Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Métodos de análisis

Docente responsable de la práctica:

Olguín Ruiz Gabriela Edith

Alumno:
López Portillo Felipe de Jesús

Práctica:
“Separación de una mezcla de azul de metileno y fluoresceína usando
cromatografía por adsorción”.

Grupo: 5QM2 Sección: 3

Fecha de entrega: 24 de abril, 2018.

Objetivos.
 Aplicara la técnica de cromatografía por adsorción para la separación de dos colorantes.
 Comprobara la separación con base en el perfil de elución

Resultados.

Para la obtención de los valores de absorbancia se leyeron en el espectrofotómetro todas las fracciones
obtenidas a 493 nm, empleando como blanco NaOH 0.01 N, pH 12 y a 668 nm con un blanco de agua destilada.

Tabla 1. Valores de absorbancia obtenidos para la separación de fluoresceína y azul de metileno

Volumen de elución (mL) A493 AC493 A468 AC468

3 0.002 0.052 -0.030 0.02

6 -0.009 0.041 0.643 0.693
9 0.100 0.15 1.977 2.027
12 -0.006 0.044 0.088 0.138
15 -0.039 0.011 -0.026 0.024
18 -0.015 0.035 -0.018 0.032
21 -0.029 0.021 -0.024 0.026
24 0.012 0.062 0.014 0.064
27 -0.042 0.008 -0.042 0.008
30 -0.002 0.048 -0.006 0.044
33 -0.019 0.031 -0.028 0.022
36 -0.007 0.043 0.023 0.073
39 -0.050 0 -0.050 0
42 -0.010 0.04 -0.019 0.031
45 0 0.05 0.033 0.083
48 -0.015 0.035 -0.021 0.029
51 -0.021 0.029 -0.029 0.021
54 -0.009 0.041 0.049 0.099
57 -0.013 0.037 -0.022 0.028
60 -0.023 0.027 -0.034 0.016
63 0.049 0.099 -0.019 0.031
66 0.409 0.459 -0.026 0.024
69 0.946 0.996 0.005 0.055
72 0.462 0.512 -0.031 0.019
75 0.292 0.342 -0.017 0.033
78 0.168 0.218 -0.031 0.019
81 0.025 0.075 -0.022 0.028
84 0 0.05 -0.005 0.045
87 0 0.05 -0.011 0.039
90 -0.033 0.017 -0.042 0.008
93 -0,021 0.029 -0.030 0.02
A: Absorbancia;
AC: Absorbancia corregida matemáticamente sumando cada una de las absorbancias obtenidas con la menor absorbancia negativa encontrada en la
tabla de resultados (0.050).
Figura 1. Perfil de elución de la mezcla de colorantes: La línea azul representa el perfil de elución de la
fluoresceína a A493 nm así mismo la línea naranja representa la elusión del azul de metileno a A668 nm.

2.5

1.5
Absorbancia

0.5

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
-0.5
Volumen de elucion (mL)

A493 nm A668 nm

Preguntas extras.
I. Especifique y defina los elementos del sistema cromatográfico para esta separación.

Soporte: Columna de vidrio y disco de lana de vidrio.

Fase móvil: Agua destilada (pH 5) y NaOH (pH 12).
Fase estacionaria: Alúmina acida (pH 5)
Muestra: Mezcla de colorantes; azul de metileno y fluoresceína.

II. Considerando las propiedades de solubilidad de los colorantes, indique qué modificaciones haría
para invertir el orden de la elusión.

En contraposición a los métodos comunes de adsorción, en fase reversa la fase estacionaria es no polar
(hidrofóbica) y la fase móvil es polar (hidrofílica). Esta inversión en las fases implica la inversión en el orden
de salida de los componentes de la muestra, es decir, aquéllas sustancias menos polares, serán más
retenidas que las polares.2
 III. Defina el termino adsorción y, empleando formulas, esquematice que fuerzas intermoleculares
participan en el proceso de separación de los solutos.

La adsorción indica una adherencia selectiva, con desorciones diferentes, para una sustancia entre la fase
sólida del adsorbente y la fase líquida del eluyente.

Imagen 1. Primera elución con agua destilada: La alúmina se encuentra con cargas negativas, por lo que es
retenida por la alúmina acida que tiene cargas positivas, el azul de metileno que tiene carga positiva eluye con
facilidad, pues las cargas similares son repelidas.

Imagen 2. Segunda elución con hidróxido de sodio: debido al pH alcalino fuerte, el exceso de aniones (a pH
de 12) desplaza por gradiente a la fluoresceína de la alúmina acida, ayudando a que la fluoresceína eluya con
mayor facilidad.
Discusión.
En la Tabla 1 se tuvo que hacer una modificación matemática ya que el blanco daba absorbancias mayores
que la muestra, por lo que hizo la corrección especificada en la misma tabla.
La habilidad de un soluto para ser adsorbido depende de su polarizabilidad (temporaria y permanente), y de su
capacidad para formar puentes hidrógeno. Los grupos más polares son los adsorbidos más fuertemente. En
general, el poder de ser adsorbido aumenta con el incremento de grupos funcionales unidos a la misma
molécula, La elección correcta de los solventes de elución, es vital para el éxito del proceso separativo.2 Por
lo tanto, es una condición general empezar el desarrollo de la columna con solventes de baja polaridad, para
luego aumentarla lentamente. Si el solvente es muy polar, será fuertemente adsorbido por los gránulos
de fase fija y el desplazamiento o desorción de los componentes adsorbidos será inmediato.2 Es por ello
que en la mezcla de los colorantes: azul de metileno (AM) y fluoresceína (FA), se empezó con el agua
destilada (pH de 5) para eludir fácilmente al azul de metileno debido a que por su polarizabilidad sus
cargas positivas repelen con facilidad a la alúmina acida por lo que eluye fácilmente, cuando se cambia
la fase móvil por hidróxido, el exceso de aniones (a pH de 12) desplaza por gradiente a la fluoresceína
que se encuentra “unida” a la alúmina acida. Así se pueden separar ambas moléculas (Imagen 1 y 2)
y observar sus perfiles de elución (Figura 1), donde la absorción máxima del AM es a 668 nm mientras
que la FA lo hace a 493 nm , sin embargo a 668 la FA también absorbe a dicha longitud de onda,
aunque, en menor proporción.

Conclusiones.

 Se aplicó la técnica de cromatografía por adsorción para la separación de dos colorantes.

 Se comprobó la separación con base en el perfil de elución

Bibliografía.

1. Scoog, D. West, D. (2015). Fundamentos de química analítica. México: Cengage Learning. Pág(s)
270-290.
2. Galagovsky, L. (2013). Química orgánica: fundamentos teórico-prácticos para el laboratorio. España:
REVERTE. Pág(s).100-110.
3. Klein, D. (2016). Química orgánica. México: Medica Panamericana. Pág(s).30-32.