O emprego de técnicas hifenadas no estudo de

plantas medicinais
Marili Villa Nova Rodrigues, Vera Lúcia Garcia Rehder, Adilson Sartoratto, Sinésio Boaventura Júnior, Adriana da
Silva Santos
Universidade Estadual de Campinas
CPQBA-UNICAMP
Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica
Caixa Postal 6171, CEP 13083-970, Campinas, SP.
E-mail: marili@cpqba.unicamp.br

Resumo
O extrato vegetal bruto constitui uma matriz bem complexa contendo centenas ou
milhares de metabólitos, que diferem consideravelmente em seus parâmetros físico-químicos
e espectroscópicos. Por isso, uma eficiente detecção e rápida caracterização têm papel
fundamental na pesquisa de produtos naturais biologicamente ativos. Uma eficiente triagem
dos extratos é alcançada através do monitoramento biológico e químico, realizados
concomitantemente. Para isso, a utilização de técnicas hifenadas é de grande valia, pois
fornece numerosas informações estruturais dos metabólitos antes mesmo do seu isolamento.
A hifenação de um método eficiente de separação com detetor espectrométrico constitui a
principal ferramenta utilizada no estudo de plantas medicinais, onde a cromatografia gasosa e
a cromatografia líquida ocupam posições de destaque entre os métodos de separação. Para
compostos que apresentam grupos cromóforos, o detetor de arranjo de diiodos (DAD) é
normalmente empregado; caso contrário, a detecção é feita pelo detetor seletivo de massas,
por causa do grande número de informações geradas. No estudo de plantas medicinais, na
maioria das vezes, torna-se necessário o uso de técnicas complementares para a identificação
dos componentes ativos, como o caso da combinação entre LC-NMR (cromatografia líquida
com detetor de ressonância magnética nuclear), LC-DAD (cromatografia líquida com detetor
de arranjo de diiodos) e LC-MS-MS (cromatografia líquida com detetor seletivo de massas
tandem), graças à complexidade do problema. Com os recentes avanços da tecnologia, os
pesquisadores podem contar com ferramentas poderosas na busca de novos compostos
bioativos.

Palavras chaves: controle de qualidade, fitoterápicos, planta medicinal, técnicas hifenadas.

Introdução

As plantas representam uma extraordinária fonte de novos compostos com atividade

terapêutica; daí o crescente interesse no estudo de plantas medicinais. Para o estudo de novas
moléculas bioativas de origem vegetal, o extrato deve ser submetido, concomitantemente, a
uma triagem química e biológica.
O perfil metabólico de extratos brutos não é uma tarefa fácil de ser realizada em razão
da diversidade de estruturas químicas presentes na planta. Porém, o avanço tecnológico de
técnicas analíticas, sobretudo das técnicas hifenadas, proporcionou um papel importante na
elucidação de composições químicas complexas dos produtos de origem vegetal, com níveis
de sensibilidade e seletividade impensáveis até poucos anos atrás. Isso possibilitou o estudo
do extrato vegetal bruto, sem a necessidade do exaustivo trabalho de isolamento que, muitas
vezes, leva a compostos já conhecidos. Sendo assim, estratégias de triagem química têm sido
desenvolvidas através do uso de técnicas hifenadas.
O termo técnicas hifenadas refere-se ao acoplamento entre duas ou mais técnicas
analíticas com o objetivo de obter uma ferramenta analítica mais eficiente e rápida que as
técnicas convencionais. As técnicas analíticas químicas mais empregadas na análise de
produtos à base de plantas medicinais são a cromatografia e a espectroscopia.
As técnicas a serem acopladas deverão gerar informações diferentes, ou seja, ser
ortogonais. Um exemplo típico é o acoplamento de métodos eficientes de separação como a
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e a cromatografia gasosa (GC), com técnicas
espectrométricas como espectrofotômetro de UV-Vis (DAD), espectrômetro de massas (MS e
MS-MS) e ressonância magnética nuclear (NMR), que fornecem informações adicionais sobre
a estrutura química dos componentes da amostra, funcionando como detetores. A escolha do
detetor torna-se fundamental quando o analito se encontra em nível de traços, necessitando de
baixos limites de detecção.
O número de informações obtidas é muito grande, tornando-se necessária a utilização
de computadores para obtenção e tratamento dos dados e, freqüentemente, o uso da
quimiometria para sua interpretação.
A principal vantagem das técnicas hifenadas em comparação com as técnicas
espectroscópicas sem hifenação deve-se ao fato de não necessitar de uma grande quantidade
(miligrama) do analito na sua forma purificada, o que acontece com as técnicas sem
hifenação, que só são válidas após um tedioso protocolo de purificação.
 A tabela 01 apresenta as principais características e usos das técnicas hifenadas na
análise de plantas.

