con gases


Se utilizan frecuentemente para habitaciones o material. El gas plasma y el gas de peróxido de hidrógeno son
similares, con la diferencia de que el primero ioniza. El óxido de etileno es mucho más tóxico, por lo que
luego del proceso se requiere ventilar varias horas para que el gas se disipe.

Esterilización química
Existe el ácido peroxiacético que se utiliza parecido al óxido de etileno porque requiere ventilación ya que es
volátil, y el glutaraldehído que es muy eficaz, pero no se disipa, lo que no es tan bueno ya que también es
tóxico.

Desinfección
Tienen dos propiedades; mientras más concentrados y mientras más tiempo permanecen en la superficie,
tienen mayor eficacia.

Calor Húmedo
Se utiliza una olla común, a una temperatura de
entre 75 y 100°C.

Líquidos
El glutaraldeído, los compuestos fenólicos y de
amonio cuaternario desinfectan alquilando distintos
compuestos de los microorganismos. La alquilación
se refiere a agregar cadenas alifáticas a los
compuestos, con lo que pierden su funcionalidad.
Existen los compuestos halógenos (con cloro, yodo
y peróxido) que son muy oxidantes. El alcohol es
uno de los pocos compuestos que no cumple con las propiedades de los desinfectantes, mientras más
concentrado tiene menos eficacia debido a su volatilidad, por lo que se recomienda utilizarlo al 70° y no al
95°. Es importante destacar que el alcohol y los compuestos fenólicos no sirven contra esporas, entonces, si
tenemos esporas utilizaremos cloro en superficies y yodo, que es menos eficaz, pero es útil sobre tejidos.

Antisepsia
La clorhexidina funciona por
alquilación y estrés oxidativo, es
muy utilizada en la clínica ya que
es muy amigable con los tejidos.
El triclosán es muy útil y también
es amigable con los tejidos, pero
sólo funciona sobre las bacterias.

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Propiedades germicidas de los agentes antisépticos y desinfectantes
Debemos mencionar que las bacterias son los organismos más sensibles, pero existe una clasificación que
se encuentra aparte, las micobacterias, que también son bacterias y producen dos cuadros clínicos
importantes, la tuberculosis y la lepra. Poseen una superficie extremadamente impermeable que les otorga
mayor resistencia y por esta razón deben clasificarse por separado.

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Tema 2: Filogenia y taxonomía

Como futuros médicos debemos saber identificar y clasificar a los microorganismos para tomar decisiones de
tratamiento y pronóstico. Para poder aproximarnos a la identificación debemos tener claros algunos
conceptos.

Taxonomía
Viene de taxón, que significa rama, y nómos, que significa nombre, entonces es una forma de clasificar
organismos según distintas propiedades. Es un orden jerarquizado y sistemático de los nombres de los
grupos de organismos. No se debe confundir con filogenia. Tiene tres funciones fundamentalmente:
1. Clasificación: Ordenar los organismos en distintos taxa, en base a semejanzas o interrelaciones.
2. Nomenclatura: Sirve para ponerle nombre a los organismos según las reglas internacionales de lineo,
que es una nomenclatura binomial en donde se escribe el género en mayúsculas y la especie en
minúsculas. Ejemplo: Escherichia coli, Homo sapiens, etc.
3. Identificación: Uso práctico de un esquema de clasificación en base a distintas propiedades del
microorganismo.

Filogenia
Viene de phylo, que significa afinidad, y genos, que se refiere al origen. A diferencia de la taxonomía, la
filogenia clasifica a los organismos de acuerdo con su origen evolutivo, es decir, qué tan cercanos son dos
organismos basándose en su genotipo. Existen genes que se llaman genes relojes moleculares que sirven
para poder dilucidar la relación filogenética entre organismos, que tienen que ser moléculas conservadas en
muchos organismos para poder compararlos, con una función similar y baja tasa de mutaciones. El reloj
molecular más utilizado es el gen que codifica para el ARN ribosomal, específicamente la subunidad 16s.

La taxonomía ordena a los organismos por cómo son y qué hacen, no le importa su relación filogenética,
mezclando el análisis genotípico y fenotípico, resultando una clasificación práctica. Por ejemplo, cuando se
hizo un análisis filogenético de Escherichia coli y Shigella flexneri se encontró en sus relojes moleculares que
ambas son de la misma especie, por lo que se propuso en un congreso cambiarle el nombre a Shingella. El
equipo médico se opuso a este cambio, ya que causan cuadros clínicos muy diferentes, E. coli causa cuadros
intestinales leves y requiere de al menos un millón de bacterias para enfermar, en cambio S. flexneri produce
una enfermedad sistémica y se requieren menos de diez unidades para causar la enfermedad. Esto nos da
diferencias fundamentales en las decisiones clínicas que se deben tomar, por ejemplo, E. coli no suele
contagiarse de persona a persona ya que las condiciones de aseo normal no permiten el traspaso de un
millón de bacterias, en cambio S. flexneri puede contagiarse tan solo con un mal lavado de manos, además,
E. coli tiene una resolución espontánea de 3 a 4 días y se incuba rápido, en cambio S. flexneri tiene un
tiempo de incubación de dos semanas y tiene riesgo de muerte. Bajo esta lógica es mucho más práctico
mantenerlas en clasificaciones separadas, siendo mucho más relevante para nuestra profesión la taxonomía
sobre la filogenia.

Categorización taxonómica

En bacterias al fillum se le llama división ya que fillum se utiliza en


animales, además tienen una subclasificación importante dentro de las
especies, por ejemplo, el género Salmonella tiene dos especies, S.
entérica y S. bongori, esta última sólo afecta a animales
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poiquilotermos. S. entérica tiene 7 variantes propias determinadas por 1% o menos del genoma, lo que varía
el fenotipo de tal modo que es necesario hacer la distinción entre ellas, esto se considera una subespecie. La
subespecie 1 es la única que afecta a animales homeotermos, en cambio el resto también afectan
poiquilotermos. Dentro de las subespecies también encontramos tipos que es una clasificación que se basa
en algún fenotipo de interés, es importante destacar que no tiene relación directa con el genotipo, sino que
evalúa características que son útiles y son:

Patotipo o patovar
Se refiere al cuadro clínico que da el microorganismo, en el caso de E. coli existe patovar SHU (síndrome
hemolítico urémico) y patovar EH (enterohemorrágica), etc.

Serotipo o serovar
Se utiliza para evaluar el tipo de anticuerpo con el que reacciona, por ejemplo, la S. entérica sv. Typhi o S.
entérica sv typhimurium, esto significa que podemos identificar los dos tipos a través de pruebas con
anticuerpos, correlacionando la prueba con los cuadros clínicos.

Virotipo o virovar
Se clasifican según los bacteriófagos que son afines a los subtipos dentro de una especie, lo que también se
utiliza para ser relacionado con su cuadro clínico.

Entonces, es importante comprender que podemos clasificar los microorganismos de más de una forma, pero
utilizaremos la más nos sea útil al tener correlación con cuadros clínicos.

Para realizar la taxonomía habitualmente se utilizan criterios dicotómicos, es decir, al formular preguntas
habitualmente hay sólo dos respuestas. Es importante en microbiología seguir un orden en la búsqueda de un
microorganismo con el fin de no llegar a respuestas erróneas. Entonces, cada pregunta me va a llevar a una
serie de respuestas que en el orden correcto facilitan la búsqueda.

Podemos observar un ejemplo de categorización taxonómica, que es el que utilizaremos en el laboratorio. Es


importante entender que los criterios van siempre de lo más general a lo más específico hasta encontrar la
especie, realizando siempre un análisis dicotómico. El primer paso para realizar una categorización
taxonómica, incluso antes que lo expuesto en el esquema es obtener un cultivo axénico, que significa llegar a

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un cultivo en el que sólo tengamos un tipo de microorganismo, es decir, un cultivo puro. A diferencia de la
experimentación con organismos de gran tamaño, los microorganismos son demasiado pequeños por lo que
debemos trabajar con poblaciones, lo que nos obliga a buscar obtener cultivos axénicos, que nos otorgan
resultados fidedignos.

Existen algunas pruebas moleculares modernas que sí se pueden realizar en cultivos contaminados ya que
son muy específicos, pero en general las pruebas microbiológicas requieren cultivos axénicos. Una vez que
se obtuvo el cultivo se deben realizar las siguientes pruebas:

Análisis macroscópico
Son todas aquellas pruebas que yo pueda realizar al ojo desnudo o una lupa. Se realizan sobre las placas de
cultivo para observar las colonias de microorganismos.

Análisis microscópico
Son todos los análisis que requieran de un microscopio. No se ven las colonias sino las formas de las
bacterias.

Pruebas metabólicas
Ellas tienen un orden estricto. Se utilizan sustratos y se evalúa la presencia de metabolitos y enzimas.

Resistencia a antibióticos
Hay bacterias que son intrínsecamente resistentes a ciertos antibióticos, por ejemplo, E. coli es
intrínsecamente resistente a la vancomicina. Con esto podemos identificar a E. coli ya que sobrevive al
tratamiento con este antibiótico. Además, podemos probar antibióticos desconocidos para esa bacteria para
probar resistencias adquiridas y encontrar un tratamiento efectivo.

Pruebas moleculares
Se hacen para detectar moléculas particulares.

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Observación macroscópica

Medios de cultivo

Los medios de cultivo tienen distintas propiedades y se pueden clasificar según diferentes propiedades.
Según el estado físico se clasifican en:

Medio líquido
Habitualmente se utiliza para obtener una gran población de bacterias.

Medio semisólido
Se utiliza para ver motilidad del microorganismo. Al introducirlo en el medio,
si este nada, se va a esparcir por todo el medio, en cambio si no, sólo se va
a posicionar cerca de la aguja.

Medio sólido
Es muy útil ya que se utiliza para obtener los medios axénicos (sólo en
placa) y además sirve para realizar las pruebas metabólicas (en tubo).
Los medios sólidos en tubo se pueden clasificar según su forma:
En profundidad: Permite trabajar con microorganismos o reacciones
anaeróbicas en el sector basal del tubo.
Tendido: Sirve para trabajar con microorganismos aeróbicas o reacciones
aeróbicas ya que permite contacto con oxígeno.
Semitendido: Permite trabajar con microorganismos facultativos o
reacciones aeróbicas y anaeróbicas a la vez.

Obtención de medios de cultivo axénicos


Se toma la muestra no axénica y se aplica en un pequeño sector marginal de la placa, luego
se arrastran los microorganismos para separarlos. Se incuba el medio y se observan las
poblaciones densas que se forman que son observables a simple vista, a las que se les llama
colonias. Cada colonia representa a un tipo microbiano, por lo que se pasa parte de cada
colonia a otra placa y se repite el proceso hasta que se observen cultivos axénicos. Las
colonias presentas características propias de cada especie en la observación macroscópica,
entonces espero que cada colonia presente la misma forma.

