ALZHEIMER Y

TRANSPORTADORES
DE MEMBRANA

Fisiología Molecular Animal

Profesora: Alba Martínez Burgos

Grado en Bioquímica

Universidad de Granada

Mónica Rodríguez Segura

Elvira Sánchez Alonso
Javier Sánchez Sánchez
ÍNDICE

1. ALZHEIMER COMO ENFERMEDAD

1.1. DEFINICIÓN DE ALZHEIMER

1.2. ENVEJECIMIENTO DE TEJIDO NERVIOSO
1.3. HIPÓTESIS
1.3.1. COLINÉRGICA
1.3.2. Β-AMILOIDE Y TAU
1.3.3.OTRAS CAUSAS
1.4. RECEPTORES NMDA
1.4.1. RELACIÓN DE LOS NMDA CON LA ENFERMEDAD DEL ALZHEIMER

2. POSIBLES MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO

2.1. METODOLÓGICO 1. “BLOKING THE INTERACTION BETWEEN EphB2 AND ADDLs BY A

SMALL PEPTIDE RESCUES IMPAIRED SYNAPTIC PLASTICITY AND MEMORY DEFICITS IN A
MOUESE MODEL OF ALZHEIMER´S DISEASE”.
2.2. METODOLÓGICO 2: “INVOLVEMENT OF GLUN2B SUBUNIT CONTAINING N-METHYL-D-
ASPARTATE (NMDA) RECEPTORS IN MEDIATING THE ACUTE AND CHRONIC
SYNAPTOTOXIC EFFECTS OF OLIGOMERIC AMYLOID-BETA (AΒ) IN MURINE MODELS OF
ALZHEIMER'S DISEASE (AD)”

3. CONCLUSIONES

4. BIBLIOGRAFÍA
 1. ALZHEIMER COMO ENFERMEDAD
1.1. Definición de Alzheimer

Es una patología que se caracteriza por la crónica y progresiva neurodegeneración. El origen no

está claro aún pero hay varias teorías para su causa.

La neurodegeneración observada implica sinaptotoxicidad temprana, pérdida de células

nerviosas (neuronas y neuroglia), acumulación de depósitos de β-amiloide extracelular y ovillos
de fibras retorcidas de una proteína, llamada Tau, que se acumula dentro de las células, gliosis
(respuesta de las células de la glía ante una lesión o trauma cerebral) y atrofia cerebral. En etapas
tempranas, el hipocampo y la corteza son afectadas, lo que se asocia con déficit en la cognición
y la memoria. El 80% de las neuronas del hipocampo mueren durante esta enfermedad.

Los cambios que se producen en el cerebro comienzan a nivel microscópico mucho antes de los
primeros síntomas de pérdida de memoria.

Se han identificado ciertos factores de riesgo que aumentan la probabilidad de desarrollar dicha
enfermedad, como son: la edad, que es el principal factor de riesgo (a partir de 65 años),
antecedentes familiares y la genética, lesiones graves en la cabeza e incluso puede estar
relacionado con demencia vascular.

En el Alzheimer podemos observar varias etapas en su desarrollo:

- Etapa temprana o leve: es posible que la persona funcione independientemente.

Pueden padecer: lagunas en la memoria, problemas para desarrollar tareas en entornos
sociales.
- Etapa moderada o intermedia: es la etapa más larga y puede durar varios años.
Requieren un nivel más alto de cuidados. Los síntomas son pérdida de memoria de la
historia personal, carácter alterado, confusión, cambios en la personalidad y en el
comportamiento.
- Etapa avanzada o severa: es la etapa final de la enfermedad. En ella las personas
pierden la capacidad de responder al entorno, controlar el movimiento, tienen dificultad
para comunicarse. Dependencia casi total.

1.2. Envejecimiento en el tejido nervioso

Uno de los mayores riesgos de las enfermedades neurodegenerativas es la edad, además de

otros factores como pueden ser los alimenticios o genéticos.

La morfología neuronal está caracterizada por la presencia de muchas dendritas, que son
extensiones citoplasmáticas cortas y por axones, extensiones citoplasmáticas largas. A nivel
celular, se ha propuesto que los microtúbulos formados por actina tienen un importante papel
en el envejecimiento ya que los nervios presentan una disminución de los microtúbulos
dependiente de la edad. La capacidad cognitiva está relacionada con el número de nervios y su
función. La explicación a esta disminución de microtúbulos con la edad puede ser debida a la
desregulación del calcio, las perturbaciones mitocondriales (donde se produce el glutamato) y
la disposición del citoesqueleto. También la hipótesis de Tau y β-amiloide, de la que hablaremos
en el siguiente apartado está asociada a dicha disminución.