Tabela 01: Aplicações de técnicas hifenadas na área de plantas medicinais.

Técnicas Características Exemplos de aplicação na área de

hifenadas plantas medicinais
GC-MS Identificação de compostos. Estudo da sazonalidade de algumas
Fornece informação estrutural da classes de metabólitos secundários,
molécula. caracterização de aromas,
identificação de terpenóides (1)
Permite comparação com
bibliotecas espectrais. Análise de flavonóides (2)
GC-MS-MS Confirmação estrutural de Análise de fragrâncias (3)
moléculas.
LC-DAD Identificação de compostos Análise de flavonóides (4)
conhecidos, através da comparação Controle de qualidade de plantas
do tempo de retenção e espectro UV medicinais, busca de metabólitos
com o padrão analítico. Não fornece ativos, estudos de ecologia química
informação estrutural. e quimiossistemáticos (1)
LC-MS Raramente resulta na identificação Análise de antocianinas (5)
definitiva. Muitas vezes acoplado
com LC-DAD para fornecer
informações estruturais
complementares.
LC-MS-MS Determinação de novos compostos, Determinação de flavonóides,
com a incrível vantagem da saponinas (6)
simplicidade no preparo da amostra
e rapidez na obtenção dos
resultados.
LC-NMR Fornece informações estruturais Determinação de alcalóides (7),
(espectro 1H-NMR). Constitui-se a flavonóides (8)
técnica mais poderosa na
determinação estrutural de
substâncias inéditas com novos
esqueletos e em misturas
biologicamente ativas (1)

Para análise de compostos voláteis e termicamente estáveis, o método mais utilizado é

a cromatografia gasosa acoplada ao detetor seletivo de massas.
A seguir, estão apresentadas algumas das hifenações mais utilizadas no estudo de
plantas medicinais.
GC-MS e GC-MS-MS
A cromatografia gasosa foi a primeira técnica a ser interfaceada com o detetor de
massas, por causa da facilidade do manuseio do efluente gasoso do cromatógrafo. É uma
ferramenta muito útil na identificação de compostos de origem vegetal graças à
disponibilidade de bibliotecas espectrais, com detetor de massas operando sob condições de
impacto de elétrons.
Atualmente, a cromatografia gasosa com detetor de massas sob condições de impacto
de elétrons é o método mais aplicado em laboratórios de pesquisa, uma vez que os espectros
obtidos são bem documentados em bibliotecas. A quantificação é possível com o uso de
padrão interno, que compensa uma possível baixa recuperação durante o processo de extração
e a variação na resposta instrumental.
A principal dificuldade de acoplamento entre GC e MS foi em conseqüência da
introdução de um composto à pressão atmosférica (proveniente da separação cromatográfica)
dentro de um sistema a alto vácuo. Para contornar esse problema, diferentes interfaces foram
desenvolvidas (9).
Os principais requisitos para o desenvolvimento de interfaces para GC-MS levaram
em consideração a redução do fluxo da coluna cromatográfica para manutenção do vácuo, a
separação seletiva do analito do gás de arraste e a manutenção da separação cromatográfica.
Dessa forma, o desenvolvimento das colunas capilares para GC foi em parte
responsável pelo sucesso da hifenação GC-MS, em razão da redução significativa do fluxo (1
– 2 mL/min) em relação às colunas empacotadas (30 – 60 mL/min), além do aumento
significativo do poder de resolução da cromatografia gasosa em relação à líquida.
Embora existam várias técnicas de ionização, as mais utilizadas em GC-MS são o
impacto de elétrons (EI) e a ionização química (CI).
Na ionização por impacto de elétrons, as moléculas da amostra, vindas do sistema
cromatográfico, entram na fonte de íons e são ionizadas pela colisão com os elétrons gerados
num filamento de tungstênio ou rênio. Essa colisão leva à fragmentação e ionização das
moléculas da amostra.
Na ionização química, as moléculas do analito são ionizadas indiretamente, através de
reações com os íons de um gás reagente (metano, isobutano, amônia ou água). Essa técnica
representa uma ionização mais branda, já que a energia envolvida na colisão é pequena (9).
Conseqüentemente, ocorre uma menor fragmentação do analito e uma maior
abundância dos íons moleculares.
 Uma característica importante da ionização química é a influência do gás reagente na
seletividade; por exemplo, quando a amônia é utilizada, somente os compostos fortemente
básicos são protonados e podem ser detectados.
Essa dependência das condições experimentais diferencia os espectros de CI de
diferentes instrumentos, dificultando a pesquisa por bibliotecas espectrais.
A Tabela 02 apresenta os principais analisadores de massas e as principais diferenças
entre eles.