Según su contenido de nutrientes los medios de cultivo se pueden clasificar en:

Medios definidos
Son aquellos de los que yo conozco exactamente el contenido de cada componente del medio. Preparar
estos medios es complejo ya que deben ser pesados cada nutriente como lo son el Magnesio, Calcio,
Nitrógeno, etc. Se utilizan cuando lo que se quiere evaluar es muy específico sobre el metabolismo de algún
microrganismo, por ejemplo, la metabolización de algún azúcar específico, etc.

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Medios indefinidos
Son aquellos de los que desconozco las concentraciones exactas de los nutrientes, pero los creo a partir de
materiales que sí conozco, por ejemplo, de un medio de extracto de levadura no sabemos exactamente
cuántos gramos de cada nutriente hay, como lo son también la sangre, órganos o extracto de soya. Se
preparan a partir de infusiones de digeridos proteicos en general.

Según su utilidad los medios de cultivo también pueden clasificarse en:

Medios corrientes o básicos


Tienen los nutrientes esenciales y son ocupados de base para cultivar. Algunos ejemplos son el caldo Luria,
un medio líquido basado en extracto de levadura y el agar corriente, que es un medio sólido. Podemos tener
el mismo medio líquido en versión sólida tan solo agregando agar.

Especiales
Mejorados o enriquecidos: Son medios básicos a los que se le agregan nutrientes extra para cultivar
microorganismos con requerimientos especiales, por ejemplo, el agar sangre que es un medio corriente al
que se le adiciona sangre, el agar cerebro-corazón, el agar aceite de oliva usado para levaduras y el agar
chocolate, al que se le agrega sangre cocida. También se consideran medios enriquecidos al agregar
factores de crecimiento, vitaminas, etc.
Esto ha permitido clasificar a los microorganismos en dos grandes grupos, a los microorganismos que
pueden crecer en medios corrientes se les llama de requerimiento simple, en cambio a los que requieren
medios especiales se les llama fastidiosos. Esto es importante en la clínica ya que en correlación con la
sospecha del médico y al conocer los requerimientos de los microorganismos, facilita el trabajo de los cultivos
al momento de realizar el diagnóstico.
Medios selectivos: Son aquellos que por su composición permiten sólo el crecimiento de algunas bacterias y
no de otras. Existen algunos importantes como lo son el agar MacConkey que permite sólo el crecimiento de
bacterias Gram negativo, el manitol salado, en donde sólo crecen los estafilococos, etc.
Medio diferencial: Se caracteriza porque el
mismo medio cambia de color según se
desarrolle un microorganismo u otro. No
selecciona el crecimiento, puede crecer una
amplia variedad de bacterias, pero estas
bacterias van a presentar fenotipos
diferentes en este medio, por ejemplo, en la
imagen vemos un agar MacConkey, que es
selectivo y diferencial a la vez, E. coli, que
es Gram (-) y fermenta la lactosa, forma
colonias de color fucsia, en cambio S. Typhimurium, también es Gram (-) y no
fermenta la lactosa, forma colonias de color damasco.
El manitol salado también es selectivo y diferencia. Es un medio con altas
concentraciones de sal, por consiguiente, sólo permite el crecimiento de
bacterias que soportan esa concentración, siendo S. aureus una de las
bacterias que lo soporta mejor, pero además de esto tiene un indicador de pH
para las bacterias que fermentan el manitol. Las que sí lo fermentan se ven de
color amarillo y las que no, de color rojo. En resumen, el agar MacConkey es
selectivo para bacterias Gram (-) y diferencial para fermentación de lactosa, en
cambio el manitol salado es selectivo para estafilococos y diferencial para fermentación de manitol.

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El agar sangre es enriquecido con sangre
fresca y también es diferencial porque nos
permite observar la hemólisis, que es la
destrucción de los glóbulos rojos. Si la
destrucción es total voy a tener una β-
hemólisis, que se visualiza alrededor de las
colonias como un halo de color
blanquecino, amarillento o transparente. Si
la hemólisis es parcial observaremos halos
de color verdoso y diremos que estamos en
presencia de una α-hemólisis. Por último, si
no hay hemólisis no observaremos ningún
halo, a lo que llamaremos γ-hemólisis.

En la siguiente tabla vemos los principales medios


no selectivos pero que a la vez están enriquecidos.
El agar sangre tiene la característica de tener
enzimas activas, principalmente la catalasa, que,
recordemos, es muy potente contra el estrés
oxidativo ya que elimina el agua oxigenada,
entonces es muy útil para recuperar microbios que
no la presentan de manera natural. A partir de agar
sangre principalmente podremos recuperar bacterias
Gram (+). El agar chocolate es similar al agar sangre
con la diferencia de que no presenta enzimas activas
y sirve para recuperar bacterias de los géneros
Haemophilus y Neisseria. El agar Müeller-
Hinton nos ayuda a hacer pruebas de
sensibilidad a antimicrobianos gracias a que
está hecho para no presentar ningún inhibidor
antimicrobiano. El agar tioglicolato sirve para
recuperar bacterias anaeróbicas, usando
tioglicolato como aceptor alternativo de
electrones. El agar Sabouraud dextrosa es rico
en azúcares, por lo que permite la
recuperación de hongos.
Los medios selectivos y diferenciales más
importantes se resumen en la siguiente tabla. El
agar SS es selectivo y diferencial para Salmonella y
Shigella. El medio de Lowernstein-Jensen es
selectivo para micobacterias, que son las bacterias
de la tuberculosis.
Los medios especializados más importantes son el
agar con carbón tamponado y extracto de levadura,
el agar cistina telurito, caldo Lim, MacConkey
sorbitol, agar Regan Lowe y el agar TCBS.

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Clase 3
Colonias

En la imagen veo dos cultivos en los cuales veo


claramente que son bacterias distintas, ya que sus
colonias son distintas. Las colonias son
aglomeraciones de bacterias que se han reproducido
sobre el medio de cultivo, que son características
para cada una. Es importante notar que todas sus
colonias son uniformes a pesar de que cambie el
tamaño, esto se debe a la relación entre las
concentraciones de bacterias y nutrientes como
vemos en la zona superior de la imagen izquierda,
tenemos muchas colonias de tamaño pequeño debido a que los nutrientes están más repartidos, en cambio
hacia el borde derecho las colonias son de mayor tamaño ya que tienen más nutrientes disponibles. Por lo
tanto, se consideran colonias igualmente uniformes que me sugieren muy fuertemente que el cultivo está
axénico. Cada vez que veamos placas con colonias no uniformes, debemos tomar una de las colonias y
volver a aislarla.
Solamente al mirar las colonias podemos definir características y clasificarlas, por ejemplo, sabemos que hay
colonias que forman colonias circulares, puntiformes o con bordes irregulares, pero esto no es suficiente para
identificar el microorganismo, por lo que las pruebas macroscópicas son sólo un indicador que nos puede
ayudar a descartar. Existe una manera sistemática para poder clasificar las colonias, que se resume en la
siguiente tabla:

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Observación microscópica

Es aquella observación que requiere el uso de un microscopio. Existen diferentes tipos de microscopía, la que
principalmente se divide en dos grupos, la microscopía óptica y la microscopía electrónica.

Microscopía óptica

Me permite visualizar hasta bacterias, pero no me permite visualizar virus. Los tipos de microscopía óptica
más útiles para nosotros son campo claro, campo oscuro y de fluorescencia.

Microscopía de campo claro


Se basa en que la luz atraviesa la muestra hacia el
observador. La muestra debe ser delgada para que la luz
logre atravesarla. Pueden observarse al fresco o teñidas.
Las muestras frescas son útiles en bacterias pigmentadas,
como, por ejemplo, las que realizan fotosíntesis. Con este
tipo de microscopía podemos observar la forma de las
bacterias, pero no puedo dar detalles moleculares.

Microscopía de campo oscuro


También necesita de una fuente de luz, pero
ésta es oblicua, entonces la luz no atraviesa la
muestra, sino que la refleja. Por ejemplo,
cuando hacemos aseo en nuestras casas y el
polvo se ve brillante cuando lo atraviesa un haz
de luz, esto es un ejemplo de campo oscuro.
Nos permite visualizar muestras sin la
necesidad de teñir, esto es útil para ver
bacterias que son tan pequeñas o delgadas que no son capaces de retener el colorante. Por ejemplo,
Treponema pallidum (a la izquierda) es tan delgada que no retiene los colorantes. En la imagen derecha
vemos espermios.

Microscopía de fluorescencia
Consta de un equipo complejo en el que existe un
emisor que emite varias longitudes de onda (1), un 6
primer filtro (2) que le dice al equipo con cuál
longitud atacar la muestra (3), siendo esta la luz
excitatoria (4), luego tenemos un espejo dicroico (5),
2
que refleja ciertas longitudes de onda y refracta 1
otras. A la muestra se le debe agregar lo que se
4
denomina un fluoróforo, que es una molécula que se 5
excita con una determinada longitud de onda, es
decir, sus electrones suben de nivel, y cuando estos
vuelven al nivel original, emite luz de otra longitud de
onda, por ejemplo, el fluoróforo del ejemplo se excita
con luz azul, pero emite luz verde, la que atraviesa
el espejo y llega al observador (6). 3

Capi, 2018
Con esto podemos ver las muestras con un color fuerte sobre un fondo
negro. Esta microscopía tiene varias ventajas, ya que nos permite observar
las células con bastante nitidez, además, la sonda o fluoróforo puede ser
diseñada de manera específica para que se una a tan solo una parte de una
bacteria y también podemos ocupar más de una sonda para marcar al
mismo tiempo más de una cosa.

Una ventaja del campo oscuro sobre el campo claro es que al no requerir
tinción no es necesario matar los microorganismos, por ejemplo, para ver
motilidad bacteriana.

Microscopía electrónica

Tiene un aumento efectivo de un millón de veces. Recordemos que el aumento efectivo es aquel que tiene
resolución efectiva, es decir, la capacidad de distinguir como separados dos puntos que efectivamente están
separados. Un aumento no efectivo es, por ejemplo, una proyección con un proyector sobre una pared, en la
que por mucho que aumente el tamaño no lograré mejor resolución ya que la imagen originar no tiene mayor
resolución. Sirve para ver estructuras sub celulares bacterianas, es decir, logro observar los componentes de
la bacteria, y también me permite visualizar virus.

