Cromatografía de papel, Separación de compuestos Orgánicos

CROMATOGRAFÍA DE PAPEL, SEPARACIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS

I. Fundamentos teóricos:
La cromatografía es una técnica de separación basada en el principio de retención
selectiva, que permite separar los distintos componentes de una mezcla facilitando su
identificación y cuantificación. El nombre de la técnica se debe al botánico ruso Mikhail
Semenovich Tswett, quien usó columnas de vidrio rellenas de carbonato de calcio para
separar pigmentos vegetales.
Las técnicas cromatográficas son muy variadas, sin embargo, en todas el fenómeno de
separación ocurre al hacer pasar una fase móvil fluida (gas, líquido o fluido supercrítico),
que arrastra a la mezcla, a través de una fase estacionaria constituida por un sólido
finamente dividido o un líquido fijado en un sólido. En este proceso los componentes de la
mezcla interaccionan de diversa manera con la fase estacionaria y debido a esto
atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades, por lo cual se van separando.
De acuerdo a cómo esté dispuesta la fase estacionaria las técnicas cromatográficas se
pueden dividir en:
1. Cromatografía plana:
La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales
técnicas son:
• Cromatografía en papel
• Cromatografía en capa fina
2. Cromatografía en columna:
La fase estacionaria se sitúa dentro de un tubo o columna. Según el tipo de fluido
empleado como fase móvil se distinguen:
• Cromatografía de líquidos
• Cromatografía de gases y
• Cromatografía de fluidos supercríticos
3. La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar
análisis cualitativos ya es sencilla de implementar y no requiere de equipamiento
sofisticado. En esta técnica la fase estacionaria está constituida simplemente por una tira

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o circulo de papel de filtro. La muestra se deposita en un

extremo colocando pequeñas gotas de una solución de la
muestra y evaporando el disolvente luego de cada aplicación.
Luego el disolvente o mezcla de disolventes empleada como
fase móvil (eluente o eluyente) se hace ascender por
capilaridad. Para esto se coloca una porción del papel en
contacto con la fase móvil dentro de un recipiente que la
contiene (cámara de desarrollo). Después de unos minutos,
cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al borde
extremo del papel, se retira el papel y seca. Es importante
que la cámara de desarrollo permanezca bien tapada durante
el proceso de ascenso capilar de la fase móvil (desarrollo
cromatográfico), pues de lo contrario no se alcanza el
equilibrio necesario entre el líquido (fase móvil) y el vapor del
líquido. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias
tienen color propio se deberán ver manchas de distinto color separadas a lo largo del
papel. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de
revelado.
La cromatografía es un sistema de separación dinámica, porque continuamente se
producen equilibrios entre los componentes de la mezcla a separar y las fases móvil y
estacionaria. El proceso de separación se produce a causa de las interacciones entre los
componentes de la mezcla con la fase móvil y la fase estacionaria; lo cual causa la
distribución de los componentes de la mezcla entre las dos fases. A este proceso se le
denomina partición de los componentes. Las interacciones mencionadas pueden tener su
origen en dos fenómenos:
1. La adsorción, que es un fenómeno de interacción superficial por el cual átomos, iones o
moléculas son retenidas en la superficie de un material. Puede ser de dos tipos: a)
Fisisorción, debida a fuerzas atractivas débiles, generalmente fuerzas de Van der Waals; es
la forma más simple de adsorción.

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b) La quimisorción ocurre cuando se forma un enlace químico

2. La absorción, es un fenómeno de retención que incluye la penetración de una especie
química en todo el volumen del material por lo cual se la considera como un fenómeno
másico y no superficial.
Un ejemplo de absorción es la disolución de una especie en un disolvente.

Principales parámetros cromatográficos.

• Coeficiente de partición o de reparto de un componente (K): Se define como el
cociente entre la concentración de componente presente en la fase estacionaria y la
concentración de componente presente en la fase móvil.
• Frente del eluente: máximo recorrido de la fase móvil
• Frente del analito: máximo recorrido del analito; entendiéndose por analito cada uno de
los componentes individuales de la mezcla.
• Relación de recorridos o frentes (Rf): Cociente entre el frente de cada analito y el frente
del eluente.

II. Práctica de Cromatografía en papel

OBJETIVO:

Conocer la cromatografía como técnica de separación de mezclas de sustancias, sus

características y los factores que en ella intervienen.

Ser competente para separar diferentes mezclas por medio de la cromatografía en papel,
así como una extracción por solvente, además de conocer sus bases por mecanismos de
transferencia.

PROCESO:

En esta práctica comprobaras que la pigmentación de una hoja de un vegetal superior se

debe a la mezcla de varias sustancias diferentes. La clorofila, propiamente dicha que se

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encentra en dos formas diferentes: Clorofila A y B, los carotenos, las xantofilas y los
antocianos.

Los colores desarrollados en el cromatograma son:

Carotenos (naranja), Xantofilas (amarillo), clorofila a (verde amarillento), clorofila b (verde

azulado), antocianos (Pardo en el lugar de aplicación) 2.- Los colores componentes de
varias mezclas de colorantes (tintas e indicadores) 3.- La influencia del disolvente e la
separación de los componentes de la mezcla.

