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Evaluación de la actividad antimicrobiana de

extractos de plantas frente a cepas bacterianas
multiresistentes

Data · April 2013

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3 authors:

Román Y Ramírez-Rueda Adriana Pedraza

University of Campinas University of Boyaca
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Mery Nair Saenz Rodriguez

Universidad Nacional Autónoma de México
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óleos essenciais e substancias isoladas) frente microorganismos multiresistentes (bactérias, fungos e
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Evaluación de la actividad antimicrobiana de extractos de plantas frente a cepas

bacterianas multiresistentes

Evaluation of antimicrobial activity of plant extracts against multiresistant bacterial

strains
1* 1 1
Román Yesid Ramírez Rueda . Adriana María Pedraza Bernal . Mery Naír Sáenz Rodríguez
1
Universidad de Boyacá. * Autor responsable de la correspondencia. Universidad de Boyacá.
Tunja. Carrera 2 Este No 64-169. Teléfono (0*8) 745-0000 Ext. 1112. E-mail
ryramirez@uniboyaca.edu.co

Resumen

Objetivo: Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos metanólicos y diclorometánicos de

seis plantas contra bacterias multiresistentes. Materiales y métodos: Los extractos fueron
obtenidos de las hojas de cada planta estudiada por el método e extracción con solventes
(metanol y diclorometano) y secados en rotaevaporador. Para evaluar la actividad
antimicrobiana se utilizó la técnica de dilución en agar (adaptada del EUCAST) para determinar
la CMI probando cinco diluciones (10, 5, 2, 1 y 0,5 mg/ml) contra seis cepas bacterianas con
resistencia múltiple a los antibióticos. Todos los ensayos se realizaron por duplicado y se
o
incubaron 24 horas a 37 C. Resultados: De los doce extractos de plantas analizadas, dos
mostraron efecto inhibitorio. Los extractos de Helichrysum italicum inhibieron las bacterias
grampositivas en estudio (S. aureus ATCC 43300 y E. faecalis ATCC 51299). La CMI con el
extracto metanólico para las dos cepas mencionadas anteriormente fue 1,0 mg/ml y con el
extracto diclorometánico fue de 0,5 mg/ml. Conclusión: El estudio de las propiedades
medicinales de las plantas ha generado resultados que han aportado soluciones a
problemáticas tan importantes como la malaria. En este caso el tamizaje de seis especies
vegetales dio como resultado el hallazgo de un ejemplar cuyos extractos metanólicos y
diclorometánicos inhiben en bajas concentraciones dos cepas bacterianas multiresistentes.
Esto representa una nueva fuente potencial de moléculas que podrían ser utilizadas como
alternativa en la lucha contra la resistencia bacteriana.

Palabras clave: Extractos Vegetales, Plantas Medicinales, Helichrysum, Fitoterapia,

Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina

Abstract
Objective: To evaluate antimicrobial activity of dichloromethane and methanol extracts from six
plants against multi-resistant bacteria. Materials and methods: Extracts were obtained from
leaves of each plant studied using extraction with solvents method (methanol and
dichloromethane) and dried in a rotaevaporador. In order to evaluate antimicrobial activity agar
dilution technique was used (adapted from EUCAST) to determine MIC values of five dilutions
(10, 5, 2, 1 and 0.5 mg/ml) against six bacterial strains with multiple resistance to antibiotics. All
assays were performed in duplicate and incubated 24 hours at 37ºC. Results: From twelve
plant extracts tested, only two showed an inhibitory effect. Helichrysum italicum extracts showed
inhibition against gram-positive bacteria under study (S. aureus ATCC 43300 and E. faecalis
ATCC 51299). CMI of methanolic extract in before mentioned strains was 1.0 mg/ml and
dichloromethane extract was 0.5 mg/ml. Conclusion: Study of medicinal properties of plants
has generated results that have provided solutions to issues as important as malaria. In this
case screening from six plant species resulted in the finding of one of this with methanolic and
dichloromethane extracts of which at low concentrations inhibit two resistant bacterial strains.
This represents a potential source of new molecules that could be used as alternative against
anti-bacterial resistance.