Tabela 02: Vantagens e desvantagens dos analisadores de massa utilizados em GC-MS.

Analisadores de Vantagens Desvantagens
massa
Quadrupolo Mais utilizado no acoplamento com GC. Menos sensível que os
Robustos, baixo custo e compactos. instrumentos de setor magnético.
Detecção de íons positivos e negativos.
Setor magnético Alta resolução, alta sensibilidade, útil para Custo mais elevado, difícil
compostos de alta massa molecular. operação e manutenção.
Ion trap Compacto, baixo custo, simples de operar, Baixa resolução em varredura
possibilidade de usar EI ou CI. rápida.
Fonte: adaptado de KELLNER et al., 1998.

O detetor de massas pode operar no modo “scan” funcionando como um detetor

universal, ou no modo SIM (“selected ion monitoring”) como um detetor seletivo altamente
sensível.
Quando os compostos a serem analisados têm baixa volatilidade ou são muito polares
para análise por GC, o método de escolha é a cromatografia líquida de alta eficiência. As
hifenações mais utilizadas com esta ferramenta são:

LC-DAD
A cromatografia líquida com o detetor de arranjo de diiodos (LC-DAD) é uma técnica
amplamente utilizada na análise de produtos naturais desde que o analito apresente grupos
cromóforos que propiciem a absorção de luz na região de UV-visível.
É uma técnica muito aplicada no controle de qualidade de produtos de origem vegetal;
porém, sua utilização na identificação de compostos bioativos é limitada, pois o LC-DAD
fornece apenas o espectro UV-Vis de cada substância como informação estrutural, o que não é
suficiente para a caracterização, pois vários compostos de um mesmo grupo químico
apresentam espectros similares, impossibilitando sua distinção. As informações obtidas com
esta técnica são complementares a outras técnicas hifenadas em cromatografia líquida (LC-
MS, LC-NMR). Um exemplo desta aplicação é análise de compostos fenólicos utilizando-se
LC-DAD-MS (10).
A busca por mais informações sobre a estrutura de compostos levou ao
desenvolvimento de novas técnicas hifenadas como o LC-MS e LC-NMR.