Las dendritas muestran una regresión negativa con el aumento de la edad en muchas regiones
cerebrales. Los receptores de glutamato como el NMDA, del que ahora hablaremos
detenidamente, están entre las proteínas clave de membrana.
 1.3. Hipótesis

Existen varias hipótesis que intentan explicar las causas de esta enfermedad, estas son:

a) Hipótesis colinérgica
Esta hipótesis sugiere que el Alzheimer se debe a una reducción en la síntesis
del neurotransmisor acetilcolina por la acción de la colinesterasa.

b) b) Hipótesis β- amiloide y tau

El Alzheimer se caracteriza por la presencia de placas amiloides que son depósitos insolubles y
cuasicristalinos cuyo componente principal es péptido β- amiloide. Este péptido se produce por
la escisión enzimática de la proteína transmembrana (AP) por la secretasa. La β- amiloide se
libera continuamente de neuronas y células gliales al entorno extracelular donde, en bajas
concentraciones y posiblemente en forma monomérica, puede desempeñar un papel fisiológico.

Actualmente hay evidencias que indican que las formas solubles de las β- amiloides son los
principales responsables de la neurodegeneración y del deterioro de la sinapsis en la
enfermedad del Alzheimer.

Con respecto a tau, cabe decir que es una proteína que estabiliza los microtúbulos cuando es
fosforilada y por esa asociación se le denomina proteína asociada a microtúbulos. En el
Alzheimer, la tau debido a cambios químicos se hiperfosforila y entonces se une con otras hebras
tau creando ovillos de neurofibrillas y, de esta manera, desintegra el sistema de transporte de
la neurona.

c) Otras hipótesis

Hay otras hipótesis que tiene un menor impacto, como puede ser el papel del aluminio que se
asocia a varios procesos neurofisiológicos que provocan la degeneración que la caracteriza.
También puede estar relacionada con trastornos metabólicos sobre todo relacionados con la
hiperglucemia y la resistencia a la insulina.

1.4. RECEPTORES NMDA

El ácido glutámico (Glu) es uno de los neurotransmisores excitatorios del SNC. Se sintetiza en la
mitocondria de la neurona a partir de glucosa y varios precursores. El Glu después de sintetizarse
se libera hacia el citoplasma donde se acumula en vesículas. La propagación del impulso nervioso
promueve su liberación en la sinapsis a través de un mecanismo dependiente de la
concentración intracelular de Ca++, mediante un proceso de exocitosis. Los receptores Glu se
clasifican en dos tipos: los receptores metabotrópicos (mGluRs) que promueven la activación de
segundos mensajeros vía proteínas G, y los receptores ionotrópicos que están acoplados a un
canal iónico y su activación permite la entrada de diversos iones, principalmente Ca++, Na+, así
como la salida de K+.

Los receptores N-metil-D-aspartato o NMDA son receptores tipo ionotrópicos. Son heterómeros
constituidos por diferentes subunidades, las cuales le confieren al receptor diferentes
propiedades fisiológicas y farmacológicas. Las subunidades son:

 Una subunidad N1
 Cuatro subunidades diferentes N2 (N2A, B, C y D) todas codificadas por genes diferentes.
 Dos N3 (N3A y N3B).
Las subunidades se combinan para dar los receptores, normalmente siempre hay dos N1 y dos
N2, o una combinación de N2 y N3.

Cabe destacar la importancia de la subunidad N2B en la enfermedad del Alzheimer que está muy
relacionada con los β-amiloide. Esta relación será el tema de uno de nuestros artículos
metodológicos.

El receptor NMDA es una proteína muy compleja y tremendamente regulada. Su conductancia

al Ca2+ es notablemente alta y es quizás su característica más destacable. Otra característica
especial del receptor NMDA es que para que el canal se abra se necesita, además del glutamato,
la presencia de un co-agonista, la glicina.

Los receptores NMDA tienen un papel muy importante en la plasticidad neuronal, el aprendizaje
y la memoria.

1.4.1. Relación de los NMDA con la enfermedad del Alzheimer.

Diversos trabajos demuestran que los primeros eventos que ocurren en la patología de la EA es
una alteración de las sinapsis glutamatérgicas que se correlaciona con el deterioro cognitivo de
la enfermedad. Se ha demostrado que los receptores NMDA son disfuncionales en las primeras
etapas de la enfermedad. Estudios in vitro demostraron que los oligómeros de βA suprimen la
potenciación a largo plazo de los receptores. El receptor NMDA no solamente posee un papel
importante en la regulación de la actividad sináptica, sino que también participa en el
procesamiento de la proteína precursora amiloide (APP), afectando la liberación del péptido βA.