Keywords: Plant Extracts, Plants Medicinal, Helichrysum, Phytotherapy, Methicillin-Resistant

Staphylococcus aureus

Introducción
El afán del hombre por desarrollar nuevas
estrategias para combatir las bacterias y su
resistencia a los antimicrobianos lo ha
llevado a probar nuevas fuentes de
antibióticos o sustancias que sirvan para
eliminarlas. Uno de estos recursos es la
fitoterapia, que desde la antigüedad ha sido
utilizada como fuente inagotable de
recursos terapéuticos por chamanes y
médicos brujos que por empirismo o
tradición han creado compuestos a base de
plantas para curar todo tipo de
enfermedades, incluidas las infecciones
bacterianas (1). Esta sabiduría popular ha
sido recientemente puesta en el ojo de la
ciencia, puesto que científicos alrededor del
mundo están empleando variadas técnicas
para conocer los secretos terapéuticos que
se esconden en las plantas. Ejemplo de lo
anterior son los múltiples estudios hechos
alrededor del mundo y el crecimiento en
publicaciones por búsqueda en PubMed
que se refleja en un aumento de
aproximadamente un 300%, siendo el
número de artículos publicados hasta
diciembre de 1994 de 167 lo que contrasta
con 307 encontrados hasta diciembre de
2004 (2).
Para este trabajo se utilizaron extractos
metanólicos y diclorometánicos de seis
plantas encontradas comúnmente del
altiplano cundiboyacense colombiano, los
cuales fueron evaluados para determinar
su capacidad inhibitoria frente a cepas
bacterianas con resistencia múltiple a los
antibióticos.
Materiales y Métodos
Obtención de los extractos: Las hojas de
Potentilla candicans, Borago officinalis,
Gnaphalium viravira, Caesalpinia spinosa,
Taraxacum officinalis y Helichrysum
italicum, fueron recolectadas,
o
posteriormente deshidratadas a 40 C y
finalmente pulverizadas. La extracción se
llevó a cabo con dos solventes
sucesivamente (primero con diclorometano
al 95% y luego con metanol al 95%)
poniendo en contacto una parte de la
planta con cinco del solvente (p/v) y
dejando esta mezcla en agitación continua
a bajas revoluciones por 24 horas a
temperatura ambiente. Una vez pasado
este tiempo el extracto diclorometánico se
filtró y la fase sólida (pulverizado de la
planta) se dejó secar a temperatura
ambiente para luego someterlo al mismo
Resultados
Non-peer-reviewed
procedimiento anterior pero con metanol,
obteniéndose después de este
procedimiento el extracto metanólico. Una
vez obtenidos ambos extractos se retiró el
solvente por medio de evaporación para lo
o
cual se utilizó un rotaevaporador a 40 C en
el caso del extracto diclorometánico y a
o
60 C en el metanólico hasta obtener un
material libre de solvente. Dicho material
obtenido se almacenó en envase de vidrio
ámbar y se refrigeró hasta el momento de
su uso.
Determinación de actividad
antimicrobiana: Los extractos
diclorometánicos y metanólicos de las seis
plantas anteriormente mencionadas se
probaron contra seis cepas bacterianas con
resistencia múltiple a los antibióticos:
Staphylococcus aureus ATCC 43300,
Enterococcus faecalis ATCC 51299,
Escherichia coli ATCC 35218,
Acinetobacter baumannii ATCC 19606,
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 y
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. La
técnica utilizada fue la dilución en agar,
tomada y adaptada de las técnicas usadas
por el EUCAST (European Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing) para
determinar la concentración mínima
inhibitoria (CMI) de agentes
antimicrobianos a bacterias no fastidiosas
(3). Para tal fin, se pesaron las cantidades
necesarias de cada extracto para obtener
cinco diluciones (10, 5, 2, 1 y 0,5 mg/ml)
con volumen final de 10 ml de agar por
cada una de las plantas estudiadas. Previo
a la mezcla con el agar, cada cantidad de
extracto se solubilizó mezclándolo con 200
µl de dimetil sulfóxido al 99,5% (DMSO).
Se utilizó un inóculo bacteriano de una
4
concentración equivalente a 10 UFC/ml,
sembrando 1 µl de cada uno en la
superficie de la placa, la cual se dividió en
seis partes asignando el área
correspondiente a cada una de las
bacterias en estudio. Adicional a lo anterior
se realizó el montaje de controles: de
esterilidad (placa de Müller Hinton sin
inocular y sin extracto), de inhibición
(Cloranfenicol 50 µg/ml), del diluyente
(DMSO al 5%), de crecimiento (placa
inoculada con las seis cepas bacterianas
en estudio pero sin extracto). Todos los
montajes descritos se realizaron por
duplicado. Después de inoculadas las
placas, se dejaron secar y se incubaron 24
o
horas a 37 C.
 Non-peer-reviewed

