Descalcificacion PDF

XXII CONGRESO ARGENTINO DE
HISTOTECNOLOGIA
Métodos de Descalcificación
Dimitrius Leonardo Pitol. PhD

Técnico de Laboratorio IV
FORP/USP
XXII CONGRESO ARGENTINO DE 2
HISTOTECNOLOGIA
En primer lugar, me gustaría recapitular conceptos

básicos, sobre huesos y dientes.
CORONA
La corona esta formada por
esmalte (que es la parte que
contiene mas calcio en el diente) Hueso Trabeculado
o Esponjoso
PULPA Medula ósea
roja
DENTINA
Hueso Cortical,
Compacto o Denso
HISTOTECNOLOGIA
Tejido Mineralizado
 El tejido mineralizado contiene 33% de matriz
orgánica siendo que el 28% corresponde al colágeno
tipo I y los otros 5% son:
 Osteonectina.
 Osteocalcina.
 Proteglicanos.
 Sialoproteina.
 Proteina morfogenética ósea.
HISTOTECNOLOGIA
Tejido mineralizado
 El otro 67% corresponde a la matriz inorgánica
conteniendo: fosfato, magnesio, potasio, sodio y
citrato.
 De estos elementos, el calcio es el que se encuentra

en mayor cantidad, y para estudiar los contituyentes
celulares, tenemos que retirarlo del tejido.
HISTOTECNOLOGIA
Métodos de descalcificación
 Existen básicamente 3 métodos para hacer la
descalcificación de tejidos:
 Soluciones ácidas diluidas: ejemplos (ácido clorhidrico,

acido nítrico a 5 o 7%, ácido fórmico a 5%).
 Soluciones quelantes: ejemplo (EDTA 10%).
 Mezcla de soluciones ácidas + soluciones quelantes.
 Por ejemplo el ETDA, “también conocido como

descalcificador Americano”.
HISTOTECNOLOGIA
Mecanismo de acción de los agentes

descalcificadores
 Los mecanismos de acción de los agentes descalcificadores
son diferentes.
 Cuando colocamos una muestra de hueso o diente en una

solución descalcificadora como el ácido nítrico, ocurre una
salida de calcio de ese tejido, hacia el líquido de la solución
descalcificadora, y esto provoca una reacción química en el
liquido descalcificador, dejando su solución tamponada, con
esto el descalcificador pierde su capacidad de retirar cálcio del
tejido.
HISTOTECNOLOGIA
Solución descalcificadora
Ácido (H+)
Ca++
Ca++ Ca++(PO4)6 (OH)2
Ca++
H3PO4 (ácido fosfórico) + cloreto de calcio + agua

HISTOTECNOLOGIA

descalcificadores
 Cuando Trabajamos con soluciones ácidas tnemos que

saber la hora exacta para retirar las muestra de los
descalcificadores para continuar el con la técnica
histológica.
 Ahora, si la muestra ya es encuentra sin cálcio, y

colocamos la solución ácida descacificadora, tendremos
una corrosión del tejido.
HISTOTECNOLOGIA

descalcificadores
 Cuando utilizamos soluciones quelantes (EDTA al 10%), la

remoción de calcio ocurre de forma mas lenta, y cuando el
tejido no tenga mas calcio, la solución de EDTA detendrá la
corrosión sobre el tejido.
 En general el pH de la solución de EDTA está en torno de 7.

HISTOTECNOLOGIA
Descalcificadores mas
utilizados
• Acido nítrico 5%.
• Acido fórmico + citrato de sódio.
• EDTA (ácido etileno-diamino-tetracético).
• ETDA (tartarato de sódio e potássio, tartarato de
sódio, Acido clorídrico e H20
HISTOTECNOLOGIA
Acido Nítrico
 Aqui tenemos una imagen de

un diente descalcificado con
ácido nítrico 7% con
coloración de tricrómica de
Masson con una optima
preservación, podemos ver las
fibras del ligamento
periodontal.
HISTOTECNOLOGIA
EDTA 10%
 Esto hace que el EDTA 10 % sea un descalcificador
de óptima calidad para la morfologia del tejido, y
muy bueno cuando trabajamos con microscopia
electrónica, inmunohistoquímica, y también para
las técnicas de biologia molecular.
 Y la mejor decalcificador
 promueve la descalcificación lenta.
 muy lento.
HISTOTECNOLOGIA
EDTA 10%
 En esta imagen de microsopía
electrónica de transmisión,
tenemos a un osteocito, con las
organela visibles: mitocondrias,
reticulo endoplasmático,
complejo de golgi.
 Si ese non fuese descalcificado