Microscopía electrónica de transmisión


La forma más fácil de comprenderla es comparándola con la
microscopía óptica de campo claro. A diferencia de esta en vez
de utilizar colorantes debemos utilizar metales pesados como
oro, plata o platino, y en vez de usar luz de utiliza un haz de
electrones. Al igual que en campo claro los electrones atraviesan
la muestra. Los electrones que no pueden atravesar generan
puntos oscuros a la observación, en cambio los que sí atraviesan
generan puntos claros. En las imágenes de la derecha vemos
virus en superior y bacterias en división en inferior. Si el virus
tiene estructuras proteicas, el metal queda en estas estructuras.
En las bacterias podemos observar sus estructuras subcelulares.
Podemos observar estructuras en dos dimensiones.

Microscopía electrónica de barrido


Al igual que en la microscopía de transmisión se debe
utilizar un metal pesado en vez de colorante y haz de
electrones en vez de haz de luz. Como en la
microscopía de campo oscuro, el haz de electrones no
atraviesa la muestra, sino que se refleja en ella.
Podemos ver estructuras en tres dimensiones.

Para la realización de diagnósticos de utilizan ambos


tipos de microscopía, sin embargo, la más utilizada es la óptica, ya que, si bien es cierto que existen
diferencias estructurales fundamentales entre los patógenos, no son siempre necesarias en la clínica,
además la microscopía óptica es más accesible y de bajo costo.
Capi, 2018
Parámetros de observación microscópica

En la observación microscópica, a diferencia de la macroscópica nos centramos en la bacteria y no en la


colonia. Los puntos más importantes en los que debemos fijarnos son: forma de la bacteria, agrupación y
afinidad tintorial.

Afinidad tintorial
Las tinciones se utilizan para el microscopio óptico y las podemos clasificar en tres grupos:
Tinciones simples o inespecíficas: Se utiliza un solo colorante que es inespecífico. Se incuba el
colorante sobre la muestra, se fija con calor (mueren los microorganismos) y luego se lava el exceso.
Obtendremos que todos los microorganismos, independiente de sus características morfofuncionales,
quedarán teñidas. Me permite ver la forma y agrupación de las bacterias, pero no me permite observar
diferencias de color.

Tinciones diferenciales: Se caracterizan por utilizar dos colorantes en vez de uno. Me permite
observar afinidad tintorial. Me permite ver forma, agrupación y afinidad tintorial. Luego de fijar la
muestra se tiñe con el colorante diferencial, luego se lava y se tiñe con el colorante inespecífico, que
termina de teñir los microorganismos que no se tiñeron con el colorante diferencial. La más conocida
es la tinción de Gram.

Tinción de Gram
Luego de realizar un frotis de un cultivo axénico, se
agrega un colorante primario (1), en este caso es cristal
violeta, que es de color azul. Se fija el cristal violeta con
un mordiente (2), que es un fijador de tinción. Algunas
bacterias van a fijar el colorante y otras no. Se agrega un
descolorante (3) que suele ser alcohol con acetona, esto
permite lavar el colorante de las bacterias que no fijaron
el azul violeta. Finalmente se agrega el colorante
secundario (4), la safranina, que de un color rosado

Capi, 2018
suave y entra en todas las bacterias. Entonces las que ya fijaron el cristal
violeta no variarán en su color y se les llama Gram positivo, en cambio las
que no lo fijaron ahora tomarán un color rosado y se les llama Gram
negativo.
Las bacterias Gram (+) y (-) tienen diferencias estructurales que nos
permiten clasificarlas. Las bacterias Gram (+) presentan una pared celular
gruesa que permite que entre y se fije el colorante primario. Las Gram (-)
tienen una pared celular delgada y sobre ella una segunda membrana
lipídica. Luego de que entra el colorante primario, el mordiente lo fija muy
poco, por lo que el descolorante logra lavar el tinte, además de destruir la
membrana lipídica externa. Al aplicar la safranina ésta entra a una
bacteria que ya no tiene su membrana externa, fijándose a la pared.
Entonces, la tinción de Gram me permite diferenciar forma, agrupación y
afinidad tintorial, además representa diferencias morfológicas y fisiológicas
de las bacterias que son útiles para diferenciar cuadros clínicos.

En microscopía electrónica también es posible diferenciar las bacterias


Gram (-) y Gram (+), como podemos ver en las imágenes de la
derecha, siendo la de arriba Gram (+) y la de abajo Gram (-).

Tinción de Ziehl-Neelsen
También se le llama tinción de ácido-alcohol resistencia. Se utiliza para las micobacterias, que sobre
la membrana plasmática tienen una pared de péptidoglicano y sobre ella una gran cantidad de ácidos
micólicos, que hacen que esta bacteria sea altamente impermeable, por lo que las tinciones simples
son inútiles. Para realizar esta tinción se calienta fucsina, lo que al aplicarla sobre hace que esta capa
impermeable permita el paso del tinte, volviendo a su forma original al enfriarse, reteniendo la fucsina
que es de color rojo. Se agrega un descolorante de ácido y alcohol, que no afecta a la muestra, y por
último se utiliza un colorante secundario de color azul, que puede ser cristal violeta o azul de metileno.
Podemos concluir que es al revés que, en Gram, es decir, el color rosado es positivo y el color azul es
negativo.
En el siguiente cuadro resumen
podemos observar cómo las
tinciones que hemos revisado
tiñen a algunos microorganismos.

Capi, 2018
Tinciones especiales o específicas: Están orientadas a teñir estructuras particulares, como por
ejemplo las esporas.

Tinta china
La cápsula es una estructura extracelular constituida casi
en todas las bacterias por polisacáridos que las protege
de factores ambientales y de la fagocitosis, ya que les
otorga, además de resistencia, un mayor tamaño. Se
realiza fijando la muestra en tinta china, que es una
suspensión de carbono. La tinta china no puede penetrar
la cápsula quedando fuera de ella. Luego se tiñe con
fucsina que tiñe todo el resto. Se denomina tinción
negativa ya que se tiñe todo menos lo que se quiere ver.
Sirve para hacer diagnóstico de algunas bacterias y
permite saber con qué severidad va a atacar la bacteria, por ejemplo S. pneumoniae puede dar una
neumonía muy fuerte si está capsulada o ser prácticamente inocua si no lo está.

Verde de malaquita
Las esporas son muy difíciles de teñir, ya que son muy
impermeables, para eso se utiliza verde de malaquita caliente
que penetra en la espora y se queda sólo ahí. Luego
utilizamos safranina o fucsina fría que no penetra en la espora,
por estar fría. La presencia de esporas es también muy
importante para realizar diagnósticos.

Forma de las bacterias


Es fundamental para realizar su clasificación y depende de la pared celular. Encontramos varios grupos
principales que a su vez se subdividen:

TIPO SUBTIPO FORMA EJEMPLO

Perfectamente Staphyloccocus
Cocáceas
redonda aureus
Cocáceas

Streptoccocus
Lanceoladas Punta de flecha
pneumoniae

Bacilos Muy alargadas Bacillus cereus

Bacilos

Cocobacilos Casi redondas Escherichia coli

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Bacilos curvos Curvos Vibrio cholerae

Helicobacter
Espirilos Rígidos
pylori

Espirales

Treponema
Espiroquetas Flexibles
pallidum

Muy largas y Actinomyces


Filamentosas
delgadas israeli

Agrupación de las bacterias


No depende de la pared celular, sino de la cantidad de planos de división.

Planos de
Agrupación Prefijo Ejemplo
división

Neisseria
En duplas Diplo-
gonorrhoeae

Un plano

Streptococcus
En cadena Estrepto-
pyogenes

Dos planos Tétradas Micro- Sarcina lutea

Staphylococcus
División al azar En racimo Estáfilo-
aureus

Capi, 2018
Pruebas bioquímicas

Están orientadas hacia tres propiedades de los microorganismos.


1. ¿Cuáles son los sustratos que usan? Por ejemplo, si
fermenta o no algún azúcar.
2. ¿Qué metabolitos produce?
3. ¿Tiene alguna enzima o proteína en especial?
Estas pruebas se realizan en medios de cultivos diferenciales, los
que cambian de color si es que presenta alguna propiedad u otra.

Pruebas de resistencia a antibióticos

Recordemos que el medio Müeller-Hinton se utiliza para probar resistencia


a antibióticos. Esto se realiza generando un ‘césped’ que se refiere a que,
en vez de aislar las bacterias en colonias, estas crecen sobre toda la
superficie el medio de cultivo. Sobre este césped se posicionan discos de
papel bañado en algún antibiótico. Si la bacteria es afectada por el
antibiótico se generará un halo de inhibición del crecimiento alrededor del
papel. Si la bacteria es resistente, no se generará el halo.

Las pruebas de resistencia a antibióticos se realizan con dos objetivos:


1. Identificar patrones de resistencia y sensibilidad característicos de cada bacteria, por ejemplo S.
pyogenes y S. agalactiae tienen las mismas características macroscópicas y microscópicas, excepto
que S. pyogenes es sensible a bacitracina.
2. Explorar nuevos tratamientos para tratamientos de pacientes, por ejemplo, al obtener el resultado de
una muestra con algún patógeno, podemos buscar el mejor antibiótico o probar algún tratamiento
nuevo en caso de resistencias adquiridas.

Clase 4
Pruebas moleculares

A diferencia de las demás pruebas, no requieren necesariamente un cultivo axénico, pueden realizarse a una
comunidad bacteriana, es decir, un conjunto de poblaciones. También pueden realizarse directamente sobre
la muestra, como sangre, líquido cefalorraquídeo u orina. Esto se debe a que tienen una gran sensibilidad,
especificidad y seguridad en su resultado. Son tres grandes grupos de pruebas:

Pruebas moleculares para ácidos nucleicos

RFLP (Restriction fragment length polymorphism)


Están orientadas principalmente a ver diferencias macro en las secuencias de ADN de los microorganismos.
Algunos microorganismos tienen diferentes mutaciones que constituyen diferentes cepas, por ejemplo, tengo
un microorganismo con secuencias de ADN características, y un segundo microorganismo con diferentes
secuencias características. El RFLP es utilizado para determinar estas mutaciones características y con esa
información tomar decisiones. Hay cepas que tienen pronósticos diferentes o el contagio se genera por
diferentes vías, por ejemplo, el Herpes simple de tipo 1 se contagia por vía oral y el de tipo dos, por vía
sexual.

