CÓDIGO:

SGC.DI.505
GUIA PARA LAS PRÁCTICAS DE VERSIÓN: 2.0
FECHA ULTIMA REVISIÓN:

LABORATORIO, TALLER O CAMPO. 12/04/2017

Ciencias de la Vida y de la
DEPARTAMENTO: CARRERA: Biotecnologia
Agricultura
PERíODO
ASIGNATURA: Inmunologia Abril – Agosto 2018 NIVEL: 7mo
LECTIVO:
DOCENTE: Marbel Torres, PhD NRC: 4248/4249 PRÁCTICA N°: 1

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio de docencia de Biotecnología

TEMA DE LA
PROCEDIMIENTOS PARA RECOLECTAR Y PROCESAR MUESTRAS SANGUÍNEAS Y PRUEBAS DE
PRÁCTICA:
AGLUTINACION
INTRODUCCIÓN:

La sangre se compone de una suspensión de células especiales en

líquido llamado plasma. Un linfocito es un pequeño glóbulo blanco,
normalmente de 7 a 8 micrómetros de longitud presente en la sangre.
Son las únicas células sanguíneas que pueden transformarse en
células que proliferan activamente. Los linfocitos se originan a partir
del tejido linfático en todo el cuerpo. Estos linfocitos recogidos de la
sangre han estado en uso frecuente en el campo de la inmunología.
Ayuda a proteger el cuerpo de enfermedades, invasión de cuerpos
extraños, tumores e infecciones. Por ejemplo, se utilizan linfocitos
para estudios inmunológicos dirigidos a antígenos de
histocompatibilidad e inmunidad celular. Los linfocitos también se
usan para determinar la blastotransformación de linfocitos o para
determinar la proporción de células T en células B, y para tratar de
separar células T auxiliares y células T supresoras de células T.
El proceso típico para llevar a cabo la separación de linfocitos es la
centrifugación por gradiente de densidad. La centrifugación es el
método comúnmente usado para procesar la sangre de modo que las
células y partículas del mismo tamaño, forma y densidad sedimenten como zonas separadas sin convección. La sangre
entera puede fraccionarse de forma fácil y reproducible en diferentes componentes mediante centrifugación diferencial y
extracción selectiva. Los componentes sanguíneos separados pueden utilizarse posteriormente para sus respectivas
aplicaciones clínicas y científicas e investigaciones. Se han utilizado medios de densidad acuosos con centrifugación
para separar y aislar diferentes tipos de células sanguíneas. La separación de linfocitos de sangre entera usando
HISTOPAQUE-1077 se basa en un método descrito por primera vez por Boyumina en 1968. El medio de separación,
HISTOPAQUE-1077, es una solución acuosa de un polisacárido de alto peso molecular y diatrizoato de sodio,
compuesto aniónico no iónico, ajustado a un Densidad de 1,077 ± 0,001. Este medio facilita la recuperación rápida de
linfocitos viables a partir de pequeños volúmenes de sangre.

OBJETIVOS:

Aislar los linfocitos de la sangre entera mediante el método de centrifugación con gradiente de densidad

MATERIALES:
REACTIVOS: 100ML Alcohol INSUMOS: 10 Tubos tapa morada
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400 ml Solución salina 5 Agujas/ vacutainer
400 ml PBS1X 10 Jeringas/ Torundas
10 ml Ficoll histopque 5 Torniquete
10 ml Limphoprep 10 Tubos de ensayo de 15ml plásticos
1 ml Azul de trypan 10 Tubos de ensayo de 50ml plásticos
10ml Colorante de Wright 10 Pipetas 10ML desechables
10ml hematoxicilina 1 caja nueva Porta objetos
10 Pipetas Pasteur
5 Gradillas de tubos de 15mL
3 cajas Puntas para todas la micropipetas 1000ul, 200ul, 10ul
EQUIPOS:
1 Centrifuga para tubos de 15ML, 14 microscopios, 6 Camara de Nuebauer, 5 Juegos de Micropipetas
MUESTRA:
Sangre venosa con anticoagulante EDTA (tubo morado)
INSTRUCCIONES:

ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

1. Se recogen 20 ml de sangre de la vena del paciente.
2. La sangre recolectada se transfiere a cuatro tubos de 7 ml
heparinizados (Total: 20 ml).
3. Se reunió toda la sangre de los tubos heparinizados en un tubo de tapa
azul de 50 ml.
4. Realizar una dilución 1: 1 de sangre entera con 1X PBS
5. Cuidadosamente subyacente 10 ml de histopaque-1077. Y 20 ml de
sangre diluida se transfiere a un tubo de 50 ml.
6. Centrifugar inmediatamente a 1800 rpm [700 g] durante 20 min en una
centrífuga de enfriamiento (4ºC).
7. Retire cuidadosamente el tubo de la centrífuga, observando las tres
capas: la parte superior es sobrenadante claro, el medio es líquido
opaco que contiene las PBMC, y el fondo es RBC.
8. Eliminar cuidadosamente y descartar el sobrenadante dentro de 15 ml de la capa opaca de las PBMC.
Rápidamente transfiera la capa de capa blanda de PBMC (alrededor de 5 ml) en un nuevo tubo de 50 ml.
9. Añadir 1x PBS a la suspensión de PBMC para obtener un volumen final de 45 ml. Mezclar bien y centrifugar a
1800 rpm durante 10 min en una centrífuga de enfriamiento (4 ° C).
10. Se vierte y se desecha el sobrenadante,
11. Conteo de linfocito en cámara de Neubaeur con una dilución de trypan Blue para verificar viabilidad celular
12. Opcional Resuspender el sedimento en 5 ml del medio de congelación (90% FBS + 10% D MSO filtro
esterilizado).
13. Opcional. Alícuota 1ml de suspensión celular por vial (vial criogénico). Almacenar a 80 ° C durante la noche.
Transferencia del día siguiente en el cryofreezer líquido del nitrógeno. opcional
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RESULTADOS OBTENIDOS:
Desarrolle el siguiente cuestionario:
1. Otra técnica de separación de linfocitos
2. Explique la centrifugación zonal y isopicnica
3. Medidas de bioseguridad en tomas de sangre en humanos y en animales, así como el transporte de
muestras.
4. Métodos de criogenización y medios usados para ese fin
Par que nos sirve hacer la diferenciación de células?? Con que otras sustancias o quimicos se realizan estos procesos
CONCLUSIONES:
Se extrajo los linfocitos y se congelaran para uso posterior como cuantificacion y viabilidad

RECOMENDACIONES:
Cuidado del manejo de muestras de sangre y su respectivo desecho biologico
Equilibrar bien los tubos den la centrifuga
No mezclar las fases despues de la centrifugación
FIRMAS

F: ……………………………………………. F: ………………………………………………. F: ……………………………………………………

Nombre: MARBEL TORRES,PHD Nombre: VALERIA OCHOA Nombre: Patricia Jiménez, PhD
COORDINADOR DE ÁREA DE COORDINADOR/JEFE DE LABORATORIO DE
DOCENTE RESPONSABLE CONOCIMIENTO DOCENCIA