Los controles mostraron los resultados (figura 1), la inocuidad de diluyente

esperados, comprobándose así la (DMSO) y la esterilidad del medio de cultivo
viabilidad de las seis cepas bacterianas
.

Figura 1. Control de crecimiento bacteriano

1. Staphylococcus aureus ATCC 43300, 2. Enterococcus faecalis ATCC 51299 3. Escherichia coli ATCC 35218, 4.
Acinetobacter baumannii ATCC 19606, 5. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, 6. Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853.
observarse la ausencia de crecimiento en
De los doce extractos derivados de las seis las áreas 1 y 2 de la cuadrícula,
plantas analizadas, solo dos mostraron (demarcado con las flechas) lo que indica
efecto inhibitorio. Tanto el extracto inhibición bacteriana en las dos
metanólico y diclorometánico de repeticiones del ensayo.
Helichrysum italicum mostraron inhibición Se refiere en la literatura que efectos
para las bacterias grampositivas evaluadas inhibitorios por debajo de 1 mg/ml para
(S. aureus ATCC 43300 y E. faecalis ATCC extractos son interesantes y representan un
51299). La CMI con el extracto metanólico potencial real de inhibición para
para las dos cepas en mención fue 1,0 exploraciones más profundas de la
mg/ml y con el extracto diclorometánico fue capacidad inhibitoria del espécimen
de 0,5 mg/ml. En la figura 2 puede analizado (2).

Figura 2. Ensayo de inhibición del extracto diclorometánico de Helichrysum italicum en una