Pitol et al Braz Dent J (2007) 18(2): 153-157
con EDTA 10%, dificilmente
observariamos las organelas.
HISTOTECNOLOGIA
ETDA
 El ETDA és un descalcificador con substancias
quelantes y ácidas.
 És un excelente descalcificador, permite buenos

resultados en la inmunohistoquímica
 Promueve una descalcificación más rápida

HISTOTECNOLOGIA
ETDA
 Este es el protocolo para preparar la solución:
 EDTA. 0,7g
 Tartrato de sodio e potasio. 8g
 Tartrato de sodio. 0.14g
 HCl (Acido clorídrico) 120ml
 H2O destilada. 900ml
HISTOTECNOLOGIA
FEMUR ETDA DESCALCIFICADO EN 24

HORAS
 Observen esta imagen

radiográfica de un femur de
rata descalcificado con ETDA.
 En 24 horas el hueso ya esta

listo para el proceso
histológico
HISTOTECNOLOGIA
ETDA X EDTA 10%
 En nuestro laboratorio realizamos este test comparativo,

para evaluar la calidad de preservación del descalcificador
ETDA, y lo comparamos con el EDTA 10%, utilizamos para
este analisis (calvarias de ratas) hicimos la misma tinción
para los dos descalcificadores.
HISTOTECNOLOGIA
ETDA EDTA10%
 Percibimos que no habia

diferencias signficantes, en
cuanto a la calidad de las
muestras, con una ventaja
para el ETDA, el tiempo de
descalcificación fue de 24h,
 El EDTA 10% lleva de 25 a 30

dias.
19
HISTOTECNOLOGIA
Cuidados con la descalcificación
• El material debe ser fijado adecuadamente
• Debemos utilziar la concentración establecida en

los protocolos.
• El aumento de la concentración para acelerar el

procedimiento, puede dañar la muestra
20
HISTOTECNOLOGIA
Cuidados con la descalcificación
• Cuando utilizamos descalcificadores a base de

ácido, los cambios deben ser constantes.
• Saber el punto ideal para parar la

descalcificación.
HISTOTECNOLOGIA
Tiempo para cambio de descalcificador
 Cuando trabajamos con descacificador ácido,

debemos hacer el cambio de ese descalcificador,
todos los dias.
 Entretanto cuando usamos EDTA 10%, ese

cambio debe ser realizado a cada 5 dias.
HISTOTECNOLOGIA
Tiempo para cambio de descalcificador EDTA
 Tenemos aquí espectrofotometría de

absorción.
 Como podemos observar en esta tabla,

de un artículo sobre descalcificación.
 Si cambiamos la solución cada día

estamos gastando por nada.
Pitol et al.; Int.J.Morphol 25(2): 309 – 313, 2007

HISTOTECNOLOGIA
¿Como saber el punto ideal de

descalcificación?
 Saber el punto ideal para parar el proceso de

descalcificación es un factor determinante, para
obtener un buen resultado.
HISTOTECNOLOGIA
Métodos mas utilizados

 Método radiográfico: es muy bueno, pero en la práctica se torna
dificil, pues tendriamos que tener un Rayo X.
• Método cuantitativo: optima alterantiva para quien tien poca

experiencia con el procesamiento de tejido óseo.
• Utilización de alfileres e agujas: puncionar con una aguja o alfiler

en el local del espécimen que no comprometa el análisis, puede
ser una buena alternativa.
• La Flexibilidad y el método más apropiado evaluar muestras.