La acción de β- amiloide promueve la endocitosis de los receptores NMDA en las neuronas

corticales, esto permite que, en la EA, estas neuronas expresen un menor número de receptores
NMDA, lo que provoca una disminución de la transmisión del impulso nervioso en las neuronas
corticales. La desfosforilación de la subunidad N2B del receptor NMDA se correlaciona con la
endocitosis del receptor, estos datos indican la presencia de un nuevo mecanismo mediante el
cual el β-amiloide puede contribuir a la neuropatología de la enfermedad de Alzheimer,
originando una disfunción sináptica a través de inhibir la ubicación funcional los receptores
NMDA a nivel sináptico.

2. POSIBLES MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO

2.1. METODOLÓGICO 1. “BLOKING THE INTERACTION BETWEEN EphB2 AND ADDLs BY
A SMALL PEPTIDE RESCUES IMPAIRED SYNAPTIC PLASTICITY AND MEMORY
DEFICITS IN A MOUESE MODEL OF ALZHEIMER´S DISEASE”.

Este artículo metodológico tiene como objetivo principal producir un péptido que bloquee la
interacción entre EphB2 y ADDL con la finalidad de usarlo posteriormente como una terapia
contra la enfermedad del Alzheimer en humanos.

Antes de comenzar a explicar el artículo hay que definir a EphB2: es una quinasa la cual tiene un
dominio FN que va a dar mucho juego en el artículo, este en un estado de salud normal, fosforila
a la subunidad N2B de los receptores NMDA haciendo que estos se activen y pase el calcio o
sodio al citoplasma. En el Alzheimer, la β-amiloide interacciona con EphB2 y esta se degrada vía
proteosoma. Esto impide que se fosforile la subunidad N2B del NMDA y por tanto no entra Ca2+.
Métodos:

1) Animales utilizados: se utilizan ratones de dos tipos: ratones salvajes y ratones

modificados para expresar mayor cantidad de la proteína APP y de secretasas. Los
ratones salvajes se usan como control.
2) Drogas utilizadas: Se sintetizan 4 péptidos diferentes (Pep21, Pep25, Pep32 y Pep 63).
3) Construcción de un plásmido y purificación de proteína: Se construye un plásmido para
expresar EphB2. El ADNc de EphB2 se amplificó mediante la técnica de la PCR. Una vez
producida la proteína esta se purificó mediante la cromatografía de níquel y ácido
nitrilotriacético.
4) Coinmunoprecipitación: con la finalidad de ver la interacción entre EphB2 y LDDA.
Primero se determina la concentración de EphB2 con la técnica BCA en el hipocampo y
posteriormente se cultivan con LDDA y en un caso con Pep 63 y en otro sin él. También
se usa para ver la interacción entre EphB2 con N1. Los anticuerpos utilizados fueron
anti-EphB2.
5) Inmunocitoquímica e inmunofluorescencia cuantitativa: se realizaron en un cultivo de
hipocampo. Con ellas se pretende identificar a EphB2 y N2B. los anticuerpos utilizados
se unían al N-terminal de EphB2 o del N2B.
6) Western blot: con lo que se pretende identificar específicamente a estas proteína o
dominios EphB2, GluN1, GluN2A, GluN2B que se encuentran en el cultivo de hipocampo.
7) Laberinto de Morris es una prueba que se les hace a las ratas para ver los mecanismos
implicados en el aprendizaje espacial de estas.

Resultados:
La adición de LDDA reduce la expresión de Ephb2 y de receptores NMDA. Como se puede ver en
la imagen se produce un notable descenso de los niveles de EphB2 y de la subunidad N2B cuando
se ponen en contacto con los oligómeros β-amiloides.

Interacción de LDDA-EPhB2: caracterizamos la interacción entre EphB2 y LDDA mediante una

prueba de coinmunoprecipitación y se encontró que la LDDA se coinmunoprecipataban con el
EphB2, lo que podría significar que ambos interactúan entre sí.
Se descubrió el sitio de interacción de LDDA con EphB2 que es el dominio FN. Además, para
determinar qué residuos del dominio FN mediaban en la unión de LDDA, los LDDA se incubaron
con una membrana de celulosa que contenía una matriz de péptidos. El análisis de transferencia
de puntos mostró que hubo muchos puntos positivos. Los péptidos representados por estos
puntos se llamaron Pep21, Pep25, Pep32 y Pep63.