Capi, 2018
Se obtiene el material genético del
microorganismo y se trata con enzimas de
restricción, que cortan el ADN en segmentos
particulares. En el siguiente ejemplo vemos dos
diferentes cepas de una bacteria, para la de tipo
1 la enzima de restricción corta en dos zonas,
en cambio en la de tipo dos, corta sólo en una,
obteniendo, para el primer tipo, dos trozos de
ADN y para el segundo, un solo trozo. Una vez
que se trató con la enzima de restricción se
realiza una electroforesis en agarosa que nos
permite separar estos fragmentos. Sabemos
que para realizar la electroforesis se aplica un
campo eléctrico de tipo lineal, pero en clínica se
utiliza la electroforesis de campo pulsado,
debido a que los fragmentos obtenidos con esta
técnica son muy grandes, por lo que
necesitaríamos un gel muy largo para
separarlos. La diferencia entre el campo lineal y
el campo pulsado es que el polo positivo se
posiciona sobre una pieza móvil que lo mueve en forma de media luna,
generando que los fragmentos en vez de migrar en forma lineal migran en zigzag,
como si el gel fuera más largo de lo que es realmente. En el caso del ejemplo
obtendremos una electroforesis en la que veremos una banda con dos zonas marcadas en la parte baja del
gel y una banda con una sola zona marcada, en la región superior del gel.
En investigación, por ejemplo, podemos preguntarnos por la severidad de un cuadro clínico y preguntarnos si
la cepa del patógeno es la misma, y realizar un RFLP.

Sondas de ADN
Todo el resto de las pruebas moleculares para ADN utilizan sondas. Supongamos que
determiné que existe un gen que existe sólo en una cepa y no en otra, permitiéndome
diferenciarlas. Este fragmento de ADN podemos buscarlo a través de una sonda, que es un
fragmento de ADN complementario al gen de interés conjugada con una molécula que me
permita identificarla, que puede ser un fluoróforo o una enzima. Cuando extraemos el
material genético lo calentamos para separar los puentes de hidrógeno de las hebras
complementarias. Al aplicar la sonda esta va a unirse al objetivo, y al lavar no se separará
de la muestra. Por último, podemos revelar nuestra pesquisa y saber si la muestra tiene o
no el gen que buscamos.

Capi, 2018
Sonda in situ
En este caso se aplica
la sonda directamente al
tejido fresco para
detectar ADN foráneo.
En este caso la sonda
está unida a una
enzima, por lo que al
agregar un sustrato la
muestra cambia de
color, pudiendo ver in
situ la presencia del
gen.

Sonda FISH (fluorescence in situ


hybridation)
En vez de una enzima presenta un
fluoróforo, pudiendo ocupar en la
misma muestra más de uno para
identificar diferentes fragmentos de
ADN.

Dot blot
Es parecida a las técnicas
anteriores ya que responde la
pregunta de si tiene o no una
marca, pero la diferencia es que
no es in situ ya que debo extraer
todo el material genético de la
muestra. Este material genético
se posiciona sobre un papel de
micro celulosa, se aplica la
sonda y luego se lava.

Southern blot
También utiliza sondas, pero no responde una
pregunta on-off, sino que además me da
respuestas adicionales. Si al realizar una
electroforesis de material genético obtengo que
las enzimas que utilicé cortan el ADN en muchas
zonas, puedo utilizar una sonda sobre esta
electroforesis para buscar la región que necesito.
Entonces, aunque esta región se encuentre en
todas mis muestras yo aun así puedo obtener

Capi, 2018
información ya que la sonda aparecerá en diferentes regiones del gel. A diferencia del dot blot, puedo
distinguir dos microorganismos, aunque la sonda reaccione en ambos.

Northern blot
A diferencia del Southern blot, sirve para ARN. Para efectos clínicos es importante ya que existen virus que
no utilizan ADN, sino ARN, y, además, podemos pesquisar si un microorganismo está expresando una toxina
que es la que genera un cuadro clínico, buscando ARNm, ya que, aunque presente el gen, no
necesariamente esa especie o cepa la expresa.

PCR (reacción en cadena de la polimerasa)


Existen tres tipos principales de PCR, la PCR tradicional amplifica al ADN. El RT-PCR transforma el ARN en
ADN y después realiza un PCR, lo que sirve para pesquisar microorganismos que utilicen ARN en su genoma
y si se está expresando o no algún gen. El PCR en tiempo real es una técnica relativamente nueva que
puede ser utilizada sobre un PCR tradicional o RT-PCR, que sirve para saber cuántas copias originales de
muestra hay, esto me informa la carga de patógeno presente en el paciente.

Pruebas moleculares para detectar proteínas

Es importante ya que es la expresión


fenotípica del gen, ya que podemos saber
cuánta toxina se está produciendo.

SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate


polyacrylamide gel electrophoresis)
Es un tipo de electroforesis para proteínas
en gel de poliacrilamida, es desnaturante, dejando las proteínas en su configuración primaria y las separa
según tamaño. Nos permite observar patrones de proteína, como un análogo del RFLP, pudiendo, por
ejemplo, identificar cepas que producen mayor cantidad de toxinas.

Western blot
Utiliza una sonda de proteína, la que en vez de ser
una molécula de ADN en este caso es un anticuerpo
conjugado. Por ejemplo, si al realizar un SDS-PAGE
en donde no logro identificar diferencias, recurro a
un Western blot para buscar proteínas específicas,
lo que al revelar me muestra sólo las bandas que
tienen la sonda. En este caso podemos ver un
Western blot para una seroconversión de un
paciente con VIH, en la que se miden diferentes
proteínas que se producen al tener el virus.
Podemos ver la aparición de nuevas proteínas y
aumento en la cantidad con el avance del tiempo.

Es posible hacer dot blots para ADN, ARN o


proteínas, para este paciente podría poner la sonda
sobre las gotas de proteína aislada de la muestra.

Capi, 2018
Espectrometría de masas
Las proteínas se rompen con solventes, se pasan por un imán y según la curvatura que da el imán, me otorga
un patrón que aparece en el lector y según eso puedo saber qué proteínas hay.

Pruebas moleculares serológicas

Se basan en el uso de anticuerpos.


Están orientadas a responder dos
objetivos: permiten pesquisar proteínas
(dot y western blot) pero también
permiten pesquisar anticuerpos.

Test de ELISA
Permite pesquisar proteínas (antígenos) o anticuerpos. Supongamos que queremos saber si un paciente
tiene el virus de la Hepatitis B, que es insidioso, lo que quiere decir que puedo tener el virus, pero no
necesariamente tener síntomas, pudiendo ser portador. Entonces, yo podría detectar los anticuerpos o las
proteínas que produce el virus. En este caso, pesquisar los anticuerpos tiene ventajas y desventajas, la
ventaja es que con el test de ELISA puedo detectar anticuerpos de diferente tipo, IgA, IgM e IgG. Los
anticuerpos suelen aparecer dos semanas después de la exposición al patógeno y los primeros en aparece r
son los IgM, que son los de menor eficacia. Los IgG e IgA tardan más en aparecer, pero tienen mayor
eficacia. Los IgG son serológicos, es decir, se encuentran a nivel sistémico, en cambio los IgA sólo se
encuentran en las mucosas. Entonces, si yo detecto uno u otro puedo entender diferentes cosas, por ejemplo,
si sólo tiene anticuerpos anti Hepatitis B IgM, puedo decir que se contagió recién, a diferencia de si encuentro
IgG, pudiendo estimar cuándo se contagió. La gran desventaja es que al pesquisar los anticuerpos no estoy
seguro de si realmente tiene el patógeno o se encuentra inmunizado. Por ejemplo, la mayoría estamos
inmunizados contra varicela sin tener el virus activo. También, en un paciente inmunosuprimido, aunque esté
infectado no necesariamente presentará anticuerpos.
Existen cuatro formas de hacer el test de ELISA
ELISA directo: Pesquisa antígenos. Si quiero identificar una proteína, pego el suero del paciente sobre
una placa y aplico un anticuerpo primario conjugado, el que detecta la proteína y se une a ella, luego,
lavo el sobrante y observo si está la proteína.
ELISA indirecto: Pesquisa anticuerpos. Por ejemplo, si quiero pesquisar los anticuerpos contra la
cápside de un virus, tomo la proteína de la cápside y la pego en una placa, luego trato esta lámina con
el suero del paciente. Si presenta el anticuerpo este se va a unir a la proteína y al lavar la muestra se
quedará pegado, luego se pone un segundo anticuerpo antihumano conjugado con una enzima que se
pueda detectar, reaccionando al agregar el sustrato. Tiene la ventaja de que la señal puede
amplificarse, ya que al primer anticuerpo se le pueden unir más de un anticuerpo secundario.
Elisa sándwich: Pesquisa antígenos. En vez de pegar en la placa un antígeno, se pega un anticuerpo
que reconozca el antígeno que quiero pesquisar. Le aplico la muestra del paciente que tiene
diferentes
proteínas, al lavar
sólo queda el
antígeno que se
reconozca con el
anticuerpo de la
placa. A esto le
aplico un

Capi, 2018
anticuerpo que reconozca el antígeno que presenta el paciente y sobre este se aplica un anticuerpo
conjugado antihumano.

Aglutinación por látex


Permiten detectar la presencia de proteínas o antígenos,
permitiendo revelar un resultado de manera inmediata.
Se hace una mezcla de antígeno y anticuerpo, la que si
reacciona de manera positiva aglutinará formando
grumos, significando que tiene la proteína que busco.

Tema 3: Estructuras bacterianas

Diferencias entre eucariontes y procariontes

El griego pro significa primero, eu significa verdadero y kario significa núcleo.


Procariontes Eucariontes
Núcleo - +
Organelos - +
Histonas - +
ADN Circular Lineal
Haploide Diploide*
Pared celular + +/-
Ribosomas 70s 80s
Respiración En la membrana En la mitocondria
Replicación Fisión binaria Mitosis y meiosis
Reproducción Asexual Sexual

Darwin decía que se necesitaba que los organismos cambien y que el ambiente los seleccione. La fuente
más importante de cambios en los organismos superior eucariontes es el sexo, en cambio en las bacterias no
hacen sexo, sin embargo, evolucionan de igual manera a través de las mutaciones y el traspaso de material
genético entre ellas.