HISTOTECNOLOGIA
Método Cuantitativo
• Colectar 5ml de Descalcificador del fondo del Frasco.
• Aumentar 1 mL de Amonio concentrado (Mezclar).
• Aumentar 0,1mL de Oxalato de amonio.
• Dejar por 10 minutos para verificar la presencia de calcio.
• Si no se forma precipitado aumentar 0,1mL, con un intervalo de

10 minutos.
• Hasta el máximo de 0,6 mL .
• Si no se forma precipitado, el tejido es considerado

descalcificado.
HISTOTECNOLOGIA
Vídeo La Flexibilidad
El objetivo de este video es mostrar el
punto ideal de descalcificación del hueso.
El hueso y el femur de una rata.
Dejamos descalcificando por 24 horas

ETDA
27
HISTOTECNOLOGIA
Métodos para agilizar la descalcificación
 Horno Microondas domestico: da para acelerar la descalcificación,

sólo que el técnico precisa estar atento a algunas reglas para su
uso.
 Saber donde incide el mayor número de microondas dentro del

horno, trabajar con el plato fijo, colocar un becker en el forno para
robar calor etc.
HISTOTECNOLOGIA
 Pero existen también hornos microondas

produciodos espcificamente para ser
utilizados en el laboratorio e son mucho
mas seguros.
HISTOTECNOLOGIA
 La descalcificación también puede ser

acelerada por estímulos eléctricos
(funciona mejor para descalcificadores
ácidos)
 Colocamos nuestras muestra en la

solución descalcificadora y dejamos
los electrodos pasando corriente
eléctrica.
HISTOTECNOLOGIA
Adesión de cortes en la Lámina
 Láminas de diente o Huesos pueden

soltarse de la lámina en el momento de
la coloración, para que esto no ocurra
lo ideal es tener cortes de 5 a 3µm de
espesor y utilizar láminas tratadas con
silano, polisina o láminas con carga.
HISTOTECNOLOGIA
Hematoxilina Eosina
 La tinción con HE, es una de

nuestras tinciones de rutina.
 Podemos observar una lámina

de un diente, el área del
cemento, área del ligamento
periodontal y hueso alveolar.
HISTOTECNOLOGIA
Hematoxilina Eosina
 Mandibula de camundongo o
raton, podemos observar un
diente, primer molar y sus
raizes.
HISTOTECNOLOGIA
Tricrómica de Masson
 La tinción com Tricómica de

Masson, es una de nuestras
tinciones de rutina
 En azul claro la dentina. DENTINA
 En rojo, el área con los

ODONTOBLASTOS
odontoblastos.
 Aquí en la parte mas clara con
vairas células tenemos a la pulpa POLPA DENTÁRIA
dentaria.
HISTOTECNOLOGIA
Tricrómico de Masson
 Calvaria de rata corte con

historesina
 Articulación de rodilla de
raton ( Verde Luz)
HISTOTECNOLOGIA
Picro-Sirus
 En la coloración de picro sirus, podemos utilizar microscopía
de polarización para evidencias fibras colágenas.
HISTOTECNOLOGIA
TRAP
La coloración de TRAP (fosfatasa ácida resistente al tartrato) permite
que identifiquemos los osteoclastos, como una reacción de color
rojo.
Aquí tenemos un corte de

mandibula de rata en
historesina, marcando
osteoclastos.
Pitol et al : Int. J. Morphol., 25(4):907-910, 2007

HISTOTECNOLOGIA
Inmunohistoquímica
• Fijación con formol tamponado 10%.
• Láminas sinalizadas.
• Cortes 3 a 2 µm.
HISTOTECNOLOGIA
Protocolo del tejido óseo

• Dilución de anticuerpo primario em BSA.
• Incubación de anticuerpo por 2 horas.
• Un lavado de 5 minutos em PBS.
• Incubar con anticuerpo secundario
“conjugado” por 40 minutos.
• Un lavado de 5 minutos.
• Aplicación de DAB (Cromógeno) por 5
minutos.
• Un lavado em PBS por 5 minutos.
• Pasar un minuto en hematoxilina,
deshidratar y montar con lámina.
HISTOTECNOLOGIA
Anticuerpos
• MMP-9 Ab 19016 (CHEMICON)
• CD 34 Sc 9095 (SANTA CRUZ)
• CD 31 Ab 64543 (ABCAM)
• FGF BASIC Ab 16828 (ABCAM)
• VEGF R2 Ab2349 (ABCAM)
• VEGF Ab44714 (ABCAM)
• OSTEOCALCINA Sc 30044 (SANTA CRUZ)
• SIALOPROTEINA Ab 1851 (CHEMICON)
41
¿Que tiene que ver la