Interacción Pep63 interfiere con EphB2-LDDA: se

sintetizaron los cuatro candidatos Pep21, Pep25,
Pep32, Pep63 y se evaluó su capacidad para la
unión entre EphB2 y LDDA siendo el Pep63 el más
eficaz (como muestra la flecha roja), mejorando la
expresión de EphB2. Investigaron los impactos de
Pep63 en la activación de EphB2, pero los
resultados sugieren que no afecta a este
parámetro.

Se llevó a cabo una investigación del efecto neuroprotector del Pep63 contra el tratamiento con
LDDA, en la que se consiguió rescatar la disminución de GLUN2B y GLUN1 y también de GLUN2B
fosforilado. También se produjo un recate de la bajada de EphB2, inducida por LDDA y la
expresión sináptica de GluN2B. Los datos se muestran en la siguiente gráfica.

Se estudió si el bloqueo de la interacción entre EphB2 y LDDA revierte el déficit de aprendizaje

y memoria en los ratones transgénicos. Para ello se inyectó el Pep63 a distintas concentraciones
en el hipocampo de transgénicos y de los salvajes. Se les realizan varias pruebas entre ellas la
prueba del laberinto de Morris, en la que los resultados fueron muy positivos. Como se puede
ver en la imagen cuando el ratón tiene Pep63 su memoria se ve notablemente mejorada con
respecto a cuando no se inyecta el Pep63, donde el animal hace un mayor recorrido. Por lo que
se concluyó que el Pep63 puede mejorar la pérdida de memoria tanto en el hipocampo como
en la amígdala y que los efectos protectores dependen de la concentración (a mayor
concentración mayor eficacia).
Conclusión:

De este artículo se pueden extraer dos ideas principales:

 Los LDDA son capaces de unirse a EphB2 inactivándola y así producir una inactivación
del receptor NMDA.
 El Pep63 bloquea la interacción entre le EphB2 y LDDA y que puede ser una novedosa
terapia conta el Alzheimer porque mejora el déficit de memoria y la disfunción
cognitiva.

2.2. METODOLÓGICO 2: “INVOLVEMENT OF GLUN2B SUBUNIT CONTAINING N-METHYL-D-

ASPARTATE (NMDA) RECEPTORS IN MEDIATING THE ACUTE AND CHRONIC SYNAPTOTOXIC
EFFECTS OF OLIGOMERIC AMYLOID-BETA (AΒ) IN MURINE MODELS OF ALZHEIMER'S DISEASE
(AD)”

El objetivo de este estudio es determinar si la reducción permanente de las subunidades GluN2B

afecta a la enfermedad del Alzheimer en modelos animales transgénicos dobles
(hetgluN2B/mAPP). Para poder extrapolarlo a una posible futura terapia para el Alzheimer.

Métodos:

1) Animales utilizados: usamos cuatro tipos de ratones: unos con una mutación en APP
como modelo de Alzheimer, ratones salvajes como control, unos heterocigotos para
GluN2B y un doble mutante (hetGluN2B/mAPP).
2) Western blot: se usa para verificar la modificación genética en los ratones, observando
la cantidad de expresión de GluN2B.
3) ELISA: para comprobar la cantidad de β-amiloides 1-42 en los diferentes ratones.
4) VSDI: imagen basada en la sensibilidad al colorante del voltaje. Es usado para visualizar
la actividad eléctrica de las neuronas de los cuatro tipos de ratones.

Resultados:

Se utilizaron cuatro tipos de ratones: unos salvajes en los que los niveles de GluN2B y GluN2B
fosforilado no se modifican, otros herocigotos para GluN2B (se ha producido una deleción en el
gen GluN2B para disminuya su producción) en los que se aprecia una notable disminución de
GluN2B y GluN2B fosforilado. Otros que son ratones (mAPP) modificados para el aumento de la
producción de APP en los que se observa un aumento de la cantidad de β-A1,42 y la cantidad de
GLUN2B es despreciablemente menor que en los salvajes. Finalmente están los
hetGluN2B/mAPP en los que disminuye a más de la mitad la cantidad de GluUN2B. a nivel de
las otras subunidades de los receptores NMDA no se han modificado notablemente la cantidad.