LC-MS e LC-MS-MS
Dentre os acoplamentos, o LC-MS é muito mais seletivo e, em certas circunstâncias,
mais sensível que o LC-DAD. Já a identificação de compostos é mais difícil e nem sempre é
viável, por causa da menor resolução cromatográfica (em comparação com GC) e a possível
coeluição de compostos.
Uma dificuldade encontrada para acoplamento da LC com o MS era a manutenção do
vácuo no detetor de massas, o que foi resolvido em parte pela introdução da fase móvel de
HPLC na forma de “spray” dentro da fonte de íons do MS, onde apenas uma pequena fração
do solvente entra no analisador de massas (11).
O principal problema do uso da LC-MS na química de produtos naturais é a ionização
de uma grande variedade de compostos existentes no extrato bruto. Embora existam vários
tipos de interfaces disponíveis no mercado, nenhuma delas permite a detecção universal de
todos os constituintes da matriz vegetal. Cada interface tem suas próprias características e sua
faixa de aplicação (6).
Inicialmente a LC-MS foi desenvolvida para aplicação na confirmação da identidade
de compostos, mas sua precisão é suficientemente alta para permitir a quantificação de
analitos por calibração interna e externa.
O desenvolvimento de técnicas de ionização à pressão atmosférica, tais como a
ionização química à pressão atmosférica (APCI) e a ionização por eletronebulização ou
eletrospray (ESI) tornaram a técnica de LC-MS aplicável para uma grande variedade de
matrizes. Mais recentemente a disponibilidade do equipamento com fotoionização (APPI)
conferiu universalidade à técnica de LC-MS, permitindo a análise de compostos com baixa
massa molecular até proteínas (12).
 A Tabela 03 sumariza algumas das principais características das interfaces utilizadas
em LC-MS.

Tabela 03: Interfaces para LC-MS.

Interface/ Fluxo Tipo de Compostos Vantagens e desvantagens

Ionização ionização
Feixe de 0,1–1 EI, CI+, . apolares ou . resposta não linear
partículas mL/min CI- moderadamente polares . variação na resposta
. termicamente estáveis . menos sensível
. massa molecular de . necessita usar tampões
100-1400 voláteis
. bibliotecas para EI
TSP 0,1–2 CI+, CI- . pouco polares a polares . fragmentação limitada e
mL/min . massa molecular de dificilmente reprodutível
100-2000 . nenhum espectro de
referência
. instabilidade da intensidade
do sinal
. condições para LC limitadas
APCI 0,2–2 CI+, CI- . pouco polares a polares . fragmentação limitada
mL/min . massa molecular de . nenhum espectro de
100-1200 referência
. altamente sensível
. possibilidade de degradar
certos compostos termolábeis
ESI 1µL/min – CI+, CI- . pouco polares a . fragmentação limitada
2mL/min altamente polares . nenhum espectro de
. massa molecular baixa referência
a elevada (formação de . altamente sensível
íons com cargas
múltiplas)
ESI- 20nL/min - CI+, CI- . pouco polares a . fragmentação limitada
nanospray 5µL/min altamente polares . nenhum espectro de
. massa molecular baixa referência
a elevada (formação de . utilizável com colunas
íons com cargas capilares
múltiplas)
FAB 1 - 5µL/min CI+, CI- . polares e altamente . fragmentação limitada
dinâmica polares . nenhum espectro de
. massa molecular até referência
milhares de daltons . baixo fluxo da fase móvel
Fonte: ENSMINGER, 1998.
Legenda: TSP termospray; EI ionização eletrônica; CI+ ionização química positiva; CI-
ionização química negativa; FAB “fast atom bombardeament”
 As interfaces de LC-MS normalmente produzem uma ionização branda dos
metabólitos, gerando informação apenas da massa molecular do composto. Algumas
informações como a perda de uma molécula de açúcar são obtidas utilizando a interface
termospray, mas esse número é relativamente pequeno. Para obter um número maior de
fragmentos característicos, o espectro de dissociação induzido por colisão pode ser gerado
utilizando-se os sistemas MS-MS ou íon-trap MS. (6).