concentración final de 0,5 mg/ml

Discusión Helichrysum italicum es una
planta de la familia Asteraceae, que se
presenta como un arbusto perenne de poca
altura, (20 – 30 cm) leñosa, con hojas
lanceoladas y flores amarillas dispuestas
en inflorescencias compactas. Puede
crecer en una gran variedad de climas,
tolerar fuertes vientos, prefiere suelos
ácidos y requiere de la luz directa del sol
para su buen desarrollo. Sus flores se han
utilizado desde tiempos inmemoriales como
antiinflamatorio, digestivo, antimicrobiano y
colerético (4).
Los componentes químicos que se
presentan en mayor proporción su aceite
esencial son el nerol, acetato de nerilo,
propionato de nerilo, butirato de nerilo, E-
nerolidol, geraniol y acetato de geranilo (5).
Por su contenido de flavonoides y
terpenoides H. italicum ha sido reconocida
como una planta inhibidora de la dermatitis
de contacto (6).
Se han llevado a cabo investigaciones en
donde se evalúa la capacidad antioxidante
y antimicrobiana de diferentes especies de
Helichrysum, tal es el caso de un estudio
hecho en Turquía por Albayrak y
colaboradores (7) en el cuál se probaron
extractos metanólicos de 16 especies de
Helichrysum (pero no la especie italicum)
contra 15 microorganismos entre ellos
bacterias grampositivas, gramnegativas,
micobacterias y levaduras. Los resultados
demostraron que la mayoría de estas
especies poseían efecto antimicrobiano en
al menos un 10% contra bacterias
grampositivas (excepto Bacillius cereus) y
gramnegativos (excepto Proteus mirabilis y
Yersinia enterocolitica) y cinco de ellas
contra Mycobacterium smegmatis. Para las
levaduras solo se probaron 8 de los 16
extractos teniendo mayor efecto contra
Candida albicans que contra
Saccharomyces cerevisiae. Tales
resultados demuestran el potencial
inhibitorio del género Helichrysum, sin
embargo nuestros resultados no solo están
respaldados por este estudio, una
investigación que por sus métodos es
comparable en alto grado con la presente,
es la realizada recientemente en África por
Lourens y su equipo (8), en la cual se
determinó el efecto antimicrobiano de
extractos de 35 especies de Helichrysum
que se probaron contra cinco cepas
bacterianas (3 grampositivas y 2
gramnegativas) y una fúngica
(Cryptococcus neoformans) probando el
efecto antimicrobiano de siete de las
especies de Helichrysum contra S. aureus
Non-peer-reviewed
y B. cereus en concentraciones por debajo
de 0,1 mg/ml lo que resulta bastante
coincidente con este estudio, en el cual
también solo hubo efecto contra bacterias
grampositivas con resistencia múltiple a los
antibióticos (S. aureus ATCC 43300 y E.
faecalis ATCC 51299). Aunque tampoco se
evaluó la especie italicum (H. italicum) es
de denotar que este género de plantas es
de gran interés en la búsqueda de
antimicrobianos naturales y que las CMI
mostradas ameritan posteriores estudios.
En adición a los extractos de Helichrysum,
sus aceites esenciales también han sido
estudiados, lo que se evidencia en un
estudio donde se probaron los aceites
esenciales y extractos acetónicos y
metanólicos de cuatro especies de
Helichrysum (H. dasyanthum, H. felinum, H.
excisum y H. petiolare) contra B. cereus y
S. aureus, tales ensayos concluyeron que
las cuatro especies de Helichrysum
evaluadas poseen efecto inhibitorio en
concentraciones que van desde 0,015
mg/ml hasta 8 mg/ml. Adicionalmente a
estos ensayos, fueron determinados por
cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas los principales
compuestos de los aceites esenciales
siendo estos principalmente monoterpenos
(α-pineno, 1,8-cineol y p-cimeno) (9).
Así como en las anteriores investigaciones
se efectúan tamizajes de varias especies
de Helichrysum, también hay grupos
dedicados solo a estudiar específicamente
ciertas especies, tal es el caso de Drewes y
colaboradores, que en 2006 publicaron los
resultados de una investigación sobre
Helichrysum tenax, en la cual evalúan la
capacidad antimicrobiana de diterpenos
mono y diméricos extraídos de las hojas de
la especie de Helichrysum en mención
comparados con el extracto hexánico
crudo, tal investigación demostró que
algunas veces las mezclas (extractos
crudos) son más efectivas que los
componentes individuales y en otras los
componentes individuales son más
efectivos, lo que hace pensar que existe
fenómenos de sinergia y antagonismo en
las mezclas. Los resultados más llamativos
de tal investigación se relacionan con la
inhibición de B. cereus a una concentración
de 0,0036 mg/ml de un derivado del
15β,16β-epoxido-ent-beyeran-19-ol en
comparación al extracto crudo (de donde
se asiló el componente) que fue de 0,057
mg/ml, en contraste a esto para S. aureus
el componente aislado que mejor
comportamiento presentó fue el derivado