Histotecnología aplicada al
tejido óseo con las
escamas de peces?
HISTOTECNOLOGIA
 Las escamas también son estructuras rigidas, con origen en la capa mas
profunda de la demis desde el tejido óseo.
 Colocado 12 horas en el EDTA, permite que cortes fuesen realizados sin
dificultades, y identificamos las estructuras presentes.
 Mostrando las capas de colagenos  Coloración de Orceina mostrando las

con luz polarizada. fibras elásticas en el tejido epitelial.
HISTOTECNOLOGIA
 Coloración de Alcian Blue, mostrando Coloración de PAS, mostrando

depósitos de polisacaridos ácidos polisacaridos neutros
HISTOTECNOLOGIA
 Aqui tenemos algunos de los trabajos

científicos, publicados por nuestro
grupo de pesquisa.
 Estas relevantes publicaciones se

tornan posibles gracias, a la
histotecnologia de calidad.
 La histotecnología es una herramienta

indispensable para diagnósticos e
investigación científica.
HISTOTECNOLOGIA
Agradecimientos
dimitrius@forp.usp.br
dimipitol@yahoo.com.br

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XXII CONGRESO ARGENTINO DE

Dimitrius Leonardo Pitol. PhD

En primer lugar, me gustaría recapitular conceptos

 De estos elementos, el calcio es el que se encuentra

 Soluciones ácidas diluidas: ejemplos (ácido clorhidrico,

 Soluciones quelantes: ejemplo (EDTA 10%).

 Mezcla de soluciones ácidas + soluciones quelantes.

 Por ejemplo el ETDA, “también conocido como

Mecanismo de acción de los agentes

 Cuando colocamos una muestra de hueso o diente en una

H3PO4 (ácido fosfórico) + cloreto de calcio + agua

Mecanismo de acción de los agentes

 Cuando Trabajamos con soluciones ácidas tnemos que

 Ahora, si la muestra ya es encuentra sin cálcio, y

Mecanismo de acción de los agentes

 Cuando utilizamos soluciones quelantes (EDTA al 10%), la

 En general el pH de la solución de EDTA está en torno de 7.

 Aqui tenemos una imagen de

 promueve la descalcificación lenta.

 Si ese non fuese descalcificado

 És un excelente descalcificador, permite buenos

 Promueve una descalcificación más rápida

FEMUR ETDA DESCALCIFICADO EN 24

 Observen esta imagen

 En 24 horas el hueso ya esta

ETDA X EDTA 10%

 En nuestro laboratorio realizamos este test comparativo,

 Percibimos que no habia

 El EDTA 10% lleva de 25 a 30

Cuidados con la descalcificación

• El material debe ser fijado adecuadamente

• Debemos utilziar la concentración establecida en

• El aumento de la concentración para acelerar el

Cuidados con la descalcificación

• Cuando utilizamos descalcificadores a base de

• Saber el punto ideal para parar la

Tiempo para cambio de descalcificador

 Cuando trabajamos con descacificador ácido,

 Entretanto cuando usamos EDTA 10%, ese

Tiempo para cambio de descalcificador EDTA

 Tenemos aquí espectrofotometría de

 Como podemos observar en esta tabla,

 Si cambiamos la solución cada día

Pitol et al.; Int.J.Morphol 25(2): 309 – 313, 2007

¿Como saber el punto ideal de

 Saber el punto ideal para parar el proceso de

Métodos mas utilizados

• Método cuantitativo: optima alterantiva para quien tien poca

• Utilización de alfileres e agujas: puncionar con una aguja o alfiler

• La Flexibilidad y el método más apropiado evaluar muestras.

• Aumentar 1 mL de Amonio concentrado (Mezclar).

• Aumentar 0,1mL de Oxalato de amonio.

• Dejar por 10 minutos para verificar la presencia de calcio.

• Si no se forma precipitado aumentar 0,1mL, con un intervalo de

• Hasta el máximo de 0,6 mL .

• Si no se forma precipitado, el tejido es considerado

El hueso y el femur de una rata.

Dejamos descalcificando por 24 horas

Métodos para agilizar la descalcificación

 Horno Microondas domestico: da para acelerar la descalcificación,

 Saber donde incide el mayor número de microondas dentro del

Métodos para agilizar la descalcificación

 Pero existen también hornos microondas