LC-NMR
O uso do LC-DAD e LC-MS nem sempre é suficiente para a identificação “on-line” de
produtos naturais pois, muitas vezes, faltam informações estruturais conferidas pela LC-
NMR.
Os requerimentos básicos para o acoplamento dessas duas técnicas são:
• Substituição dos tubos convencionais de amostra por cela em fluxo.
• Supressão do solvente. O uso de solventes protonados promove um sinal intenso em
relação ao sinal dos analitos impossibilitando a detecção. Em princípio, isso pode ser
superado utilizando-se solventes deuterados, porém o custo é elevado e outros métodos de
supressão de solvente são indicados. Entretanto, a supressão múltipla do solvente é mais
fácil se ao invés de H2O utilizar D2O na fase móvel.
O acoplamento da HPLC com NMR pode ser encontrado em 3 módulos:
• Fluxo parado: o processo cromatográfico é alterado depois de definir o tempo de
transferência do centro do pico obtido na HPLC para a cela de determinação do NMR.
Depois disso, experimentos uni ou bidimensionais podem ser realizados durante horas.
• Transferência de várias frações (picos cromatográficos) para “loops” sem interrupção da
análise cromatográfica. Os picos são estocados e subseqüentemente transferidos para a
cela de medida do NMR.
• No módulo em fluxo, o eluente é continuamente transferido para a cela do NMR.
Enquanto a fase móvel com os analitos atravessa a cela, o NMR registra espectros
unidimensionais.
Nos últimos anos, o LC-NMR “on-line” tem atraído a atenção de muitos
pesquisadores do ramo dos produtos naturais. Este sistema de detecção é uma ferramenta
poderosa na diferenciação entre isômeros, configurações de açúcar e substituições no anel
aromático, além do que, seu acoplamento simultâneo com o detetor seletivo de massas
permite a aquisição de informações adicionais sobre grupos funcionais e massa molecular
(14).
A alta resolução de informação de métodos NMR permite a identificação de muitos
analitos num só espectro. Compostos de ampla faixa de polaridade podem ser analisados por
LC-NMR incluindo aqueles que não podem ser analisados por GC-MS.
Mesmo assim, para uma elucidação estrutural mais exata de novas moléculas
provenientes de produtos naturais, muitas vezes torna-se necessário o isolamento preparativo,
pois normalmente parte da região do espectro de 1H é perdida e o espectro de 13
C,
indispensável para a identificação, não é fornecido (15).
A resposta obtida por LC-NMR reflete diretamente a concentração do analito,
enquanto que, em LC-MS, a resposta depende da eficiência de ionização, ou seja, das
propriedades químicas do analito.
A principal desvantagem da LC-NMR é sua baixa sensibilidade, que em geral é de 3
ordens de magnitude menor do que para LC-MS e, portanto, não é indicada para a
determinação de baixos níveis de concentração (11).
As principais dificuldades encontradas no emprego da LC-NMR são:
• Dificuldade em observar a ressonância do analito na presença de grande quantidade de
fase móvel.
• Utilização de mais de um solvente protonado na fase reversa.
• Mudança na freqüência de ressonância com o gradiente.
Para LC-NMR, a quantificação é realizada no modo em fluxo, através do uso de um
padrão interno, dispensando o uso de um padrão de referência e de curva de calibração.
Informações mais precisas são obtidas quando o NMR é acoplado “on-line” com
HPLC. O uso de colunas pequenas (75 x 4,5 mm 5 µm) que operam a baixo fluxo (0,017
mL/min) permite o acúmulo de um grande número de espectros.
Por razões de sensibilidade, as determinações por LC-NMR se restringem ao 1H
NMR.
A Tabela 04 ilustra aplicações do LC-NMR na análise de flavonóides, onde a maioria
das citações utiliza o modo “stopped-flow”, dispensando longo tempo para registro do
espectro. O tempo de varredura do espectro pode variar de 1h até vários dias por pico
cromatográfico.
Tabela 04: Estudo de flavonóides por LC-NMR em plantas

Amostra Flavonóides encontrados Referência

bibliográfica
Gentiana ottonis Swertisina, iso-orientina 156
Hypericum perforatum Quercetina-galacturonideo, hiperosídeo, 13-118- 89
biapigenina
Erytrhina vogelii (raiz) Isoflavonas preniladas, isoflavanonas 199
Trifolium pratense (folhas) 2 formononetina-glucosideo-malonatos 44
(isômeros), 2 biochanina A-glucosideo-malonatos
(isômeros)
Lycopersicon esculentum 2 campferol-diglicosideos, 2 dihidrocampferol- 174
hexosídeos, 2 campferol-glicosídeos, rutina,
naringenina-7-O-glucosídeo, naringenina,
chalcona
Fonte: Rijke et al., 2006.