Pared Celular

Es una estructura rígida que se encuentra por fuera de la pared citoplasmática y que contribuye a proteger a
la bacteria y a conservar su forma. Existen dos tipos principales de pared, una gruesa y una delgada, que
puede ser observada gracias a la tinción de Gram. Las bacterias Gram (+) tienen una pared gruesa que las
protege, en cambio las Gram (-) tienen una
pared delgada y una segunda membrana
externa. Esto produce diferencias al enfrentar las
bacterias con, por ejemplo, desinfectantes. Las
Gram (+) suelen ser más resistentes a las
condiciones desinfectantes, ya que los lípidos de
la membrana externa de las Gram (-) son lábiles.
Capi, 2018
Bacterias Gram positivo
Podemos observar una membrana citoplasmática y una
pared gruesa que está constituida principalmente por ácidos
teicoicos y ácidos lipoteicoicos. Los ácidos lipoteicoicos
suelen atravesar toda la pared y anclarse en toda la
membrana a través de una región hidrofóbica, en cambio los
ácidos teicoicos sólo se encuentran en la pared misma.
Además, encontramos proteínas que están en la superficie,
que tienen como función ayudar en la adherencia de la
bacteria a superficies tanto bióticas como abióticas, lo que
es importante para no ser arrastradas por fluidos. Esta pared
está constituida por cadenas de un péptidoglicano llamado
mureína, que está formado por ácido N-acetilglucosamina y el
ácido N-acetilmurámico entrelazados entre sí por enlaces β-1,4
formando capas que se superponen, pero de esta forma no sería
una pared rígida, por lo que entre estas capas ocurre un proceso
llamado vulcanización, que involucra que estas capas de mureína
se entrelacen entre sí a través de enlaces entre los ácidos N-
acetilmurámicos a través de un link peptídico. Hay antibióticos que
atacan las bacterias Gram (+) afectando los enlaces glucosídicos
o los peptídicos.
El péptidoglicano se sintetiza en la zona del citoplasma en forma
de monómeros (un ácido de cada uno con el péptido para hacer el
link) unidos a una molécula llamada bactoprenol, que es un
transportador que pone el monómero en la pared. De forma
paralela se sintetizan enzimas que cortan los enlaces de la pared
existente para posicionar los nuevos monómeros. La familia de
las penicilinas afecta las transpeptidasas que generan estos
nuevos enlaces, esto implica que, si la bacteria no se está
dividiendo, no será afectada. La vancomicina tiene una estructura
parecida en el puente peptídico, siendo un inhibidor competitivo.
La bacitracina evita que el bactoprenol se una a la membrana
citoplasmática.

La pared de las Gram (+) y Gram (-) tienen los mismos


componentes. La diferencia está en la cantidad de capas y por
los puentes peptídicos, en Gram (+) están dados por glicina y en
Gram (-) están dados por alanina. En la práctica esto hace que
las paredes de las Gram (+) sean más separadas que las Gram (-).

Los ácidos teicoicos son polímeros de ribitol fosfato, en cambio los


ácidos lipoteicoicos son polímeros de glicerol fosfato anclados a lípidos
de membrana y sus funciones son las mismas, atravesando la pared
para mantener la estabilidad.

Las estructuras que realizan el primer contacto entre las bacterias


Gram (+) y el hospedero son la pared, los ácidos teicoicos y
lipoteicoicos y las proteínas de pared.

Capi, 2018
Clase 5
Bacterias Gram Negativo
Su configuración es completamente
distinta. Presenta una membrana
citoplasmática llamada membrana
interna, una pared celular delgada sin
ácidos teicoicos y lipoteicoicos y sobre
ella una membrana lipídica externa que
se caracteriza por ser asimétrica, es
decir, su cara interna es diferente a su
cara externa.
Membrana interna: es una bicapa
lipídica en gran parte simétrica, con
las características que ya
conocemos, es decir, un mosaico
fluido, pero sin esteroles, que mantiene su fluidez a través de proteínas especiales.

Periplasma: Corresponde al espacio que existe entre las membranas interna y externa, que incluye a la
pared celular. Recordemos que la pared celular de las bacterias Gram (+) y (-) tienen prácticamente los
mismos componentes, pero se diferencian en la presencia de ácidos teicoicos y lipoteicoicos y los puentes
que se forman entre las capas. Tiene muchas enzimas altamente oxidantes principalmente de protección,
siendo las más frecuentes las enzimas de restricción. En el caso de las Gram (+), liberan estas enzimas al
exterior, lo que no es tan eficiente como poseer un periplasma que las contenga. Si se inyecta ADN
foráneo a una bacteria, este es un potencial riesgo para ella, por lo que utiliza las enzimas para cortarlo.
Algunas bacterias producen β-lactamasas, que son penicinilasas. Otra de sus funciones es permitir el
plegamiento de las proteínas funcionales de la bacteria, ya que no presentan retículo. Además, presenta
proteínas de unión para sustratos específicos (carriers) y quimiorreceptores, que detectan atrayentes y
repelentes, por ejemplo, la glucosa es una atrayente y las sustancias tóxicas son repelentes que informan
a la bacteria que debe acercarse o alejarse.

Membrana externa: Es una bicapa lipídica asimétrica, su cara interna se encuentra embebida por
proteínas y su cara externa presenta lipopolisacáridos que son los que realizan el reconocimiento celular y
adherencia, junto con algunas proteínas fijadoras.

Lipopolisacáridos (LPS)
Es una molécula compuesta por varias partes. Primeramente, la “raíz”, por donde se inserta el LPS a
la membrana, tenemos el lípido A, que es hidrofóbico y se encuentra embebido en la membrana,
anclándose. Luego existe una zona de polimerización de azúcares. Unidos al lípido A existe una
región relativamente conservada en ciertos géneros o grupos bacterianos, que es el llamado
polisacárido central o core. La parte que realiza la adherencia y es reconocida por el sistema inmune
se denomina antígeno O.

Capi, 2018
Antígenos microbianos en clínica
Es importante recordar el nombre de los antígenos que se otorgan a las estructuras microbianas. Por
ejemplo, El antígeno O, el antígeno H que corresponde al flagelo y el antígeno K, que tiene relación
con la cápsula, etc. En clínica es importante ya que los antígenos van cambiando de acuerdo con la
naturaleza del microbio y las condiciones de crecimiento. Es útil para nombrar patógenos que, según
las características de sus antígenos, dan características clínicas particulares que se pueden asociar a
un pronóstico o tratamiento. Hay algunas bacterias que tienen una propiedad llamada cambio de fase,
que consiste en que la bacteria sintetiza varios antígenos O a lo largo de la infección y los cambia en
periodos de entre una semana o semana y media. El proceso por el cual se realiza la síntesis es muy
complejo.

Toxinas
Existen de dos tipos principales: endotoxinas y exotoxinas. Las endotoxinas son
aquellas estructuras del mismo organismo que al liberarse se convierte en tóxico
para el hospedero. Las exotoxinas son generalmente proteínas o algunos lípidos
que son fabricados expresamente con la función de realizar su ciclo de vida. Esto
es muy importante en clínica ya que las endotoxinas son los principales agentes
de la sepsis o “envenenamiento de la sangre”. Nuestro sistema inmune es muy
sensible a estos agentes, por lo que, a través de citoquinas, modifica la
temperatura y la presión arterial corporal, lo que tiene riesgo de muerte.

Existe una reacción particular a los tratamientos con de Gram (-), por ejemplo, los pacientes de sífilis
infectados por Treponema, en la que, luego de iniciado, aumenta la temperatura corporal y se produce
malestar general, que debería ceder al cabo de tres horas, provocado por la liberación del lípido A,
que es una endotoxina. También, cuando una bacteria se encuentra en proliferación activa en la
sangre, el riesgo de sepsis es alto debido a los restos de estructuras bacterianas liberados. La toxina
del cólera, por otro lado, es una exotoxina sintetizada con el fin de realizar su ciclo de vida, por lo que
es secretada.

Porinas
Son canales que se ubican exclusivamente en la membrana
externa. Las bacterias Gram (-) tienen dos filtros para permitir
entrar o salir cosas. El primer filtro es que sean capaces de
traspasar la membrana externa a través de las porinas o entre
los fosfolípidos. Las porinas permiten el traspaso de sustancias
seleccionándolas por tamaño y carga, ya que están llenas de
agua y sólo permiten los elementos hidrofílicos. Cabe destacar
que existen porinas para cargas negativas y para positivas.
Entonces, lo que ocurre entre el exterior y el periplasma
corresponde a un equilibrio simple determinado por tamaño y carga. La exclusión más importante se
realiza en la membrana interna, en donde se encuentras las permeasas que permiten ingreso, y las
bombas, que permiten el egreso de sustancias. También puede ser que las mismas permeasas
puedan ingresar y egresar sustancias del periplasma. Ambas son transporte activo.
La vancomicina es un antibiótico que afecta la síntesis de la pared, pero sólo afecta Gram (+). Esto se
debe a que es de gran tamaño, por lo que en Gram (+) logra afectar directamente la pared, en cambio,
en Gram (-) no logra atravesar las porinas. Todas las Gram (-) son intrínsecamente resistentes a
vancomicina. Esto es muy importante ya que hay antibióticos que afectan la pared, otros que afectan
la transcripción o la síntesis proteica. Existen bacterias que de una sola vez se vuelven

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multirresistentes a estos mecanismos antibióticos, esto se debe a que la expresión de bombas hace
que sea capaz de sacar los antibióticos de manera inespecífica, siendo esta la principal razón de la
multirresistencia.

Membrana citoplasmática

Funciones
1. Permeabilidad: Es la barrera que la bacteria utiliza para escoger qué cosas entran y qué cosas salen
de ella.
2. Estructural: Es la zona que limita el citoplasma de la bacteria, además realiza síntesis y transporte de
macromoléculas.
3. Señalización: En la membrana se encuentran los receptores que son capaces de censar el medio en
donde la bacteria se desarrolla, que son en general quimiorreceptores para las bacterias clínicas, que
activan mecanismos a través de cascadas de fosforilación muy complejas. Hay bacterias que son
fotorreceptoras ya que realizan fotosíntesis o se ven afectadas por la luz, y otras llamadas magneto
bacterias, que presentan organelos formados por azufre o hierro que se alinean con los campos
magnéticos de la Tierra. Estas últimas no son bacterias clínicas.
4. Generación de energía: Las bacterias no tienen mitocondrias, de hecho, la teoría endosimbiótica
explica que las mitocondrias eran procariontes que generaron una relación simbiótica con células
eucariontes para llevar a cabo la respiración, que, recordemos, consiste en traspasar electrones
desde el alimento al oxígeno (que es el aceptor de electrones por excelencia debido a su alta
electronegatividad) a través de una cadena transportadora de electrones presente en la membrana
interna de la mitocondria. En los eucariontes la glicólisis ocurre en el citoplasma, al igual que en las
bacterias, pero su respiración no ocurre en mitocondrias, sino que en la membrana celular/ interna. Es
mucho más eficiente en las Gram (-) ya que los protones quedan atrapados en el periplasma.

Mesosomas

Son estructuras internas de la bacteria que corresponden a


pequeñas invaginaciones de la membrana. Su función
principal es ser un ancla para el ADN durante la fisión cada
copia es sostenida por un mesosoma y arrastrada hacia las
bacterias hijas.