Usaron la técnica de western blot para determinar la cantidad de estas subunidades, los
resultados son los que se muestran a continuación:

Utilizamos la técnica de VSDI para estudiar si hay alteraciones en la transmisión de la sinapsis en

los diferentes grupos de ratones.

En el control, la banda de color azul de 88 ms a 114 ms muestra la línea base seguida por el
estímulo en las células granulares y la progresión rápida de la señal hacia CA3 y CA1 marcados
por las líneas discontinuas blancas. En general, WT y ratones transgénicos tuvieron una
propagación de actividad similar de DG a CA1. Las diferencias son más visibles en ratones mAPP
y hetGluN2B / mAPP, con una disminución reducida de la transmisión al comienzo de CA3 en
comparación con los animales WT y hetGluN2B (flecha diagonal).

El diagrama de abajo muestra la grabación de longitud completa (88e1126ms). En los cortes del
hipocampo de animales mAPP actividad no volvió a niveles basales. Estos resultados son lógicos
porque, los ratones tenían muchos oligómeros β-amiloides que de forma indirecta inactivan a la
subunidad N2B que a su vez inactiva el receptor NMDA por lo el glutamato se mantiene en la
hendidura sináptica. En la mutación hetGluN2B / mAPP volvió a la actividad normal, porque
hay pocas subunidades de GluN2B por lo tanto pocos receptores NMDA inactivos y por lo tanto
el glutamato se difunde de la hendidura sináptica y las neuronas se relajan.
Conclusión:

La inducción de una disminución de GluN2B en los ratones transgénicos invierte los cambios
fisiopatológicos en la plasticidad sináptica del hipocampo de ratones con EA. Estos resultados
proporcionan más evidencia de la participación del sistema glutamatérgico en la patología del
Alzheimer y enfatizan la subunidad GluN2B como un objeto potencial para el tratamiento de
esta enfermedad.

3. CONCLUSIONES

En este trabajo hemos querido plasmar unas leves pinceladas sobre qué es la enfermedad del
Alzheimer y algunas de sus características. El tema principal del trabajo y sobre el que trata la
gran mayoría de este es el papel de los receptores NMDA en dicha enfermedad.

Con los artículos metodológicos y la revisión hemos visto que los receptores NMDA son muy
importantes para la plasticidad y sinapsis de las neuronas. Lo que le ocurre a estos receptores
en la enfermedad del Alzheimer es que la presencia de oligómeros β-amiloides, una de las
principales características de la enfermedad ya que se producen en grandes cantidades, produce
de forma indirecta la inactivación de los receptores. Dicha inactivación va a estar muy
relacionada con una de las subunidades de los receptores, N2B, la cual es uno de los ejes
centrales de ambos artículos metodológicos.

Los artículos metodológicos intentan buscar alguna solución a dicho fenómeno. En el primero
que tratamos utilizan un péptido sintetizado por ellos para solventar este problema, bloqueando
la interacción entre los β-amiloides y una quinasa que fosforila la subunidad N2B. En el segundo
artículo, se ve como una reducción en la expresión de dicha subunidad en los receptores puede
llegar a solventar este problema.

En nuestra opinión, el primer metodológico ha sido un más comprensible que el segundo debido
a que las técnicas utilizadas en este último eran nuevas para nosotros y se necesitaban
conocimientos superiores para entender algunos resultados y

El primer articulo metodológico contempla una terapia para el Alzheimer más prometedora que
el segundo, ya que los resultados del experimento son más notables.
4. BIBLIOGRAFÍA
- Jesús Avila, María Llorens-Martín et al. (2017) Cognitive Decline in Neuronal Aging and
Alzheimer’s Disease: Role of NMDA Receptors Associated Proteins. Frontiers in
Neuroscience

- Xiao-Dong Shi, Kai Sun et al. (2016) Blocking the Interaction between EphB2 and ADDL
by a Small Peptide Rescues Impaired Synaptic Plasticity and Memory Deficits in a Mouse
Modelo f Alzheimer’s Disease. The Journal of Neuroscience

- Gerhard Rammes, Corinn Mattusch et al. (2017) Involvement og GluN2B subunit

containing N-methyl- D- aspartate (NMDA) receptors in mediating the acute and chronic
synaptotoxic effects of oligomeric amyloid-beta (Aβ) in murine models of Alzheimer’s
disease (AD) Neuropharmacology.

- M.E. Flores-Soto, V. Chaparro-Huerta et al. (2011) Estructura y función de las

subunidades del receptor a glutamato tipo NMDA. Sociedad Española de Neurología.