A técnica de LC-NMR ainda não foi aceita amplamente pelos cientistas, por causa da
falta de sensibilidade, onde a maior dificuldade é a de observar as ressonâncias do analito na
presença de uma grande quantidade de fase móvel. Porém, constitui uma poderosa ferramenta
na identificação de compostos bioativos quando utilizada em combinação com outras técnicas
hifenadas. Até o momento não temos registro do uso desta técnica no Brasil.

Algumas aplicações das técnicas hifenadas no estudo de plantas medicinais

São indiscutíveis os benefícios trazidos pela utilização de técnicas hifenadas,
sobretudo em estudos complexos como o caso de extratos vegetais.
As técnicas mais utilizadas na triagem química de metabólitos de plantas são GC-MS,
principalmente no estudo de óleos essenciais e das técnicas de LC-DAD-MS e LC-MS-MS,
no estudo de compostos mais polares.
A técnica de GC-MS é aplicada rotineiramente na caracterização química dos
constituintes de óleos essenciais, matéria-prima empregada principalmente nas indústrias do
ramo farmacêutico, alimentício e cosmético. O grande número de constituintes presentes no
óleo essencial exige a utilização desta técnica, que permite assegurar a qualidade e
autenticidade deste material. Um exemplo é o emprego no controle analítico do óleo essencial
de Cordia verbenácea, empregado na produção de um antiinflamatório tópico disponível no
mercado brasileiro (16).
 Outra aplicação da técnica de GC-MS a ser ressaltada é na análise de contaminantes
em plantas medicinais. Estas plantas podem veicular contaminantes ambientais altamente
tóxicos, como no caso dos pesticidas organoclorados, compostos altamente persistentes no
meio ambiente (17).
Na análise de compostos polares presentes em produtos vegetais, as hifenações com a
cromatografia líquida de alta eficiência são as mais utilizadas, principalmente a LC-MS-MS
pelo grande número de informações geradas e sua alta seletividade. Dentre estes, uma classe
que tem merecido destaque no estudo de plantas medicinais é a dos flavonóides, graças à
grande variedade de compostos e diversas aplicações terapêuticas. Nesse campo é importante
distinguir entre a simples determinação de agliconas (tipo mais freqüente de análise com um
número mais limitado de compostos presente em concentrações relativamente altas na
amostra), com a análise de seus conjugados dentro da aglicona correspondente, muitas vezes
presentes em baixas concentrações (traços) na matriz vegetal. O emprego da LC-MS-MS não
somente permite a formação de fragmentos de estrutura específica, mas também reduz a
interferência da coeluição de compostos e da matriz.
A tendência futura é de que novas técnicas hifenadas surgirão devido ao avanço
tecnológico, permitindo acoplamentos mais sofisticados, através de interfaces modernas e
otimizadas, aliando métodos de separação altamente eficientes e de amplo domínio, como a
cromatografia, com um ou mais detetores espectroscópicos.

Conclusão
A exigência cada vez maior na obtenção de produtos de origem vegetal com qualidade
requer o emprego de técnicas analíticas seletivas e eficientes, que possibilitem com segurança
a identificação e quantificação de diferentes classes de compostos, o que pode ser obtido com
a utilização das técnicas hifenadas.
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Endereço para Correspondência

Universidade Estadual de Campinas
CPQBA-UNICAMP
Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica
Caixa Postal 6171, CEP 13083-970, Campinas, SP.
E-mail: marili@cpqba.unicamp.br

Data de Recebimento: 07/07/2006

Data de Aprovação: 28/07/2006