Componentes externos de las bacterias

Cápsula
Estructura mucilaginosa extracelular, constituida principalmente por carbohidratos, con algunas excepciones
en la que la cápsula es proteica, por ejemplo, Yersinia, que puede ser pesquisada por su cápsula. Se
denomina antígeno K, por ejemplo, E. coli K1, lo que significa que es una E. coli con una cápsula de tipo 1.
Esta cepa es el agente etiológico de la meningitis neonatal. Existen bacterias con una gran cápsula, cápsula
pequeña o decapsuladas.

Funciones de la cápsula
1. Adherencia: Es la primera estructura que toma contacto con el medio.

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2. Protección: Ayuda a disminuir la tasa de fagocitosis debido al tamaño que le otorga a la
bacteria.

Flagelo
Es una estructura que está presente tanto en
eucariontes como procariontes. En ambos
corresponde a un apéndice proteico externo,
pero desde el punto de vista estructural son
muy diferentes. El flagelo bacteriano es
rígido y tiene algunas estructuras que lo
anclan a la bacteria. En el caso de las Gram
(-), tienen anclas en la membrana interna,
peptidoglicano y membrana externa,
Mientras que en las Gram (+) sólo
encontramos dos anclas: en la membrana
citoplasmática y en el peptidoglicano. Luego
le sigue una estructura llamada gancho, que
es curva, y el filamento. En general, cuando las bacterias tienen cápsula y la tienen expresada, no expresan
el flagelo y viceversa. Es importante recordar que al flagelo se le llama antígeno H. Las funciones del flagelo
son motilidad y adherencia. El flagelo gasta energía, la que viene principalmente de ATP. El flagelo presenta
una especie de motor que es el que permite que gire, además el ancla interna funciona como switch,
permitiendo que gire para un lado o para el otro.

Síntesis
El flagelo es hueco y sintetiza primeramente el motor interno,
que permite que las proteínas de la punta del flagelo pasen a
través de él. Para, finalmente, extender el filamento. Los
componentes del flagelo son transportados hasta la punta de
este por dentro.

Evolución
El sistema de secreción de tipo III es una especie de jeringa que
tienen las bacterias con la que es capaz de inyectar cosas para tomar control del metabolismo de otra célula.
Las bacterias que usan este sistema suelen ser las entéricas. Lo relevante de esto es que esta jeringa
bacteriana presenta las mismas anclas que el flagelo, un gancho recto y un filamento que también es recto.
Entre el flagelo y el sistema de secreción de tipo III existen relaciones estructurales que podrían darnos
indicios de relación evolutiva entre estas estructuras.

Distribución
No todas las bacterias presentan sus flagelos en la misma disposición, lo que es de
gran relevancia para el diagnóstico clínico. La microscopía electrónica es la más útil
para identificar los flagelos. Existen diferentes tipos de distribución flagelar:
1. Flagelo monótrico o polar: El flagelo es único y se encuentra en un solo
polo. (V. cholerae)
2. Flagelo anfítrico: Existe un flagelo en cada polo de la célula (Spirillum sp.)
3. Flagelo lofótrico: Existen muchos flagelos en forma de penacho
(Helicobacter pylori)

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4. Flagelo perítrico: Los flagelos se encuentran alrededor de toda la bacteria (Salmonella enteritidis)

Motilidad bacteriana
Cuando los flagelos giran todos en una sola dirección la bacteria
se mueve en un solo sentido. Después de un tiempo se cambia
el switch y los flagelos se desordenan. Luego los flagelos al
ordenarse cambian de dirección y vuelven a generar un
movimiento unidireccional. La frecuencia con la que el switch se
cambia está determinada por los receptores ubicados en la
membrana interna de la bacteria. Por ejemplo, al censar un
atrayente como la glucosa, la bacteria
comienza a moverse en una dirección, luego
censa si se está acercando o alejando y
según eso cambia su dirección de
movimiento cambiando el switch. A esto se
le llama quimiotaxia. En el caso A, la
bacteria se está moviendo de forma aleatoria
sin estímulo alguno. En el caso B
encontramos cómo se mueve hacia un
atrayente.

Fimbrias
También son apéndices proteicos, pero son inmóviles y más simples. Corresponden a protrusiones de
proteínas, relativamente cortas. Su única función es la adherencia a través de sus puntas que son pegajosas.
Las bacterias son capaces de sintetizar distintos tipos de fimbrias dependiendo del ciclo de vida de su
infección para hacerla más eficiente. Existen tipos de fimbrias:
1. Perítricas: Se encuentran en toda la superficie.
2. Curli: Rodean a toda la bacteria.
3. Pili de tipo IV: Es un tipo especial de fimbria que es más larga.
4. Pili sexual: Tiene como función especial adherirse a otras bacterias. Es retráctil, captura y atrae otra
bacteria con la genera un puente y puede hacer traspaso de material genético.

Esporas

No son estructuras reproductivas, sino de protección ante condiciones adversas.


Existen dos géneros importantes que infectan al ser humano y son Clostridium y
Bacillus. Es un proceso de diferenciación celular que se caracteriza porque todo el
material genético queda condensado y protegido por sus propias proteínas. La posición
de la espora depende de la especie y pueden ser centrales, subterminales y terminales,
dibujadas en orden en la imagen de la derecha. Existe solamente una espora por

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bacteria, por lo que al ver las esporas puedo asegurarme de la cantidad de bacterias existentes. Para llevarse
a cabo este proceso se realiza una diferenciación del ADN en una forma condensada, y luego las proteínas lo
cubren.

Germinación de la espora
1. Activación de la espora: Bajo condiciones favorables de temperatura y nutrientes la espora se activa.
2. Germinación: Proceso de diferenciación inversa.
3. Crecimiento: La espora vuelve a ser una bacteria vegetativa que puede reproducirse y es susceptible
a antibióticos.

Cuerpos de inclusión

Corresponden a depósitos de metabolitos y nutrientes no membranosos, sólo son corpúsculos de materiales


mayoritariamente insolubles como azufre, PHB, que es un polímero de carbohidratos, glicógeno, etc.

Ribosomas

Corresponden a partículas ribonucleoproteicas de 70s. Su función es la síntesis de proteínas. Están


compuestos por dos subunidades de diferente peso. Podemos encontrar miles de ellos en el citoplasma
bacteriano.

Clase 6
Tema 4: Genética bacteriana

Recordemos que el genotipo es todo el patrimonio genético de un organismo, es decir, la presencia o


ausencia de genes. La presencia de un gen no implica necesariamente que este gen se exprese, esto
corresponde al fenotipo. Ciertos genes pueden estar silenciados, por ejemplo, una bacteria puede tener el
gen de una toxina, pero no expresarla nunca. Esto es muy importante en el diagnóstico clínico de patógeno s,
ya que existen ciertos criterios de identificación de patógenos a través de pruebas moleculares. Por ejemplo,
Clostridium es una bacteria fastidiosa, por lo que su diagnóstico a través de las técnicas corrientes es más
difícil, entonces se realizan pruebas moleculares ya que no requieren un cultivo axénico y son seguras y
confiables. Existen dos técnicas principales para identificar a Clostridium, la primera se enfoca en buscar sus
toxinas que son de tipo AB, pero no se buscan las toxinas en sí, sino sus genes. Se toma la muestra de
heces del paciente y a través de las técnicas que ya discutimos, se busca la presencia de estos genes. Sin
embargo, últimamente se han encontrado ciertas cepas de Clostridium que, a pesar de presentar los genes
para las toxinas, no la expresan, lo que nos puede llevar a confusión, pensando que una cepa es mucho más
agresiva de lo que realmente es, por lo tanto, ahora además se busca la presencia de las proteínas,
constituyendo la segunda técnica mencionada.

Un gen corresponde a una secuencia de ácidos nucleicos (ADN o ARN) que codifica para un producto, el que
puede ser ARN o proteínas. Por convención, para escribir genes o secuencias de nucleótidos de ADN, se
escribe una sola hebra, ya que la que la acompaña es complementaria a ella y siempre se escribe desde el 3’
al 5’. Recordemos que los ácidos nucleicos están constituidos por tres grupos importantes, el fosfato, la
pentosa y la base nitrogenada. Se numeran los carbonos de los grupos y el más importante es el que lleva
sus carbonos sin prima, en este caso es la base nitrogenada, en cambio la pentosa lleva primas después de
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su numeración, así es que en el 5’ encontramos el fosfato y en el 3’ el OH. Sabemos que cuando se
polimeriza el ADN el 5’ ataca al 3’ y se dice que se polimeriza del 5’ al 3’, lo que significa que se polimeriza
hacia el lado del OH. Existen algunos antimicrobianos que se basan en esta propiedad que se llaman
análogos de nucleótidos. Los análogos de nucleótidos no presentan todas las piezas que sí presentan los
nucleótidos reales, con lo que interrumpen la polimerización, por lo que la transcripción constituye un blanco
antimicrobiano importante. A diferencia de los microbios, el sistema de polimerización de ADN de los seres
humanos es muy quisquilloso y no polimeriza con análogos, por lo que este tipo de terapias no nos afectan.

Estructura de un gen

En este esquema la línea


representa una secuencia. La
primera región importante que
conocer es la región codificante o
marco de lectura abierta, que es la
región que contiene la información
que codifica para las proteínas.
Recordemos que en el caso de los
procariontes no existen intrones,
por lo que todo el OFR se lee. Éste
inicia con el codón de inicio
(generalmente ATG) y termina con
el codón de término (TAA, TGA o TAG). Sin embargo, sabemos que la secuencia contenida en la región
codificante no es suficiente para obtener una proteína, por lo que el gen presenta algunas regiones
adicionales importantes para la formación de proteínas. Río arriba encontramos varios elementos, la región
promotora que va en el nucleótido -10 y -35 y sirve para reclutar la ARN polimerasa. La región regulatoria,
que cuando se encuentra río arriba al promotor, se acopla a la polimerasa para ayudar en la transcripción
(regulador positivo). Existen otros casos en los que la región regulatoria se encuentra río abajo, por lo que si
la región promotora recluta a la polimerasa, esta se quedará detenida, constituyendo un regulador negativo.
Existen antibióticos orientados específicamente a afectar la actividad de la ARNpol. Existe también la región
RDS, que es específica de unión al ribosoma, existen secuencias parecidas en eucariontes y procariontes, en
eucariontes se le llama región de Kozak y en procariontes se llama de Shine-Dalgarno. La última zona que se
transcribe constituye el llamado terminador, que pretende mantener su estabilidad. En eucariontes esta
región corresponde a la cola poli A, en cambio en procariontes ésta puede ser variable. Toda la región río
arriba que se transcribe, pero no se traduce, se llama 5’ UTR (5’ untranslated region) y toda la región río
debajo de la misma característica se llama 3’ UTR.