18-ol del compuesto citado anteriormente el
cual inhibió esta bacteria a una
concentración de 0,0057 mg/ml comparado
con la CMI del extracto crudo que fue
0,0036 mg/ml (10). Estas CMI probadas
son bastante inferiores a las del presente
estudio, pero no se descarta que
Helichrysum italicum pueda presentar CMI
tan bajas como estas; tales CMI no fueron
evaluadas por la incapacidad técnica de
pesar cantidades por debajo de 5 mg.
También se referencian investigaciones en
las que se estudian solo extractos de
Helichrysum italicum, en uno de estas se
determinó la acción del extracto dieltil-
etereo de Helichrysum italicum contra el
crecimiento y la actividad enzimática de S.
aureus sensible y resistente a meticilina, en
el cual se obtuvo inhibición en
concentraciones de hasta 0,125 mg/ml y de
reducción de la actividad enzimática de la
coagulasa, lipasa, DNAsa y termonucleasa
que son considerados como importantes
factores de virulencia del microorganismo
en cuestión (11). Comparado con el
presente estudio, el descrito anteriormente
solo supera en 4 veces la CMI encontrada
(0,5 mg/ml) lo que sugiere que los ensayos
se desarrollaron correctamente y que
metodología usada es ideal para seguir
investigando en el área y más
específicamente con Helichrysum italicum.
Adicional a los estudios de inhibición
microbiana, también se han desarrollado
estudios sobre la toxicidad de compuestos
fenólicos como el arzanol (presente en
Helichrysum italicum) que demuestran
mínima toxicidad en sistemas in-vitro, lo
que demuestra la inocuidad de algunos de
sus componentes y hace a esta planta
candidata para efectuar pruebas in-vivo
(12). Lo anteriormente expuesto es una
razón más para pensar que Helichrysum
italicum es un espécimen con alto potencial
para ser usado como una fuente de nuevas
sustancias antimicrobianas naturales.
Especies del género Helichrysum no solo
han sido usados como antibacterianos,
también se ha evaluado su capacidad
antiviral in-vitro contra el virus Herpes
simplex tipo I (VHS-1), en esta
investigación extractos acuosos a no representan peligros potenciales al
concentraciones de 1,35 mg/ml inhibieron
la acción del HSV-1 en fibroblastos
humanos sin exhibir efecto citopático
alguno (13).
Los flavonoides son moléculas que poseen
importante acción antimicrobiana, algunos
de estos se encuentran en buena cantidad
en varias especies de Helichrysum;
Non-peer-reviewed
investigaciones encaminadas a probar la
acción antimicrobiana de algunos de estos
compuestos tales como la apigenina, la
luteolina y el kaempferol entre otros,
mostraron buena acción antimicrobiana
sobre cepas de P. aeruginosa (0,625
mg/ml) y C. albicans (0,312 mg/ml) con
extractos de H. chasmolycicum (14). En
contraste a lo encontrado en el estudio
anteriormente mencionado, el mismo
investigador en el año 2005 había probado
varios de estos flavonoides extraídos de H.
compactum con resultados más discretos
para la apigenina y el kaempferol,
obteniendo CMI del orden de 40 mg/ml
para bacterias grampositivas,
gramnegativas (incluída P. aeruginosa) y C.
albicans (15), estos resultados hacen
pensar que existen variaciones entre
ensayos hechos en diferentes especies, de
lo cual podría presumirse que los
compuestos extraídos de una planta
poseen pequeñas variaciones estructurales
con respecto a los de otras plantas de
diferente especie.
Recientemente se ha publicado un estudio
que muestra el avance en las fases de
experimentación al que se ha llegado en la
investigación de los efectos farmacológicos
de especies de Helichrysum, en este caso
con la especie plicatum, cuyo extracto
hidro-etanólico fue evaluado para
comprobar el efecto en la formación de
cálculos renales de oxalato de calcio en
modelos murinos, ya que dicho efecto es
conocido en la medicina tradicional pero sin
ninguna base científica que el mismo efecto
reportado por los usuarios de dicho
tratamiento. Tras los análisis se demostró
que en el grupo de las ratas que fueron
tratadas con el extracto en mención se
redujo sustancialmente la formación de
cálculos renales de oxalato de Calcio con
dosis de 125 mg/ml, observándose un
efecto dosis dependiente con la casi
desaparición de depósitos de los cristales
en dosis de 500 mg/ml, sin efectos
secundarios (16). Con base en el anterior
estudio y los otros mencionados aquí,
podría generalizarse que los metabolitos
contenidos en las especies de Helichrysum
menos en animales de experimentación en
los que se han hecho ensayos clínicos
controlados, sumado al hecho que algunos
extractos acuosos son de consumo
humano por tradición y creencia popular sin
que se haya conocido oficialmente efectos
secundarios. Todo lo anteriormente
expuesto reitera la afirmación hecha en el

trascurso del escrito la cual invita a hacer
investigación de mayor nivel sobre
Helichrysum italicum no solo para evaluar
su capacidad antimicrobiana sino en otros
varios aspectos farmacológicos.
Conflicto de Intereses
Los autores no declaran ningún conflicto de
intereses.
Agradecimientos
Al personal del laboratorio del Centro de
Diagnóstico en Sanidad Vegetal de la
Universidad Pedagógica y Tecnológica de
Colombia por el apoyo técnico brindado
para el desarrollo del estudio.
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