El mecanismo de transferencia

Extracción por solvente

Los pigmentos de las plantas se encuentran en el interior de la célula vegetal,

específicamente en una organel llamada cloroplasto. Los cloroplastos son plastidos que
contienen pigmentos clorofílicos. Los compuestos clorofílicos están ligados químicamente
con las estructuras internas de los cloroplastos, y se hallan retenidos en estado coloidal
asociados con las clorofilas, existen también en los cloroplastos dos clases de pigmentos
amarillos y amarillo-anaranjados que son las xantofilas y carotenoides

Los pigmentos clorofílicos son insolubles en el soporte universal llamado agua. Pero si son
solubles (afinidad química) en solventes orgánicos como por ejemplo alcohol etílico y
acetona. A los solventes que extraen simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se
los suele llamar extractores. Existen otros tipos de solventes que presentan afinidad por
algunos pigmentos y se los llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de
carbono y el éter de petróleo. En dichas reacciones encontramos la transferencia de masa
que se emplea en este mecanismo que es extracción por solvente.

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Material Reactivos
Mortero Alcohol del 96º
Papel filtro Arena
Embudo
Vaso de precipitado
Caja Petri

PROCEDIMIENTO

Extracción de pigmentos: Colocar en un mortero trozos de hojas lavadas (quitando las

nerviaciones más gruesas) junto con 50 0 60 ml de alcohol de 96º y una cucharadita de
arena. Triturar sin golpear hasta que el líquido adquiera una coloración verde intensa
filtrar, recogiendo el filtrado en un matraz.

Se obtienen así una solución en alcohol de pigmentos.

En una tira de papel coloca una gota de muestra a un centímetro de la base. En un vaso de
precipitados o probeta viere un poco de alcohol etílico u otro solvente que se te indique.
Introduce el papel de tal manera que el disolvente toque la base de este y espera para que
se corra el cromatograma.

Otro proceso para separar los pigmentos por extracción con solvente es:

1.- Se trituran las hojas en un mortero con 20 ml de alcohol y unos gramos de carbonato
de calcio

2.- Se filtra

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3.- Añadir 20 mililitros de gasolina y un poco de agua y se agita

4.- Se separan las fases en matraces un equipo de decantación

Observaciones

En la cromatografía de papel pudimos observar que al realizar tres veces el mismo

experimento con las mismas condiciones encontramos resultados similares, en este
método usamos el mecanismo de transferencia de masa de difusión donde la fase móvil
que era el disolvente (alcohol) arrastraba los distintos componentes de la muestra
colocada en el papel filtro, a través de la fase estacionaria que era precisamente el papel,
separando así sus diferentes componentes de acuerdo a las velocidades con las que se

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mueven cada uno de los componentes de la muestra. El disolvente es una parte de vital
importancia en la cromatografía de papel ya que al ser la fase móvil, su interacción con la
muestra y por tanto sus Rf dependerá de la naturaleza del mismo, basándose en el
principio de <<lo semejante disuelve lo semejante>> refiriéndose como semejante a la
polaridad del compuesto a analizar y la fase móvil.

En la extracción de las xantofilas del filtrado de las hojas llevamos a cabo un mecanismo
de transferencia de masa denominado extracción por solvente, donde como se
mencionaba antes, existen solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se
los llama separadores, en este caso el utilizado fue la gasolina que tiene gran afinidad por
las xantofilas, además de ser inerte en el medio, pudiendo observar rápidamente como se
realizaba la transferencia de masa dando lugar a dos fases que se apreciaron mejor
cuando se colocó la mezcla en una pera de separación, donde encontramos separados por
diferencia de densidad a las xantofilas en la parte inferior tornándose de un color amarillo
y en la parte superior las clorofilas tornándose de color verde.

Discusión de resultados

• Se colocó arena o Carbonato de calcio antes de comenzar a triturar para eliminar

agua (por deshidratación), la extracción de los pigmentos se realizó agregando
alcohol al momento de triturar la muestra para con ello tener un extracto más rico
en pigmentos, posteriormente se realizó una extracción liquido líquido por
solvente en el embudo de separación, el cual se realizó con gasolina, misma que
arrastro los componentes de xantofilas que se depositaron en el fondo del embudo
en una fase amarilla, y dejando a las clorofilas en la parte superior con una
tonalidad verde.

• Al realizar la cromatografía de papel en el que la fase estacionaria fue el papel y la

fase móvil fue el alcohol observamos como este último iba arrastrando los
componentes de la muestra a través de la fase estacionaria, terminando por
separar los componentes de la muestra con respecto a la velocidad con la que se
desplaza cada uno de los componentes de la muestra, dicho fenómeno también se

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puede calcular como Rf (Factor de retención) que se define como la relación que
existe entre la distancia recorrida por el analito y la distancia recorrida por el
diluyente, siendo los primeros que se separaron las clorofilas y los segundos las
xantofilas.

• Se observaron dos bandas con diferentes colores, aquellos que tenían mayor
afinidad con el disolvente en este caso las xantofilas que poseían mayor afinidad
con la gasolina, viajaban más rápido por lo que alcanzaron una mayor distancia
recorrida y por tanto un mayor Rf, estas se obtuvieron en menor cantidad y las
clorofilas en mayor cantidad ya que son aproximadamente el 75% de la
composición del extracto.

Conclusiones

Se obtuvieron los pigmentos fotosintéticos de la clorofila, que son los que le dan color
a las hojas de las plantas ya que la fotosíntesis es un proceso que permite a los
vegetales obtener la materia y la energía que necesitan para desarrollar sus funciones
vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos jóvenes de
pigmentos, capaces de captar la energía lumínica. En esta práctica se observó cómo
cambian las tonalidades de estos pigmentos fotosintéticos que componen a las plantas
y se encuentran en los cloroplastos de la célula vegetal y les dan color al reflejar o
transmitir la luz visible, además de que son los que constituyen el sustrato
fisicoquímico de la fotosíntesis.

Marilú León de la Cruz