Código genético

Es importante recordar que el código genético es degenerado, lo que significa que existe más de un codón
para el mismo aminoácido. Esto genera un concepto llamado uso de codones. Existen bacterias que tienen
preferencias en su uso de codones determinada por la abundancia de anticodones en su ARNt, por ejemplo,
puede existir una bacteria que presente 98% de un anticodón específico. Esto es importante ya que el uso de
codones es una marca evolutiva. El uso de codones es cercano entre las que se relacionan
filogenéticamente. Además, para la biotecnología también es muy importante, por ejemplo, si encontramos
una bacteria del difícil de cultivar, pero que produce determinado antibiótico y queremos producirlo, si

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metemos ese gen en E. coli, muy probablemente sus usos de anticodones sean muy diferentes, por lo que
deberemos adecuar el gen y adaptarlo al uso de codones de E. coli.

Mecanismos de variabilidad genética

Sabemos que la mayor fuente de variabilidad genética en eucariontes es el sexo, dada por crossing over y
permutación, ambas dadas en la meiosis. En cambio, en el caso de las bacterias que no realizan sexo,
presentan otros mecanismos de variabilidad. Esto es importante para la clínica desde dos puntos de vista, el
primero, ya las bacterias se adaptan constantemente a nuestro sistema inmune, y segundo también se
adaptan a la presencia de antibióticos. Las bacterias presentan dos grandes fuentes de variabilidad, las
mutaciones y la transferencia horizontal de material genético.

Mutaciones
Se definen como cambios heredables en la secuencia de los nucleótidos de los genes propios. Estos cambios
no necesariamente son malos para el organismo, pueden ser buenos e incluso neutros. Esto depende del
medio ambiente en el que se encuentre. Existen mutaciones génicas y regulatorias, las que tienen
consecuencias diferentes.

Conceptos de evolución y su relación con la resistencia a antibióticos


Para Lamarck y Darwin la variabilidad y el ambiente son los conceptos que definen la
evolución, pero los tomaban de manera diferente. Para Lamarck el ambiente dirigía la
variabilidad de manera unidireccional, como una necesidad requerida por el ambiente y
que soluciona un problema. Para Darwin la variabilidad es al azar y el ambiente escoge
cuál de las variables sobrevive bajo sus condiciones. Efectivamente las mutaciones son al
azar y son escogidas, por ejemplo, la pérdida de un gen que codifica a una porina puede
hacer que los nutrientes dejen de entrar a la bacteria de manera eficiente como pueden
volverla resistente a algún antibiótico que requiera entrar por ellas. Entonces, si en el
ambiente existe el antibiótico, la cepa sin porina es la que sobrevive, pero en un ambiente
pobre en nutrientes, la cepa con porinas es la escogida.
Concepto de fitness
Se refiere a la capacidad de adaptarse al medio. Decimos que, si la mutación permite
que el organismo se adapte mejor al medio, incrementa el fitness, y ese fitness cambia
dependiendo del medio.
Si a una población, luego de administrarle antibióticos indiscriminadamente, se quitan los
antibióticos, si las mutaciones resistentes no son negativas, la frecuencia de la resistencia
se mantiene constante. También es importante destacar que la tasa de mutaciones se
mantiene con y sin antibióticos. Sólo se escoge y aumenta la supervivencia de la mutación
resistente.

Mutaciones regulatorias: Ocurren en la zona regulatoria, esta regula cuánto y cuándo se produce una
proteína. Las mutaciones regulatorias afectan ambas regulaciones, produciendo, por ejemplo, que la bacteria
se vuelva inofensiva o letal cambiando la expresión, pero no modificando la secuencia de la proteína en sí.

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Mutaciones génicas: Ocurren dentro del ORF, incidiendo en la naturaleza del producto, pudiendo ser que, por
ejemplo, una toxina sea más o menos tóxica, que sea o no reconocida por anticuerpos, etc.
A la expresión normal de los genes se le llama tipo silvestre o wild type (WT).

Mutación silente
Cambia una base por otra, pero ambas
producen el mismo aminoácido y no tiene
efecto a menos que el uso de codones
sea muy diferente y no se pueda producir
la proteína.

Mutación de sentido equivocado


En mutación missense cambia el
aminoácido codificado. Ésta puede o no
tener efectos y depende de la posición
que tenga el aminoácido dentro de la
proteína, por ejemplo, si cambio un
aminoácido fundamental para el sitio
activo de una enzima, o que tenga una función fundamental dentro del plegamiento proteico, el efecto
será muy grande, pero si cambio un aminoácido periférico la mutación puede llegar a ser incluso
inofensiva. También depende de la carga del aminoácido, por ejemplo, en las proteínas transmembrana,
sería catastrófico cambiar un aminoácido hidrofóbico por uno hidrofílico.

Mutaciones sin sentido


Ocurren cuando el codón del aminoácido cambia por un codón de término generando una proteína
trunca. El impacto de la mutación depende de la posición del aminoácido cambiado, si trunco la proteína
al inicio, esta no será funcional, en cambio, si trunco la proteína al final, posiblemente aun pueda realizar
su función.

Deleciones
Se refiere a una pérdida de un nucleótido, lo que
cambia el marco de lectura de una proteína
produciendo una completamente diferente.

Inserciones
Se refiere a la ganancia de un nucleótido, lo que
también cambia por completo el marco de lectura de
una proteína.

El efecto de estas dos últimas suele ser muy marcado.

Transferencia horizontal de material genético


Se define por la adquisición de material genético nuevo. Es un fenómeno biológico en el cual las bacterias
son capaces de adquirir genes nuevos. Las mutaciones habitualmente conllevan cambios pequeños y
graduales, por el contrario, si se gana un gen nuevo se produce lo que se llama un salto cuántico evolutivo,
en el que las bacterias mutan rápidamente. Este proceso se puede llevar a cabo de tres formas: conjugación,
transducción y transformación.

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Elementos genéticos importantes: Para este proceso existen elementos que son los que permiten la
transferencia horizontal y se pueden dividir en dos grupos:

Elementos no transferibles
No pueden salir de la bacteria.
1. Cromosoma bacteriano: Contiene todos los genes necesarios para que la bacteria realice
sus funciones básicas.

Elementos transferibles
Se pueden traspasar de una bacteria a otra.
1. Plásmidos: Son episomas, es decir, que son independientes del cromosoma. Son una especie
de mini cromosomas independientes. Tienen la característica de ser replicones autónomos,
siendo capaz de auto perpetuarse. Contienen genes no esenciales, como resistencias o
toxinas. Existen fijos y transferibles, los fijos sólo se transfieren a las bacterias hijas, en cambio
las transferibles pueden traspasarse a otras bacterias. Los plásmidos transferibles presentan
dos secuencias importantes:
a. Ori T: Es la zona en la que la maquinaria de transferencia toma al plásmido para
transferirlo.
b. Tra: Son varios genes que codifican la maquinaria para transferir el plásmido, que toma
desde la zona T al plásmido y lo traspasa. Existen especie-específicas y promiscuas.
2. Bacteriófagos
3. Transposones: Corresponden a elementos genéticos capaces de saltar dentro del genoma.
Realiza un proceso que se llama recombinación no homóloga. Recordemos que la
recombinación homóloga es un proceso en el que se produce intercambio entre regiones
parecidas del genoma, un ejemplo de esto es el crossing over, en cambio, los transposones
tienen la capacidad de insertarse en cualquier parte del cromosoma y no necesitan parecerse
en nada. Existen dos tipos de transposones.
a. Simples o secuencias de inserción (IS):
Solamente tienen un gen que se llama
transposasa, que realiza todas las funciones
del salto, flanqueada por dos regiones
duplicadas de ADN. Cuando la hebra se
relaja estas regiones duplicadas se
complementan formando una horquilla.
Cuando la transposasa se expresa, corta sólo
en este tipo de regiones con horquilla y es
ella misma la que vuelve a insertar su propio
gen en cualquier otra región del genoma.
b. Compuestos: Corresponden a uno o varios genes entre dos secuencias de inserción.
Se genera gracias a la transposición de transposones simples. De estas secuencias se
pueden transponer las IS por separado o más de alguna, formando una horquilla que
contenga genes transposables, por ejemplo, de resistencia a antibióticos. No se sabe
por qué, pero el exceso de producción de transposasa es negativo, por lo que una de
las copias tiende a acumular mutaciones e inactivarse. La inserción de una IS puede
provocar la inactivación de un gen o la posibilidad de transponer genes importantes,
otorgando variabilidad genética.
Además, los transposones pueden saltar a plásmidos, entonces, existe la posibilidad de que un
gran transposón compuesto con varios genes de resistencia salte a un plásmido transferible.

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4. Integrones: Son estructuras genéticas que
presentan el gen de la integrasa (Int), parecido
al de la transposasa ya que también es una
Int Gen 1
integrasa, pero siempre realizan la integración
en un sitio determinado (zona att). Existe una
región promotora fuerte (P), lo que significa
que se expresa en alta cantidad, una región Gen 2
ATT o de attachment, que es una secuencia
genética que es el blanco de la integrasa. Entonces si un gen de resistencia se ubica río abajo
de una integrasa, se va a expresar en alta cantidad. Lo que hacen los Integrones es ordenar
los genes, coleccionando los de resistencia en un solo locus. A través de las leyes de Morgan
podemos inferir que la existencia de este locus único constituye una fuente muy peligrosa de
resistencia antibiótica.

Elementos fijos
1. Cromosoma bacteriano.

Conjugación: Se lleva a cabo la transferencia plásmidos desde una bacteria que presente el plásmido (+) a
una que no lo contenga (-) a través de un pilus sexual codificado en la zona tra. Se traspasa una de las dos
hebras, copiándose. Las bacterias + no pueden volver a recibir un plásmido de la misma familia, pero sí
pueden donarlo, en cambio las bacterias - no pueden donar, pero sí recibirlos.

Las bacterias expertas en realizar conjugación son los enterococos y entre sus genes transferibles se
encuentran más de ocho genes de resistencia a vancomicina. En un inicio, S. aureus fue tratada con
penicilina, pero generó resistencia. Luego se comenzó a utilizar una familia derivada, la meticilina, que
funciona bien para las penicilina-resistentes. Sin embargo, desarrollaron resistencia a meticilina también,
surgiendo los llamados MRSA, contra los que sólo se puede usar vancomicina. Es por esta razón que los
pacientes con MRSA son aislados para que no surjan MRSA resistentes a vancomicina.

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Transducción: A diferencia de la
conjugación, no requiere contacto
íntimo entre bacterias, ya que se
lleva a cabo a través de
bacteriófagos que actúan como
vector. Recordemos que los
bacteriófagos son virus que
parasitan bacterias tomando
control de su maquinaria
metabólica, insertando su
material genético y replicándolo
dentro de ella. Además, cortan el
cromosoma bacteriano. Utilizan
este metabolismo para sintetizar
sus cápsides y reencapsular el
material genético viral, para por
último generar la lisis bacteriana.
Algunos fagos en vez de empacar
su material genético empacan el
de la bacteria, generando una partícula transductante, que es la que, al infectar otra bacteria, inserta ese
material genético bacteriano, que puede tener genes buenos y malos para la bacteria infectada por el
transductante. Cabe destacar que puede transducirse cualquier segmento del genoma bacteriano.

Clase 7
Transformación: Se define como el
proceso por el cual las bacterias
captan ADN libre proveniente de
fragmentos libres en el ambiente
debido a lisis, por ejemplo. A la
bacteria que capta el ADN se le llama
bacteria competente. No todas
bacterias son competentes de manera
natural, como E. coli, pero puede
volverse competente debido a ciertas
condiciones ambientales. Un ejemplo
de bacteria naturalmente competente
es H. pylori. Las bacterias
competentes al incorporar el ADN
foráneo pueden cortar las hebras y
utilizar los nucleótidos, o, si no logra degradar la hebra, esta se incorporará el genoma, volviéndose una
bacteria llamada transformante. La ganancia de genes foráneos es un proceso muy sencillo.

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Tema 5: Metabolismo y crecimiento bacteriano

Los seres vivos estamos en desequilibrio con el medio ambiente, si estuviéramos en equilibrio no podríamos
vivir, ya que es flujo de materia y energía es el que nos permite la vida. Un ejemplo de esto es la temperatura,
nuestra temperatura corporal es de 37°C y el del exterior es generalmente menor. Este concepto es muy
distinto a la homeostasis, que se refiere al equilibrio interno de nuestro organismo.
El metabolismo es el conjunto de reacciones químicas que le permiten a los seres vivos la mantención del
desequilibrio con el medio ambiente para permitir la vida. Se divide en dos grandes tipos de reacciones:
catabolismo y anabolismo. En el catabolismo se libera energía, la materia converge a moléculas más simples
y se produce oxidación. En el anabolismo se produce lo contrario, se consume energía, se complejizan las
moléculas y se produce reducción.

Formas tóxicas del oxigeno

Los procesos de respiración bacterianos son procesos catabólicos normales. En ellos existen ciertos
desechos que son formas tóxicas del oxígeno. Normalmente el oxígeno, que es el aceptor final de electrones,
se trasforma en agua que es inocua, pero también es frecuente la formación de especies reactivas del
oxígeno, como lo son el superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo. Las bacterias son capaces
de resistir a estos compuestos a través se diferentes mecanismos. Todas las bacterias aeróbicas producen
estos compuestos, presentando enzimas que los degraden y dónde se encuentren estas enzimas nos permite
clasificar a los organismos. Estas son:
a) Catalasa: Tiene que ver con la degradación del
peróxido de hidrógeno, transformándola en agua y
oxígeno. No todas las bacterias presentan catalasa,
pero sí pueden presentar peroxidasa.
b) Peroxidasa: Ocupa el poder reductor para reducir el
agua oxigenada a agua.
c) Superóxido dismutasa: Está orientada al anión
superóxido, transformándolo en agua oxigenada.
d) Superóxido dismutasa combinada con catalasa: La
catalasa transforma en agua y oxígeno el agua
oxigenada producida por superóxido dismutasa.
e) Superóxido reductasa: ocupa el citocromo C reducido como fuente de electrones para reducir
al anión superóxido.

Prueba de la catalasa
La catalasa y la peroxidasa tienen el fin de reducir la concentración de
peróxido de hidrógeno, con la diferencia de que la catalasa libera oxígeno
y la peroxidasa no. Esto es importante desde el punto de vista clínico ya
que con esta característica puedo determinar la presencia de catalasa en
algún microorganismo. Esta prueba me permite diferenciar dos grandes
grupos de bacterias muy relevantes, por ejemplo, tenemos los
Staphylococcus y Streptococcus, que tienen en común que son Gram (+).
Al microscopio es difícil diferenciar los racimos de las cadenas por acción de la técnica, pero sí sabemos que
los Staphylococcus son catalasa (+) y los Streptococcus son catalasa (-). Para crecer bacterias catalasa (-)
debemos protegerlas del estrés oxidativo, cultivándolas en presencia de catalasa, por ejemplo, con un agar
sangre. Entonces en clínica cuando se sospecha Cocáceas Gram (+) siempre se siembra en agar sangre.
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Clasificaciones de microorganismos relacionadas al metabolismo

Clasificación según tolerancia al oxígeno


1. Anaerobias estrictas: Carecen de las enzimas desoxidantes, por lo que mueren en presencia de
oxígeno soportando máximo entre 2 y 30 minutos. Por ejemplo, Clostridium es anaerobia estricta.
2. Anaerobias moderadas: Soportan ciertas presiones de oxígeno ya que presentan alguna de las
enzimas mencionadas, pero no es muy eficiente, soportando entre 60 y 90 minutos en presencia de
oxígeno.
3. Anaerobias aerotolerantes: Poseen un nivel mayor de las enzimas mencionadas. Entre ellas
encontramos Lactobacillus spp. Y Leuconostoc spp.
4. Microaerófilas: Sobreviven a presiones de oxígeno menores a la atmosférica y son capnofílicas, es
decir, requieren dióxido de carbono además de un poco de oxígeno.
5. Anaerobias facultativas: Casi todas las bacterias importantes en clínica lo son. Pueden realizar
metabolismo aeróbico y anaeróbico con igual eficiencia, pero tienden a preferir el metabolismo
aerobio, ya que la energía otorgada por el oxígeno es mayor. Por ejemplo, E. coli en el intestino, que
presenta muy bajas concentraciones de oxígeno. Bacterias como Salmonella activan su mecanismo
de infección utilizando como estímulo la baja concentración de oxígeno que hay en el intestino.
6. Aerobias estrictas: Sólo crecen en presencia de oxígeno ya que no pueden realizar respiración
anaerobia ni fermentación.

Forma de cultivar los microorganismos según su tolerancia al oxígeno


Anaerobias estrictas Cámara anaeróbica: Cámara de cultivo especial, hermética, a la que se le
Anaerobias moderadas inyecta N2 y se elimina el O2.
A una jarra GasPak se le agregan catalizadores que absorben el oxígeno
Anaerobias aerotolerantes
para que sobrevivan.
Se inserta la placa en una jarra con una vela y se tapa. La vela consume
Microaerófilas
O2 y produce CO2 en niveles propicios.
Anaerobias facultativas Al aire libre o en agitadores.
Aerobias estrictas Se cultivan habitualmente en agitadores para que el cultivo se oxigene.

Clasificación según su fuente de energía


1. Fotótrofos: Utilizan la luz como fuente de energía. También hay dos tipos:
a. Metabolismo cíclico: Hace que el electrón se mueva de forma cíclica transportando la energía
del sol.
b. Metabolismo lineal
2. Quimiótrofos: Utilizan reacciones químicas como fuente de energía. Hay de dos tipos:
a. Quimiolitrótofos: Utilizan compuestos inorgánicos.
b. Quimioorganótrofos: Utilizan compuestos orgánicos.
En general, los compuestos orgánicos están más reducidos que los inorgánicos, por lo que son más
eficientes para la obtención de energía. Por esta misma razón es que en general se utiliza oxígeno gaseoso
como aceptor de electrones ya que es el que más potencial de óxido-reducción me produce con respecto a el
alimento y me permite un proceso más eficiente.

Clasificación de acuerdo con la fuente de carbono


1. Heterótrofos: Utiliza compuestos orgánicos como fuente de carbono (carbono reducido).
2. Autótrofos: Utiliza dióxido de carbono como fuente de carbono (carbono oxidado).

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Crecimiento bacteriano

Para hablar de esto, debemos definir algunos conceptos:


1. Crecimiento: Aumento del número de individuos en una población.
2. Velocidad de crecimiento: Crecimiento por unidad de tiempo.
3. Tiempo de generación (g): Tiempo requerido para que la población se duplique.

Debido a que las bacterias se multiplican por


fisión binaria, el crecimiento bacteriano está
dado de manera exponencial, por lo tanto,
para poder calcular el número de bacterias en
el tiempo aplicamos la siguiente fórmula:

𝑁° 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑠 × 2𝑔

Esto implica que las bacterias crezcan de una forma que se conoce como crecimiento logarítmico. Existen
dos tipos de crecimiento, uno aritmético, que implica que la cantidad de individuos crece de forma constante
en el tiempo. Las bacterias no tienen este tipo de crecimiento ya que éste no es infinito, sino que tiene un
límite llamado capacidad de carga (q), que es el número máximo de individuos de una especie que puede
soportar un ambiente y está dado por el espacio, disponibilidad de nutrientes y/o acumulación de desechos.
El crecimiento logarítmico real está dado por el siguiente gráfico y presenta etapas:

1. Etapa lag: Es la primera del crecimiento bacteriano, que es lento. La bacteria está apagando y
encendiendo genes para poder adaptarse al ambiente nuevo. Esta etapa es variable en duración.
2. Etapa exponencial: Es la etapa que se caracteriza porque ocurre el mayor crecimiento posible.
3. Etapa estacionaria: Se forma una meseta ya que se alcanza la capacidad de carga. No incrementa la
población. La tasa de división se equipara con la tasa de muerte.
4. Etapa de muerte: Las bacterias comienzan a decaer en su población. Cada cierto tiempo las bacterias
que se mueren funcionan de alimento para las que quedan, por lo que esta etapa presenta una curva
oscilante.
Los cultivos que presentan este tipo de crecimiento normalmente son cultivados en un cultivo Batch cerrado,
ya que los nutrientes se acaban. Existe además otro tipo de cultivo que se llama cultivo continuo, en el que
existe una zona de ingreso de nutrientes y una zona de egreso de desechos, por lo que se mantiene siempre
en etapa exponencial.
Capi, 2018
Uno siempre escucha que la carne que uno saca del congelador no se puede volver a congelar, esto se debe
a que al descongelar la carne activo la proliferación bacteriana, y al volver a congelarla vuelvo a detenerla,
pero con una mayor población que puede ser nociva para nosotros.

Capi, 2018

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